Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości
February 16th, 2018
Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.
Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie populacji mikrogleju o wysokiej czystości od gryzoni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroinformacji, takie jak identyfikacja właściwości immunomodulacyjnych komórek macierzystych w mikrogleju lub przeprowadzanie testów przesiewowych leków. Główną zaletą tej techniki jest izolacja populacji mikrogleju o wysokiej czystości bez konieczności długotrwałego przebywania w hodowli.
Aby rozpocząć tę procedurę, włóż końcówki nożyczek przez otwór w kanale kręgowym i wykonaj boczne nacięcia w przewodzie słuchowym. Następnie delikatnie przesuń tkankę w kierunku mównicy, aby odsłonić czaszkę. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku bregmy.
Następnie włóż końcówkę nożyczek do bregmy i wykonaj boczne nacięcia. Następnie delikatnie oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg. Za pomocą zakrzywionych kleszczy wyjmij go i przenieś do sterylnego pojemnika o pojemności pięciu mililitrów.
Umyj go dwa do trzech razy pięcioma mililitrami lodowatego środka myjącego na pranie, aby usunąć krew. W okapie z laminarnym przepływem powietrza umieść zawartość pięciomililitrowego pojemnika na małej szalce Petriego spoczywającej na lodzie. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela lub sterylnych nożyczek usuń móżdżek i opuszkę węchową.
Następnie wykonaj cięcie w linii środkowej, aby oddzielić dwie półkule. Następnie zidentyfikuj warstwę opon mózgowych jako bardzo cienką warstwę komórek z czerwonym odcieniem na powierzchni mózgu z widocznymi naczyniami krwionośnymi. Ostrożnie oderwij warstwę opony mózgowej cienkimi kleszczami, uważając, aby nie uszkodzić kory mózgowej.
Jeśli warstwa opony mózgowej pęknie, kontynuuj odklejanie podartych fragmentów, aż zostanie całkowicie usunięta. Następnie przenieś półkule na nową małą szalkę Petriego na lodzie i napełnij ją środkiem myjącym. Pokrój mózg na małe kawałki sterylnym ostrzem skalpela.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów papainy i 150 mikrolitrów DNazy1 do pożywki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po strawieniu należy roztarć tkankę za pomocą pipety P1000. Jeśli kawałki tkanki są zbyt duże, aby dostać się do pipety, rozważ użycie sterylnych nożyczek w celu poszerzenia końcówki pipety.
Podczas tego procesu należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do podłoża, ponieważ może to zmniejszyć żywotność komórek. W okapie z przepływem laminarnym przygotuj 50-mililitrową stożkową rurkę z sitkiem o średnicy 100 mikrometrów. Wlej pożywkę trawiącą i kawałki mózgu na sitko.
Przepchnij kawałki mózgu za pomocą tłoka sterylnej trzymililitrowej strzykawki ruchem mielącym, aż nie będzie już widać tkanki. Przez cały czas trwania tego procesu należy stale myć filtr za pomocą środka myjącego. Spowoduje to przepłukanie wszelkich komórek uwięzionych w sitku.
Następnie odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj podstawowy izotoniczny Percoll, dodając stosunek dziewięciu do jednego podłoża o gradiencie gęstości do 10X sterylnego HBSS. Przygotuj gradienty jako 30% SIP w DMEM i 70% SIP w jednym X HBSS.
Na przykład, aby przygotować 10 mililitrów 30% SIP, dodaj trzy mililitry SIP do siedmiu mililitrów DMEM. Następnie odessać supernatant z rurki stożkowej i ponownie zawiesić osad komórkowy z ośmioma mililitrami 30% SIP w DMEM. Przenieś całą objętość do świeżej 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Następnie umieść roztwór 70% SIP, napełniając pipetę transferową 70% SIP i ostrożnie przepchnij pipetę transferową na dno stożkowej rurki. Gdy końcówka znajdzie się blisko dna, delikatnie przepchnij zawartość przez pipetę transferową. Następnie odwirować warstwy SIP, w tym komórki, przy sile 650 G z zerem hamulca i czwartym przyspieszeniem przez 25 minut w temperaturze pokojowej.
Warstwa 70% Percoll musi być podszyta z dużą starannością. Zakłócenie tego interfejsu może poważnie wpłynąć na uwięzienie mikrogleju w warstwie komórkowej i poważnie zmniejszyć wydajność. Następnie odessaj cztery mililitry pożywki z resztkami komórkowymi z górnej części probówki, aby ułatwić usunięcie komórek jednojądrzastych w następnym kroku.
Następnie ostrożnie opuść końcówkę pipety w kierunku granicy faz i odizoluj komórki jednojądrzaste od granicy faz pożywki o gradiencie gęstości 30/70. Zbierz około trzech mililitrów z mętnego interfejsu i przenieś je do nowej 15-mililitrowej stożkowej rurki. Następnie rozcieńczyć mieszaninę dziewięcioma mililitrami HBSS, aby ułatwić usunięcie pożywki o gradiencie gęstości.
Odwirować rozcieńczoną pożywkę o gradiencie gęstości zawierającą komórki jednojądrzaste o stężeniu 500 G przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić go jednym mililitrem pożywki wzrostowej. Następnie ponownie zawieszone komórki wybarwić błękitem trypanowym i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
Na tym etapie odwiruj zebrane komórki jednojądrzaste w temperaturze 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć pożywkę wzrostową, ponieważ zakłóci to izolację magnetyczną. Używając tej samej liczby komórek uzyskanej wcześniej, ponownie zawiesić raz 10 do ośmiu komórek jądrzastych na mililitr w PBS zawierającym 2% FBS i jeden milimolowy EDTA w zakresie objętości od 0,1 do 2,5 mililitra. Następnie dodaj pełną objętość komórek jądrzastych w PBS do świeżej pięciomililitrowej probówki z polistyrenu o okrągłym dnie.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynnika do znakowania CD11b PE na jeden mililitr próbki. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Następnie dodaj 70 mikrolitrów koktajlu selekcyjnego na jeden mililitr próbki.
Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Następnie wymieszaj cząstki magnetyczne, pipetując w górę i w dół więcej niż pięć razy. Dodać 50 mikrolitrów na mililitr do próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chroniąc przed światłem.
Jeśli całkowita objętość mieszaniny komórek jest mniejsza niż 2,5 mililitra, uzupełnij do tej objętości PBS zawierający 2% FBS i jeden milimolowy EDTA i wymieszaj, delikatnie pipetując dwa do trzech razy. Następnie umieść probówkę w magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Jednym ciągłym ruchem całkowicie odwróć magnes zawierający rurkę na dwie do trzech sekund, aby wylać supernatant.
Przywróć magnes do pozycji pionowej i wyjmij rurkę z magnesu. Następnie wypłucz pozostałe komórki z kolumny, powtarzając procedury. Ponownie zawieś komórki w żądanym pożywce wzrostowej.
Przepłucz bok naczynia zbiorczego, aby zebrać komórki z boków probówki i zmaksymalizować wydajność. Jak widać na tym rysunku, izolowany pierwotny mikroglej zachowuje swoje kuliste ciało komórkowe i wyraźną rozgałęzioną strukturę. Oto reprezentatywne wykresy faktów izolowanego mikrogleju.
Połączone barwienie aneksyny V i jodku propidyny pozwala na kategoryzację komórek apoptotycznych, nekrotycznych lub żywych po stymulacji LPS. Pożywka kondycjonowana hAEC znacznie zmniejszyła apoptozę mikrogleju w porównaniu z kontrolami, co sugeruje formę ochrony tego typu komórek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu do ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej metody ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność przy nakładaniu warstw Percoll, ponieważ ten krok będzie miał największy wpływ na plony. Podążając za tą techniką, można zastosować inne procedury, takie jak test funkcji fagocytarnej lub współhodowla z neuronami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące właściwości immunomodulacyjnych wybranego typu komórki w pierwotnym mikrogleju. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w tej dziedzinie, którzy odkryli, w jaki sposób pierwotny mikroglej może być modulowany w okołoporodowym uszkodzeniu mózgu.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii i diagnozy okołoporodowego uszkodzenia mózgu, ponieważ pozwala ona na scharakteryzowanie pierwotnego typu komórek odpornościowych, o których wiadomo, że są zaangażowane w neuroinformację, która prowadzi do dysfunkcji motorycznej i poznawczej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zaburzenia motoryczne, takie jak porażenie mózgowe, może być również stosowana w innych zaburzeniach, w których mikroglej odgrywa rolę w patogenezie, takich jak choroba Alzheimera. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy uzyskać technikę szybkiej charakterystyki mikrogleju z pominięciem potencjalnych zmian epigenetycznych po dłuższym czasie w hodowli.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować populację mikrogleju o wysokiej czystości w celu dalszej charakterystyki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych mikroglejów z mózgów mysich, co poprawia nasze zrozumienie stanów neurologicznych. Metoda łączy wirowanie gradientowe z gęstością i separację magnetyczną, aby uzyskać wysokiej czystości próbki mikrogleju skutecznie. Kluczowe kroki dotyczące charakteryzacji komórek są również opisane.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Mikrogleje odgrywają krytyczne role w układzie nerwowym, a ich izolacja jest niezbędna do badania ich funkcji.
- Ten protokół pomaga w odpowiedzi na ważne pytania dotyczące zachowania mikrogleju i ich interakcji z innymi typami komórek.
- Wysokiej czystości mikrogleje są niezbędne do dokładnych wyników eksperymentów w badaniach neurologicznych.
- Protokół minimalizuje potrzebę przedłużania czasu hodowli, ułatwiając natychmiastowe użycie świeżo izolowanych komórek.
Cel badania
- Opracowanie solidnego protokołu do izolacji czystych komórek mikroglejowych z mózgów gryzoni.
- Poprawa rozumienia roli mikrogleju w neuroinflammacji i innych zaburzeniach neurologicznych.
- Możliwość zastosowań pobocznych, takich jak badania przesiewowe leków i immunomodulacji.
Zastosowane metody
- Izolacja tkanki mózgowej ex vivo z towarzyszącym mechanicznym i enzymatycznym trawieniem.
- Model biologiczny składa się z mózgów mysich do izolacji mikrogleju.
- Metody obejmują wirowanie gradientowe z gęstością i separację magnetyczną.
- Kluczowe kroki obejmują ostrożne obchodzenie się z tkanką i specyficzne warunki inkubacji, aby zapewnić wysoką żywotność komórek.
- Wysokoprecyzyjne techniki izolacji i charakteryzacji komórek były podkreślane w całym protokole.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie daje wysokoczystą populację mikrogleju gotową do analizy.
- Izolowany mikroglej może być użyty do różnych testów, dostarczając wglądu w ich właściwości funkcjonalne i reakcje.
- Metoda pozwala na szybki dostęp do świeżo izolowanych komórek, co jest kluczowe dla natychmiastowych potrzeb eksperymentalnych.
- Solidność protokołu została podkreślona, zapewniając wyniki powtarzalne i niezawodne w różnych eksperymentach.
Wnioski
- To badanie umożliwia badaczom łatwą izolację komórek mikroglejowych, co ułatwia głębsze zrozumienie ich roli w zdrowiu i chorobie.
- Opisane techniki stanowią podstawę dla dalszych badań nad procesami neuroinflammacyjnymi i związanymi z nimi terapiami.
- Wgląd uzyskanym z tej metody może posłużyć do poszerzenia wiedzy na temat funkcji mikrogleju i ich implikacji w badaniach neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
