Izolacja komórek jednojądrzastych z mózgu myszy: technika wirowania w gradimencie gęstości do izolowania komórek jednojądrzastych rezydujących w mózgu

Komórki jednojądrzaste w mózgu, składające się z limfocytów i monocytów, odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji mózgu i homeostazy.

Aby wyizolować te komórki jednojądrzaste, najpierw weź świeżo zebrany mózg myszy wypełniony solą fizjologiczną.

Perfuzja umożliwia usunięcie krwi i jej składników z naczyń krwionośnych, umożliwiając izolację komórek odpornościowych rezydujących w mózgu w kolejnych etapach.

Teraz przepłucz mózg odpowiednią pożywką, aby usunąć przylegające czerwone krwinki. Następnie po płukaniu mielenie mięsa, aby uzyskać małe kawałki tkanki.

Homogenizuj fragmenty tkanki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek i fragmentów komórek.

Do tej zawiesiny należy następnie dodać schłodzone podłoże i odpowiednią pożywkę o gradientze gęstości w odpowiednich objętościach, aby utworzyć podłoże o gradiencie o niskiej gęstości.

Następnie dodaj określoną objętość ośrodka gradientowego o dużej gęstości; nośnik gradientowy o dużej gęstości tworzy oddzielną warstwę na dole, tworząc gradient o nieciągłej gęstości.

Odwirować zawiesinę przy dużej prędkości i niskiej temperaturze. Komórki jednojądrzaste zajmują granicę faz między dwiema warstwami mediów gradientu gęstości.

Odrzuć górną warstwę zawierającą szczątki komórkowe i mielinę - osłonkę tkanki tłuszczowej otaczającą aksony komórek nerwowych.

Przenieść warstwę interfejsu do świeżej probówki zawierającej odpowiednią pożywkę i wirówkę.

Oczyszczone komórki jednojądrzaste osadzają się w postaci osadów i mogą być ponownie zawieszone w buforze w celu dalszej analizy.

Ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi i przenieść mózg każdego zwierzęcia z pudełka czaszkowego do pojedynczych 50-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów pożywki RPMI.

Dobrze wymieszaj probówki, aby usunąć przylegające czerwone krwinki i usunąć pożywkę przez aspirację. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki do każdej probówki i przenieś mózgi do pojedynczych 100-milimetrowych szalek.

Drobno posiekaj każdy mózg brzytwą i użyj plastikowej pipety, aby przenieść jak najwięcej tkanki z jednego naczynia na raz w 6 mililitrach pożywki do lodowatego 7-mililitrowego homogenizatora ze spiekanego szkła.

Zmielić mózg za pomocą "luźnego" tłoka tłuczka przed użyciem "ciasnego" tłoka w celu doprowadzenia tkanki do uzyskania jednorodnej konsystencji zawiesiny. Następnie wlej powstałą zawiesinę tkanki do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na lodzie.

Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, dostosuj objętość w każdej probówce do 7 mililitrów ze świeżą pożywką przed dodaniem każdej zawiesiny tkankowej do nowej schłodzonej 15-mililitrowej probówki zawierającej 3 mililitry 100% matrycy membrany podstawnej na probówkę.

Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie i użyj 3-mililitrowej pipety, aby ostrożnie i powoli dodać 1 mililitr roztworu gradientu gęstości 70% pod każdą próbkę roztworu tkankowego.

Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości i usuń prawie całą górną warstwę, uważając, aby całkowicie usunąć całą mielinę.

Przenieś interfejs do nowej 15-mililitrowej rurki i dostosuj objętość do 10 mililitrów za pomocą świeżego podłoża. Następnie ponownie odwirować próbki i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem granulek w około 100 mikrolitrach pożywki na probówkę.