Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Ogólnym celem tego testu elektrofizjologicznego jest zbadanie zmian morfologicznych i funkcjonalnych komórek rzęsatych ślimaka podczas rozwoju pourodzeniowego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie asystentury słuchowej, takie jak: kiedy nasze komórki rzęsate zyskują swoje funkcje na początku słyszenia? Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie ocenić funkcję poszczególnych komórek rzęsatych, wyizolowanych od pourodzeniowych młodych szczurów.

Procedurę zademonstrują Wenlu Pan, Shasha Guo i Nana Xu, którzy byli studentami z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczulone zwierzę w formie z pianki polietylenowej, aby unieruchomić ciało zwierzęcia. Następnie umieść zwierzę na stole antywibracyjnym w pomieszczeniu tłumiącym dźwięk

Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5 stopnia Celsjusza za pomocą poduszki grzewczej. Następnie przetrzyj obszar głowy 70% etanolem. Wykonaj nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów brzuszno-bocznie do zewnętrznej małżowiny usznej, aby umieścić elektrodę odniesienia lub elektrodę uziemiającą.

Następnie umieść podskórną elektrodę rejestrującą na wierzchołku czaszki. Za pomocą generatora funkcyjnego można generować skalibrowane impulsy tonów o różnych częstotliwościach i intensywnościach. Dostarczaj bodźce dźwiękowe przez głośnik elektrostatyczny znajdujący się w odległości 10 centymetrów od głowy zwierzęcia.

Aby uzyskać odpowiedzi słuchowe pnia mózgu, potencjały wywołane dźwiękiem są filtrowane, wzmacniane i uśredniane za pomocą procesora wielofunkcyjnego. 40-minutowe nagranie ABR jest monitorowane online i przechowywane do analizy w trybie offline. W tej sekcji wysterylizuj głowę zwierzęcia, spryskując ją 70% etanolem.

Następnie otwórz czaszkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej nożyczkami i usuń mózg, aby odsłonić ucho wewnętrzne. Następnie przenieś ucho wewnętrzne do 35-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej trzema mililitrami lodowatego podłoża L-15 firmy Leibovitz. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kostną torebkę ślimaka.

Następnie rozpakuj OC i SV powiązane z modiolus. Trzymając podstawową część SV za pomocą kleszczy, całkowicie oddziel OC od SV, powoli rozwijając się od podstawy do wierzchołka. Następnie pokrój OC równomiernie na trzy części za pomocą cienkich nożyczek.

Wszystkie czynności należy wykonywać w lodowatym L-15 tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować degradację i degradację tkanek. Na tym etapie, za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, przenieś segmenty OC na szklane szkiełko. Utrwal je za pomocą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez co najmniej cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie umyj tkankę, wypierając paraformaldehyd 100 mikrolitrami świeżego PBS. Następnie umyj chusteczkę trzy razy przez 10 minut za każdym razem. Następnie inkubować tkankę z 0,3% środkiem przepuszczalności w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach wyrzuć środek przepuszczalny i przemyj tkankę trzykrotnie PBS. Następnie zablokuj tkankę 10% normalną surowicą kozią i PBS na godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować tkankę z przeciwciałem przeciw prestynie C i roztworem blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc.

Następnie przemyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut za każdym razem. Następnie inkubuj tkankę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Alexa 488 w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut, za każdym razem w ciemności.

Następnie inkubuj tkankę z falloidyną rodaminy przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj chusteczkę trzy razy PBS przez pięć minut w ciemności. Następnie zamontuj próbkę na szkiełku podstawowym z medium montażowym.

Wyobraź to sobie za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu laserów 405 nanometrów, 488 nanometrów i 594 nanometrów. W tej procedurze użyj ściągacza do pipet i mikrofałszerza. Wykonaj pipety z plastrami o średnicy końcówki od dwóch do trzech mikronów.

Następnie wypełnij pipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś kawałek OC na 35-milimetrową szalkę Petriego. Trawić tkankę za pomocą 100 mikrolitrów pożywki do trawienia enzymatycznego przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie wypier pożywkę do trawienia enzymatycznego ze 100 mikrolitrami L-15. Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą mikroskalpela, aby wyizolować komórki rzęsate. Po delikatnym pipetowaniu przenieś komórki do domowej roboty małej plastikowej komory wypełnionej roztworem do kąpieli bez enzymów.

Następnie umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu i znajdź zdrowo wyglądające samotne OHC. Następnie załaduj pipetę krosową do stopnia głównego wzmacniacza 700B. Umieścić pipetę z plastrem wokół dna zewnętrznej komórki włosa.

Następnie łatka na całe komórki zaciska OHC, uszczelniając boczną ścianę korpusu komórki. Zastosuj lekkie ssanie, aż błona komórkowa zostanie pęknięta. Następnie ustaw potencjał trzymania na 70 miliwoltów.

Ogniwa o rezystancji dostępu w zakresie od 10 do 17 megaomów i rezystancji membrany w zakresie od 100 do 500 megaomów są uważane za udaną konfigurację całych ogniw. Zastosuj napięcie hiperpolaryzujące i depolaryzujące do ogniwa, aby wywołać prądy w całym ogniwie. Zmierz pojemność membrany OHC za pomocą protokołu dwufalowego bodźca napięciowego kontrolowanego przez oprogramowanie patch clamp.

Ustaw zakres napięcia stymulacji od 140 do 110 miliwoltów i przechowuj dane do analizy offline. Po delikatnym trawieniu OHC wyizolowano z OC. Zapisy cęgów napięcia całych komórek wykonano z OHC ostro wyizolowanych ze ślimaka szczura. Reprezentatywny przykład prądu całego ogniwa zarejestrowanego z izolowanego OHC P9 w odpowiedzi na zmianę potencjału błony ze 140 na 107 miliwoltów pokazano tutaj.

Rysunek ten przedstawia nieliniową pojemność membrany uzyskaną z dwóch OHC w różnym wieku. Pojemnościowe odpowiedzi napięciowe zostały dopasowane do funkcji Boltzmanna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak Western blotting i PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena poziomu ekspresji niektórych białek, takich jak prestyna w naszych komórkach rzęsatych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami rzęsatymi do zbadania właściwości elektrofizjologicznych ślimaka i układu przedsionkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać morfologiczne i funkcjonalne zmiany w komórkach rzęsatych ślimaka podczas rozwoju poporodowego.