Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Wypreparuj barwione zmiany demielinizacyjne z ciała modzelowatego mózgu myszy.

Zmiany te zawierają rezydujący w mózgu mikroglej wykazujący ekspresję integryny CD11b na powierzchni komórki.

Zebrać tkankę i dodać roztwór zawierający enzym proteolityczny i DNazę.

Enzym degraduje macierz zewnątrzkomórkową, podczas gdy DNaza degraduje wolne DNA.

Dodaj zimny bufor i przefiltruj zawiesinę przez sitko, aby usunąć grudki komórkowe.

Odwirować, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w podłożu o gradiencie gęstości.

Nakładka z buforem i wirówką w celu zebrania pozostałych zanieczyszczeń w górnych warstwach; nienaruszone komórki osiadają na dnie.

Usuń zanieczyszczenia i ponownie zawieś ogniwa w buforze.

Dodaj kulki magnetyczne anty-CD11b, aby oznaczyć mikroglej.

Załaduj ogniwa na kolumnę zawierającą kule ferromagnetyczne umieszczone w polu magnetycznym separatora magnetycznego.

Pod zewnętrznym polem magnetycznym mikroglej związany z kulkami jest zatrzymywany w kolumnie, podczas gdy przepływają przez nią niezwiązane komórki.

Usuń kolumnę z pola magnetycznego. Dodaj bufor, aby wymyć mikroglej.

Rozpocznij od mikrowypreparowania zmian oznaczonych neutralnym barwnikiem wokół ciała modzelowatego pod mikroskopem stereoskopowym. Odwirować wypreparowaną tkankę o masie 300 x g przez 30 sekund, aby pobrać próbkę na dno probówki. Podgrzej mieszaninę enzymów 1 i mieszankę enzymów w temperaturze od 2 do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Następnie dodaj 1,950 mikrolitrów wstępnie podgrzanej mieszanki enzymatycznej 1 do jednej próbki i trawić w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Dodaj 30 mikrolitrów podgrzanej mieszanki enzymatycznej 2 i delikatnie wymieszaj.

Po strawieniu dodaj 4 mililitry zimnego PBS do probówki i delikatnie wstrząśnij. Odwirować próbki tkanek o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i powoli i całkowicie odsysać supernatant. Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1,550 mikrolitrów zimnego PBS. Dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usunięcia zanieczyszczeń i dobrze je wymieszaj.

Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby bardzo powoli i delikatnie nałożyć mieszaninę na 2 mililitry zimnego PBS. Odwiruj mieszaninę, a następnie poszukaj 3 warstw. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby całkowicie zassać 2 górne warstwy i napełnij probówkę do 5 mililitrów buforem do ładowania na zimno. Delikatnie odwróć rurkę 3 razy.

Następnie, po odwirowaniu i aspiracji supernatantu, ponownie zawieś osad komórkowy z 90 mikrolitrami buforu ładującego i dodaj 10 mikrolitrów kulek CD11b. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać 1 mililitr buforu ładującego i umyć komórki, delikatnie pipetując płyn w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów.

Odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4:00 stopni Celsjusza i całkowicie odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych kulek. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach bufora ładującego i umieścić kolumnę MS wraz z jej separatorem w celu pozytywnej selekcji w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu ładującego w celu ochrony komórek i zapewnienia wydajności sortowania magnetycznego w oparciu o protokół producenta.

Nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę MS i odrzucić przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki. Dodać 500 mikrolitrów buforu załadowczego, aby umyć kolumnę i usunąć ją z separatora. Umieść kolumnę na 15-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj 1 mililitr bufora ładującego do kolumny. Na koniec popchnij tłok na dno kolumny, aby wypłukać komórki znakowane magnetycznie.