Name: Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę rejestracji słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i całokomórkowego zacisku krosowego u szczurów po urodzeniu. Technika ta umożliwia badanie funkcjonalnego rozwoju zewnętrznych komórek rzęsatych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Programu 973 (2014CB943002) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (11534013, 31500841).

Wszystkie protokoły eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Południowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Przygotuj rozwiązania do eksperymentów
<ol>
	<li>Przygotuj środek znieczulający (patrz tabela materiałów): 1,5% pentobarbital sodu rozpuszczony w ddH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór preparacyjny (patrz tabela materiałów): Rozpuścić jedną torebkę proszku L-15 Leiboviza w 1 l ddH2O. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1 M NaOH. Dostosuj osmolarność do 300-330 mOsm za pomocą osmometru i 10 mM HEPES przed użyciem.</li>
	<li>Rozpuścić 2 mg/ml kolagenazy IV (patrz tabela materiałów) w roztworze preparacyjnym przygotowanym w kroku 1.2.</li>
	<li>Przygotować roztwory do barwienia immunologicznego (patrz tabela materiałów): Rozpuść 4% paraformaldehyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Rozcieńczyć 0,3% środek przepuszczalności w PBS. Rozcieńczyć 10% normalną surowicę kozią w PBS jako bufor blokujący. Rozcieńczyć przeciwciało prestyny w stosunku 1:200 w buforze blokującym. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z Alexa488 w stosunku 1:600 w buforze blokującym. Rozcieńczyć izotiocyjanian falloidyny-tetrametylorodaminy B w stosunku 1:200 w PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy (patrz Tabela Materiałów): Przygotować pożywkę L-15 Leiboviza zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2).</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Nagrywanie ABR
UWAGA: Zapis ABR został wcześniej szczegółowo opisany w naszym poprzednim badaniu9.
<ol>
	<li>Szczury Sprague Dawley (SD) (1-14-dniowe młode i 2-miesięczne dorosłe osobniki, obu płci) należy znieczulić pojedynczym wstrzyknięciem 1,5% pentobarbitalu sodu (22 mg/kg dla młodych i 30 mg/kg dla dorosłych, dootrzewnowo (i.p.)).</li>
	<li>Umieść znieczulone zwierzę w formie z pianki polietylenowej, aby unieruchomić ciało zwierzęcia. Umieść zwierzę na stole antywibracyjnym w pomieszczeniu tłumiącym dźwięk. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	<li>Przetrzyj obszar głowy 70% (vol/vol) etanolem. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj 1-2 mm nacięcie brzuszno-boczne do zewnętrznej małżowiny usznej, aby umieścić elektrodę odniesienia lub masę. Podskórna elektroda igłowa (elektroda rejestrująca) znajduje się nad wierzchołkiem czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Korzystając z generatora funkcyjnego, generuj skalibrowane impulsy tonów (narastanie/opadanie 1 ms, plateau 3 ms) o różnych częstotliwościach (2, 4, 8, 16, 24 i 32 kHz) i natężeniach (zmniejszone z 85 do 10 dB SPL w kroku 5 dB). Zmieniaj częstotliwość i amplitudę ręcznie lub za pomocą komputera. Dostarczaj bodźce dźwiękowe przez głośnik elektrostatyczny umieszczony w odległości 10 cm w kierunku głowy zwierzęcia.</li>
	<li>Filtruj (100-1,000 Hz), wzmacniaj i uśredniaj (256 razy) potencjał generowanego dźwięku za pomocą wielofunkcyjnego procesora, aby uzyskać ABR. Ślady ABR są monitorowane online i przechowywane do analizy w trybie offline. Wykonanie nagrania ABR z jednego zwierzęcia zajmuje około 40 minut. 
	UWAGA: Zazwyczaj można zidentyfikować od trzech do siedmiu szczytów (od fali I do fali VII) z opóźnieniami mniejszymi niż 15 ms (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Próg ABR definiuje się jako minimalny poziom dźwięku, przy którym można wykryć falę I i II.</li>
	<li>Poddaj się eutanazji, zanim zwierzęta obudzą się ze znieczulenia (z dootrzewnowym wstrzyknięciem 0,3 ml 1,5% pentobarbitalu sodu).</li>
</ol>
3. Sekcja narządów Cortiego (OC)
<ol>
	<li>Znieczulić szczenięta szczurów. W przypadku szczurów w wieku poniżej 6 dni (<P6) należy trzymać zwierzę w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i przykryć je lodem na 10 minut. W przypadku szczurów >P6 znieczulić zwierzę pojedynczym wstrzyknięciem 1,5% pentobarbitalu sodu (22 mg/kg, i.p.). Odetnij głowę szczeniętom szczura po znieczuleniu.</li>
	<li>Wysterylizuj głowę, spryskując ją etanolem o sprysku 70% (obj./obj.).</li>
	<li>Otwórz czaszkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej nożyczkami; usuń mózg, aby odsłonić ucho wewnętrzne.</li>
	<li>Przenieś ucho wewnętrzne na 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 3 ml lodowatego L-15 (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kostną torebkę ślimaka (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Rozpakuj OC i związane z nim prążki naczyniowe (SV) od modiolus.</li>
	<li>Trzymając podstawową część SV za pomocą kleszczy, całkowicie oddziel OC od SV, powoli rozwijając się od podstawy do wierzchołka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Pokrój OC równomiernie na trzy części, używając cienkich nożyczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl przenieść segmenty OC (krok 3.8) na szkiełko podstawowe i utrwalić 100 μl 4% paraformaldehydu przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Umyj tkankę, wypierając paraformaldehyd 100 μl świeżego PBS. Umyj chusteczkę trzy razy przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować tkankę z 0,3% środkiem przepuszczalności w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzucić środek przepuszczalności z PBS i przemyć tkankę trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Blok z 10% normalną surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem anty-prestyno-C-końcowym (1:200) w roztworze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyć trzy razy PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z Alexa488 (1:600) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj trzy razy PBS przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Inkubować z rodaminą-falloidyną (1:200) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj trzy razy PBS przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Montaż na szkiełku podstawowym z medium montażowym (zawierającym DAPI). Obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu laserów 405 nm, 488 nm i 594 nm. Ustaw moc lasera na 0,1-0,5 mW, a prędkość skanowania na 0,5 klatki/s.</li>
</ol>
5. Nagrywanie izolowanych OHC za pomocą zacisku krosowego
<ol>
	<li>Za pomocą ściągacza do pipet i mikrokucharki można przygotować pipety z końcówką o średnicy 2-3 μm. Uzupełnić pipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Zazwyczaj początkowy opór pipety punktowej wynosił 2,5-3,5 MΩ w roztworze kąpielowym.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl przenieś cząstkę OC (z kroku 3.8) na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Trawić tkankę za pomocą 100 μl pożywki do trawienia enzymatycznego (kolagenaza IV, patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyprzeć pożywkę do trawienia enzymatycznego 100 μl L-15. Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą mikroskalpela, aby wyizolować komórki rzęsate.</li>
	<li>Po delikatnym pipetowaniu przenieś komórki do domowej roboty małej plastikowej komory (średnica ~ 1,5 cm) wypełnionej roztworem do kąpieli bez enzymów (~ 1,5 ml, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść komorę na stoliku mikroskopu odwróconego. Znajdź zdrowo wyglądające samotne OHC.</li>
	<li>Załaduj pipetę krosową do stopnia głównego wzmacniacza 700B. Ostrożnie przesuń pipetę z plastrem za pomocą mikromanipulatora i umieść ją wokół dolnej części zewnętrznej komórki włosowatej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Łatka na całe komórki zaciska OHC, uszczelniając boczną ścianę korpusu komórki. Zastosuj lekkie ssanie, aż błona komórkowa zostanie pęknięta. Ustaw potencjał podtrzymania na -70 mV. Ogniwa o rezystancji dostępu wahały się od 10 do 17 MΩ, a rezystancja błony wahała się od 100 do 500 MΩ i są uważane za udaną konfigurację całych komórek.</li>
	<li>Za pomocą sterowania komputerowego zastosuj napięcie hiperpolaryzacyjne i depolaryzacyjne (czas trwania 250 ms i zakres od -140 do +94 mV w krokach co 13 mV) do ogniwa, aby wywołać prądy dla całego ogniwa.</li>
	<li>Wzmocnij prądy całego ogniwa, przefiltruj (częstotliwość narożna 5 kHz) za pomocą wzmacniacza 700B. Przekonwertuj dane za pomocą konwertera 1440A i zapisz je do analizy w trybie offline.</li>
	<li>Zmierz pojemność membrany OHC za pomocą protokołu dwufalowego bodźca napięciowego kontrolowanego przez oprogramowanie do zacisków krosowych. Ustaw zakres napięcia stymulacji od -140 do 110 mV. Przechowywanie danych do analizy w trybie offline.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

U szczurów w wieku poniżej 11 dnia nie zaobserwowano potencjału czynnościowego w odpowiedzi na stymulację dźwiękiem w korze słuchowej 6,7. W związku z tym 11. dzień po porodzie określa się mianem "początku słuchu"10. Rozwój funkcji słuchu przed wystąpieniem słuchu nie został jeszcze dobrze zbadany. Stosując podobną metodę do rejestracji dorosłych osobników ABR, wykazujemy, że ABR mogą być wywołane przez czysty impuls tonalny od młodych szc...

Dwie odrębne funkcje czuciowych komórek rzęsatych ślimaka są niezbędne dla słuchu ssaków: transdukcja mechanoelektryczna (MET) i elektromotoryka1,2. Poprzez kanały MET zlokalizowane w pęczku włosa, IHC (IHC) i OHC przekształcają wibracje dźwiękowe w zmiany potencjału błonowego, a także sygnały elektryczne unerwionych neuronów zwoju spiralnego. OHC zmieniają długość komórek wraz z potencjałem błonowym i wzmacniają wibracje dźwięku o niskim natężeniu. Ta aktywność określana jako elektromotoryka jest uzyskiwana przez białko motoryczne prestyny znajdujące się w bocznej ścianie OHCs3.
U wielu gatunków, w tym gryzoni, funkcja słuchu jest niedojrzała we wczesnej epoce postnatalnej4,5. Nie można było wykryć potencjału czynnościowego w odpowiedzi na sygnały dźwiękowe w korze słuchowej przed wystąpieniem słuchu6,7. Rozwój morfologii i funkcji ślimaka był szeroko badany u myszy, myszoskoczka i szczura4,5,8. Mechanotransdukcja i elektromotoryka komórek rzęsatych są również rozwijane we wczesnej epoce życia5.
Aby ocenić wrażliwość słuchową szczurów w różnym wieku postnatalnym, opracowaliśmy metodę rejestracji słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) u młodych szczurów. Patch clamp do całych komórek jest idealną technologią do elektrofizjologicznego badania OHC. Jednak w porównaniu z zaciskiem łatkowym wykonywanym w neuronach i innych komórkach nabłonkowych, niski wskaźnik uszczelniania całych komórek ograniczał badanie elektroruchliwości izolowanych OHC.
Tutaj opisujemy procedurę morfologicznego i elektrofizjologicznego badania OHC w ślimaku ostro dysocjacyjnym od szczurów po urodzeniu. Metoda ta może być modyfikowana w celu zbadania mechanizmów molekularnych, które regulują rozwój i funkcję wewnętrznych komórek rzęsatych.

<table><tbody><tr><td><silny>znieczulający</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5% w wodzie</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Roztwór preparacyjny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 opakowanie w 1 L wody</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/ml w L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Roztwory do barwienia immunologicznego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7,3</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% w PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0,3% w PBS</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% w PBS</td></tr><tr><td>przeciwciało prestyny</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian falloidyny-tetrametylorodaminy B</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 opakowanie w 1 L wody</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Roztwór wewnątrzkomórkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140</td></tr><tr><td>mM MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometr</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>Pęseta Dumont</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini system operacyjny</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych o niskim poziomie szumów</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 głośnik</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System TDT 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP</td><td>Oprogramowanie Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD szczur</td><td>Centrum Zwierząt Doświadczalnych Południowego Uniwersytetu</td><td></td><td></td> Medycznego</tr></tbody></table>

rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Zewnętrzna komórka rzęsata jest jednym z dwóch typów czuciowych komórek rzęsatych w ślimaku ssaków. Zmieniają one długość komórek za pomocą potencjału receptora, aby wzmocnić słabe wibracje sygnału dźwiękowego o niskim poziomie. Morfologia i właściwości elektrofizjologiczne zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC) rozwijają się we wczesnym wieku postnatalnym. Dojrzewanie zewnętrznej komórki rzęsatej może przyczyniać się do rozwoju układu słuchowego. Jednak proces powstawania OHC nie jest dobrze zbadany. Wynika to częściowo z trudności w zmierzeniu ich funkcji za pomocą podejścia elektrofizjologicznego. W celu opracowania prostej metody rozwiązania powyższego problemu, tutaj opisujemy krok po kroku protokół badania funkcji OHC w ślimaku z ostrą dysocjacją od szczurów po urodzeniu. Dzięki tej metodzie możemy ocenić reakcję ślimaka na bodźce czysto tonalne oraz zbadać poziom ekspresji i funkcję białka motorycznego prestyny w OHC. Metoda ta może być również stosowana do badania wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC).

ABR można wywołać u znieczulonych szczątów szczurzych starszych niż 7. dzień po urodzeniu (P7), stosując impulsy czystego tonu (Rycina 1A). Jak pokazano na Rycynie 1B, przebiegi ABR uzyskane od szczątów szczurzych wykazały jedynie trzy do czterech wyraźnych fal o niewielkiej amplitudzie. Zazwyczaj w przebiegach ABR zwierząt dorosłych obserwuje się do siedmiu szczytów (Rycina 1B).
<p class="jove_c...

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Ogólnym celem tego testu elektrofizjologicznego jest zbadanie zmian morfologicznych i funkcjonalnych komórek rzęsatych ślimaka podczas rozwoju pourodzeniowego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie asystentury słuchowej, takie jak: kiedy nasze komórki rzęsate zyskują swoje funkcje na początku słyszenia? Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie ocenić funkcję poszczególnych komórek rzęsatych, wyizolowanych od pourodzeniowych młodych szczurów.Procedurę zademonstrują Wenlu Pan, Shasha Guo i Nana Xu, którzy byli studentami z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczulone zwierzę w formie z pianki polietylenowej, aby unieruchomić ciało zwierzęcia. Następnie umieść zwierzę na stole antywibracyjnym w pomieszczeniu tłumiącym dźwięk.Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5 stopnia Celsjusza za pomocą poduszki grzewczej. Następnie przetrzyj obszar głowy 70% etanolem. Wykonaj nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów brzuszno-bocznie do zewnętrznej małżowiny usznej, aby umieścić elektrodę odniesienia lub elektrodę uziemiającą.Następnie umieść podskórną elektrodę rejestrującą na wierzchołku czaszki. Za pomocą generatora funkcyjnego można generować skalibrowane impulsy tonów o różnych częstotliwościach i intensywnościach. Dostarczaj bodźce dźwiękowe przez głośnik elektrostatyczny znajdujący się w odległości 10 centymetrów od głowy zwierzęcia.Aby uzyskać odpowiedzi słuchowe pnia mózgu, potencjały wywołane dźwiękiem są filtrowane, wzmacniane i uśredniane za pomocą procesora wielofunkcyjnego. 40-minutowe nagranie ABR jest monitorowane online i przechowywane do analizy w trybie offline. W tej sekcji wysterylizuj głowę zwierzęcia, spryskując ją 70% etanolem.Następnie otwórz czaszkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej nożyczkami i usuń mózg, aby odsłonić ucho wewnętrzne. Następnie przenieś ucho wewnętrzne do 35-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej trzema mililitrami lodowatego podłoża L-15 firmy Leibovitz. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kostną torebkę ślimaka.Następnie rozpakuj OC i SV powiązane z modiolus. Trzymając podstawową część SV za pomocą kleszczy, całkowicie oddziel OC od SV, powoli rozwijając się od podstawy do wierzchołka. Następnie pokrój OC równomiernie na trzy części za pomocą cienkich nożyczek.Wszystkie czynności należy wykonywać w lodowatym L-15 tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować degradację i degradację tkanek. Na tym etapie, za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, przenieś segmenty OC na szklane szkiełko. Utrwal je za pomocą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez co najmniej cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza.Następnie umyj tkankę, wypierając paraformaldehyd 100 mikrolitrami świeżego PBS. Następnie umyj chusteczkę trzy razy przez 10 minut za każdym razem. Następnie inkubować tkankę z 0,3% środkiem przepuszczalności w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po 30 minutach wyrzuć środek przepuszczalny i przemyj tkankę trzykrotnie PBS. Następnie zablokuj tkankę 10% normalną surowicą kozią i PBS na godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować tkankę z przeciwciałem przeciw prestynie C i roztworem blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc.Następnie przemyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut za każdym razem. Następnie inkubuj tkankę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Alexa 488 w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut, za każdym razem w ciemności.Następnie inkubuj tkankę z falloidyną rodaminy przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut w ciemności. Następnie zamontuj próbkę na szkiełku podstawowym z medium montażowym.Wyobraź to sobie za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu laserów 405 nanometrów, 488 nanometrów i 594 nanometrów. W tej procedurze użyj ściągacza do pipet i mikrofałszerza. Wykonaj pipety z plastrami o średnicy końcówki od dwóch do trzech mikronów.Następnie wypełnij pipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś kawałek OC na 35-milimetrową szalkę Petriego. Trawić tkankę za pomocą 100 mikrolitrów pożywki do trawienia enzymatycznego przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie wypier pożywkę do trawienia enzymatycznego ze 100 mikrolitrami L-15. Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą mikroskalpela, aby wyizolować komórki rzęsate. Po delikatnym pipetowaniu przenieś komórki do domowej roboty małej plastikowej komory wypełnionej roztworem do kąpieli bez enzymów.Następnie umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu i znajdź zdrowo wyglądające samotne OHC. Następnie załaduj pipetę krosową do stopnia głównego wzmacniacza 700B. Umieścić pipetę z plastrem wokół dna zewnętrznej komórki włosa.Następnie łatka na całe komórki zaciska OHC, uszczelniając boczną ścianę korpusu komórki. Zastosuj lekkie ssanie, aż błona komórkowa zostanie pęknięta. Następnie ustaw potencjał trzymania na 70 miliwoltów.Ogniwa o rezystancji dostępu w zakresie od 10 do 17 megaomów i rezystancji membrany w zakresie od 100 do 500 megaomów są uważane za udaną konfigurację całych ogniw. Zastosuj napięcie hiperpolaryzujące i depolaryzujące do ogniwa, aby wywołać prądy w całym ogniwie. Zmierz pojemność membrany OHC za pomocą protokołu dwufalowego bodźca napięciowego kontrolowanego przez oprogramowanie patch clamp.Ustaw zakres napięcia stymulacji od 140 do 110 miliwoltów i przechowuj dane do analizy offline. Po delikatnym trawieniu OHC wyizolowano z OC. Zapisy cęgów napięcia całych komórek wykonano z OHC ostro wyizolowanych ze ślimaka szczura. Reprezentatywny przykład prądu całego ogniwa zarejestrowanego z izolowanego OHC P9 w odpowiedzi na zmianę potencjału błony ze 140 na 107 miliwoltów pokazano tutaj.Rysunek ten przedstawia nieliniową pojemność membrany uzyskaną z dwóch OHC w różnym wieku. Pojemnościowe odpowiedzi napięciowe zostały dopasowane do funkcji Boltzmanna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak Western blotting i PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena poziomu ekspresji niektórych białek, takich jak prestyna w naszych komórkach rzęsatych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami rzęsatymi do zbadania właściwości elektrofizjologicznych ślimaka i układu przedsionkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać morfologiczne i funkcjonalne zmiany w komórkach rzęsatych ślimaka podczas rozwoju poporodowego.

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Ten film demonstruje metodę rejestrowania słuchowych reakcji pnia mózgu (ABR) u szczurzych szczeniąt. Przedstawiono w nim etapy umieszczania elektrod, stosowania bodźców dźwiękowych i analizy przetwarzania sygnału w pniu mózgu w celu oceny odpowiedzi neuronalnych.

Rejestrowanie słuchowych reakcji pnia mózgu u szczeniaka szczura

Ten film pokazuje procedurę wszczepienia urządzenia ślimakowego ogłuszonej myszy i zastosowania bodźców elektrycznych do rejestrowania słuchowych reakcji pnia mózgu. Procedura ta umożliwia zrozumienie podstawowych mechanizmów elektrycznego słyszenia i może przyczynić się do postępu w technologii implantów ślimakowych i neurobiologii słuchowej.

Rejestrowanie wywołanych elektrycznie reakcji słuchowych pnia mózgu u głuchej myszy

Ten film demonstruje technikę patch-clamp do pomiaru prądów jonowych w ciałach komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie i użycie polerowanej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wewnętrznym roztworem zawierającym amfoterycynę B, która perforuje błonę, aby umożliwić ruch jonów przy jednoczesnym zachowaniu warunków wewnątrzkomórkowych. Impulsy napięciowe są stosowane do wyzwalania i rejestrowania aktywności kanałów jonowych, zapewniając wgląd w ich...

Perforowane nagrania patch-clamp ciał komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Prezentujemy technikę miejscowego podawania leków drogą przezbębenkową do ślimaka. Podawanie leków tą drogą nie kolidowałoby ze skutecznością przeciwnowotworową leków stosowanych w chemioterapeutykach, takich jak cisplatyna.

Podawanie leków przezbębenkowych w leczeniu ototoksyczności

Audiometria odpowiedzi wywołanej pniem mózgu jest ważnym narzędziem w neurofizjologii klinicznej. Obecnie audiometria odpowiedzi wywołanej pnia mózgu jest również stosowana w naukach podstawowych i badaniach przedklinicznych obejmujących zarówno farmakologiczne, jak i genetyczne modele zwierzęce. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób słuchowe reakcje pnia mózgu mogą być z powodzeniem rejestrowane i analizowane u myszy.

Akwizycja i analiza danych w audiometrii odpowiedzi wywołanej pniem mózgu u myszy

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Poznaj metodę rejestracji słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i całokomórkowego zacisku krosowego u szczurów po urodzeniu. Technika ta umożliwia badanie funkcjonalnego rozwoju zewnętrznych komórek rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Przeglądaj więcej filmów