Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Weźmy unieruchomione zwoje korzenia grzbietowego szczura lub DRG w komorze rejestracyjnej wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym.

DRG zawiera neurony czuciowe otoczone satelitarnymi komórkami glejowymi.

Zastosuj dodatnie ciśnienie do pipety z plastrem wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym i podłączonej do wzmacniacza, a następnie przesuń ją w kierunku docelowego neuronu.

Dodatnie ciśnienie pomaga przejść przez otaczającą warstwę komórek glejowych satelitarnych i skontaktować się z neuronem, tworząc wgłębienie w jego błonie.

Zastosuj podciśnienie, aby uzyskać szczelne uszczelnienie z membraną.

Następnie zastosuj impulsy podciśnienia, aby ustalić konfigurację całego ogniwa. Skalibruj parametry wzmacniacza, aby uzyskać dokładne pomiary sygnału.

Aby określić pobudliwość neuronu, zastosuj krótkie prądy przyrostowe do neuronu, otwierając kanały jonowe bramkowane napięciem i wyzwalając potencjał czynnościowy.

Zmierz reozasadę, minimalny prąd potrzebny do wyzwolenia potencjału czynnościowego.

Ponadto należy zastosować prąd narastający, aby zmierzyć minimalny potencjał błony, przy którym występuje potencjał czynnościowy.

W tej procedurze umieść roztwór elektrody na lodzie, aby zapobiec degradacji. Następnie napełnij szklaną pipetę z plastrem przefiltrowanym roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść pipetę w uchwycie na pipety stopnia głównego.

Delikatnie wycisnąć pipetę za pomocą strzykawki o pojemności 5 mililitrów, przesuwając tłok o około 1 mililitr przed opuszczeniem pipety do roztworu do kąpieli. Następnie wybierz tryb V-clamp we wzmacniaczu i otwórz interfejs testu membrany w oprogramowaniu.

Pod mikroskopem przesuń pipetę bliżej docelowego neuronu. Następnie zastosuj dodatnie ciśnienie z pipety, aby przejść przez satelitarną warstwę komórek glejowych, aż do zaobserwowania nagłego powiększenia przestrzeni między neuronem a otaczającą warstwą satelitarnych komórek glejowych. Następnie przesuwaj pipetę w kierunku neuronu, aż zaobserwuje się wgłębienie w neuronie.

W naszym preparacie neurony są otoczone satelitarnymi komórkami glejowymi. Dlatego, aby przeniknąć do warstw komórek glejowych i dotrzeć do poszczególnych neuronów, pipeta rejestrująca jest utrzymywana pod wysokim dodatnim ciśnieniem.

Następnie zmniejsz nadciśnienie. Osiągnij uszczelnienie gigaomowe z delikatnym ssaniem.

Aby uzyskać konfigurację zapisu całej komórki, należy przeniknąć przez błonę komórkową neuronu poprzez krótkie, ale silne ssanie.

Alternatywnie, użyj funkcji zap na amplifier, gdy stosowane jest ssanie.

Po ustaleniu trybu całego ogniwa skompensuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową, obracając pokrętła kompensacji pojemności i rezystancji na wzmacniaczu. Następnie zamknij okno testu membrany. Wybierz I-clamp tryb normalny, obracając pokrętło trybu na amplifier.

Następnie kliknij Otwórz protokół w oprogramowaniu. Wybierz i załaduj protokół pomiaru reobazy, a następnie kliknij przycisk Nagraj, aby rozpocząć nagrywanie. Aby zbadać pobudliwość neuronów, zmierz rezystancję wejściową i reozasadę, wstrzykując stopniowaną serię prądów depolaryzujących w krokach co 100 pikoamperów.