Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)
28 stycznia 2015
Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej stabilności białek w żywych zarodkach zebry danio młodego. Osiąga się to poprzez znakowanie interesującego białka fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym oraz poprzez wstrzykiwanie mRNA, kodującego fuzję, a także barwnik fluorescencyjny do zarodków danio pręgowanego. Następnie fotokonwertowalne białko fuzyjne jest poddawane fotokonwersji, która pulsacyjnie znakuje białko.
W tym przykładzie białko fuzyjne jest wydzielane, a następnie rozpad wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej intensywności fotokonwersji jest monitorowany w czasie i wyposażony w funkcję wykładniczo malejącą w celu określenia wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania białka fuzyjnego. Wyniki pokazują stabilność in vivo fotokonwertowalnych białek fuzyjnych w oparciu o rozpad sygnału fluorescencyjnego w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i rozwoju.
Na przykład, jak stabilność wpływa na dystrybucję i dostępność białek. Używamy naszego oprogramowania EP do analizy danych FD DP. EP jest dostępny bezpłatnie na naszej stronie internetowej: Po wygenerowaniu zakrytego mRNA w kodowaniu kodowania zielonego do czerwonego konwertowalnego białka fuzyjnego o znaczeniu przenieś około 31 zarodków zebry w fazie komórkowej na plastikową szalkę Petriego o średnicy pięciu centymetrów pokrytą szkłem lub różą agarową zawierającą około ośmiu mililitrów pożywki zarodkowej.
Dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego i rozmrożonego roztworu podstawowego do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Napełnij szklany głośnik pożywką dla zarodków i unikając wystawiania zarodków na działanie powietrza lub plastiku, przenieś zarodki do zlewki, przechylając szalkę Petriego podczas zanurzania jej w pożywce. Gdy zarodki osiądą na dnie zlewki, wylej większość podłoża i ostrożnie załóż je na świeże podłoże.
Łagodne wirowanie świeżej pożywki spowoduje, że zarodki stracą osłabioną powłokę. Po powtórzeniu prania użyj szklanej pipety PE z płomieniowaną końcówką, aby przenieść powleczone zarodki do naczynia iniekcyjnego pokrytego agarozą. Następnie wstrzyknij mRNA i trzykilodaltonową nić Alexa 4 88 DExT sprzężoną bezpośrednio do środka komórki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mRNA i barwnika.
Gdy rozpocznie się rozszczepienie, przenieś wstrzyknięte zarodki do studzienki pokrytej od 1 do 2% agarozy w sześciodołkowym plastikowym naczyniu wypełnionym zarodkiem, pożywką i inkubuj w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż zarodki osiągną późne stadium kuli za pomocą mikroskopu stereoskopowego, zidentyfikuj od jednego do pięciu zdrowych zarodków i użyj szklanej pipety PEs z płomieniowaną końcówką, aby usunąć je z naczynia. Delikatnie wyrzuć zarodki do mikroprobówki wirówkowej zawierającej około jednego mililitra stopionego 1% aros o niskiej temperaturze topnienia w jednym pożywce dla zarodków z dajo. Następnie wciągnij zarodki z powrotem do pipety wraz z kilkoma aros.
Następnie delikatnie wysuń aros i zarodki na okładkę. Szklanka naczynia ze szklanym dnem. Aby ponownie użyć szklanej pipety, należy usunąć resztki aros, aby zapobiec zatkaniu, szybko pipetując pożywkę zarodkową w górę i w dół, działając szybko, zanim aros stwardnieje.
Użyj metalowej sondy, aby ustawić zarodki tak, aby słup zwierzęcia był skierowany w stronę szkła nakrywkowego pod mikroskopem stereoskopowym. Monitoruj pozycje zarodków i w razie potrzeby dostosuj, aż agarro stwardnieje. Gdy agarro stężeje, użyj jednego x pożywki z zarodków danio, aby napełnić szklane naczynie.
Aby przygotować się do konwersji zdjęć, ustaw inkubator na 28 stopni Celsjusza i umieść dużą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie, aby upewnić się, że film olejowy między obiektywem a szkłem nakrywkowym nie pęknie, gdy etap przesuwa się do różnych pozycji zarodka. Podczas bezpiecznego obrazowania umieść naczynie ze szklanym dnem na stoliku, aby naczynie nie przesuwało się, gdy stage się porusza. Następnie w pakiecie oprogramowania mikroskopu konfokalnego określ pozycję każdego zarodka.
Dostosuj głębokość Z dla każdego zarodka i spróbuj skierować się mniej więcej na tę samą płaszczyznę w każdym zarodku, używając zarówno laserów 4 88, jak i 5 43 nanometrów. Uzyskaj obrazy przed konwersją zdjęć. Następnie skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu konfokalnego tak, aby obrazowało każdą z wcześniej zdefiniowanych pozycji z odpowiednimi warunkami obrazowania.
Co 10 lub 20 minut lub pięciogodzinny kurs fotograficzny w celu fotokonwersji białka fuzyjnego zmienia się na obiektyw 10 x i wystawia grupy zarodków na działanie światła UV z lampy rtęciowej z filtrem o długości około 300 do 400 nanometrów przy 100% mocy wyjściowej przez dwie minuty. Przesuń ostrość wzdłuż osi Z, aby zapewnić jednolitą konwersję zdjęć po konwersji zdjęć. Natychmiast przełącz się z powrotem na obiektyw 25x lub 40x i potwierdź, że poprzednio zdefiniowane pozycje są nadal dokładne.
Jeśli szalka przesunęła się podczas konwersji zdjęcia, ponownie określ pozycje zarodków. Rozpocznij kurs czasu obrazowania i pozwól mu działać przez pięć godzin. Zwróć uwagę na czas, jaki upłynął między konwersją zdjęcia a rozpoczęciem obrazowania dla każdego zarodka.
Od czasu do czasu sprawdzaj eksperyment i monitoruj poziom pożywki Danielle, dodając więcej, jeśli to konieczne. Zacznij od wizualnej kontroli zestawów danych dotyczących przebiegu czasu z każdego zarodka. Odrzuć zestawy danych z zarodków, które zmarły podczas obrazowania, które uległy znacznemu przesunięciu, które mają bardzo niski poziom sygnału konwersji zdjęć lub które zawierają obszary komórek, które wyglądają nietypowo i które przestały się poruszać i dzielić.
Korzystając z pakietu oprogramowania opartego na Pythonie, PI F DAP tworzy maskę przy użyciu sygnału Alexa 4 88, który jest ściśle wewnątrzkomórkowy. Aby oddzielić wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy sygnał konwersji zdjęć, nałóż maskę na odpowiedni obraz kanału czerwonego, aby zapobiec uwzględnianiu pikseli wewnątrzkomórkowych. Obliczając średnią intensywność zewnątrzkomórkową w celu zmierzenia średniej intensywności wewnątrzkomórkowej, odwróć maskę, wyświetl wygenerowane zamaskowane obrazy i wizualnie je sprawdź, a następnie odrzuć zestawy danych, w których maski nie odróżniają dokładnie przestrzeni wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej
.Użyj PI F DAP, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej dla każdego obrazu. Następnie dopasuj dane fluorescencji, jak pokazano tutaj, zgodnie z wytycznymi w protokole tekstowym i oblicz białko zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe. Okres półtrwania tau od współczynnika klirensów.
Zez Constance K jest wydzielanym białkiem, które indukuje ekspresję genów endodermalnych mis podczas embriogenezy danio pręgowanego. W tym eksperymencie zarodkom wstrzyknięto jednocześnie dekstran Alexa 4 88 i mRNA kodujący zeza DENDRA dwa i poddano testowi F DAP. Jak pokazano tutaj, intensywność sygnału przekształconego w zdjęcie zewnątrzkomórkowe zmniejsza się z czasem.
Za pomocą PI F dap wygenerowano zewnątrzkomórkowe profile intensywności z 23 zarodków, a dane wyposażono w model klirensu pierwszego rzędu. Wyniki wskazują na średni okres półtrwania tau wynoszący 116 minut. Podobne profile intensywności i białka.
Okresy półtrwania uzyskiwano, gdy odstępy między obrazowaniem wynosiły 10 lub 20 minut. Sugerowanie, że wybielanie zdjęć lub niezamierzona konwersja zdjęć nie przyczyniły się znacząco do zmian intensywności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać zaniku fluorescencji po konwersji zdjęć.
Do pomiaru in vivo. Okresy półtrwania fotokonwertowalnych białek fuzyjnych w żywych zarodkach danio pręgowanego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje stabilność białek w żywych embrionach danio pręgowanego z wykorzystaniem fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego. Spadek intensywności fluorescencji jest monitorowany w celu wyznaczenia okresów półtrwania białek zarówno w środowisku wewnątrzkomórkowym, jak i pozakomórkowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Poziomy białek są regulowane przez ich produkcję i usuwanie.
- Zrozumienie stabilności białek jest kluczowe dla funkcjonowania komórki.
- Techniki fluorescencyjne mogą dostarczyć informacji na temat dynamiki białek.
- Zarodki danio pręgowanego stanowią przydatny model do badań in vivo.
Cel badania
- Pomiar stabilności białek w żywych embrionach danio pręgowanego.
- Wykorzystanie fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych do śledzenia.
- Ocena czasu połowicznego rozpadu białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.
Zastosowane metody
- Oznakowanie białka zainteresowania fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym.
- Wstrzyknięcie do zarodków danio prasłownego mRNA kodującego białko fuzyjne oraz barwnika fluorescencyjnego.
- Fotokonwersja białka fuzyjnego w celu jego impulsowego znakowania.
- Monitorowanie spadku intensywności fluorescencji w czasie.
Główne wyniki
- Spadek intensywności fluorescencji wskazuje na stabilność białka.
- Można wyznaczyć okresy półtrwania białka fuzyjnego.
- Metoda ta demonstruje stabilność in vivo białek fotokonwertowalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki białek w organizmach żywych.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu stabilności białek in vivo.
- Wyniki mogą być pomocne w badaniach z zakresu biologii komórki i biologii rozwoju.
- Analiza zaniku fluorescencji jest cennym narzędziem w badaniach nad białkami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar kinetyki usuwania białek w żywych systemach umożliwia walidację celu poprzez ujawnienie funkcjonalnych okresów półtrwania, które wpływają na dostępność terapeutyczną i aktywność szlaków. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w fazie wczesnego odkrywania poprzez ilościowe określenie stabilności wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej wydzielanych białek sygnałowych, co pozwala na optymalizację dawkowania i strategii inżynieryjnych. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną przy identyfikacji wiodących kandydatów, łącząc stabilność białek z fenotypami rozwojowymi w systemie istotnym dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotezy terapeutycznej poprzez pomiar wpływu stabilności białek na ich dystrybucję i dostępność in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celu poprzez bezpośredni pomiar kinetyki usuwania w żywych embrionach rybek danio.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie selekcji projektów z portfolio poprzez identyfikację białek o korzystnych okresach półtrwania wewnątrz- i pozakomórkowych w celu dalszego rozwoju.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowych tempa obrotu białek.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki mierzalnemu spadkowi fluorescencji dopasowanemu do modeli wykładniczych.
- Skalowalność: Wykazanie gotowości do screeningu i możliwości ponownego wykorzystania platformy poprzez umożliwienie analizy specyficznej dla poszczególnych przedziałów komórkowych dzięki maskowaniu wewnątrz- i zewnątrzkomórkowemu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie istotności dla choroby oraz dopasowania biomarkerów translacyjnych poprzez pomiar stabilności wydzielanych białek sygnałowych podczas rozwoju danio pręgowanego.
- Walidacja przedkliniczna: Opis ciągłości od etapu odkrycia po prace przedkliniczne poprzez ocenę okresów półtrwania białek w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju projektu poprzez dostarczenie ilościowych danych o klirensie, które informują o zaangażowaniu celu i czasie trwania działania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając mechanistycznych informacji o stabilności białek, które wpływają na przesiewanie i optymalizację związków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnienie, w jaki sposób metoda ta wspomaga testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez powiązanie klirensu białek z fenotypami rozwojowymi.
- Przesiewanie: Opis gotowości do analizy, powtarzalności lub wyników ilościowych, jeśli artykuł potwierdza je poprzez mierzalny spadek fluorescencji wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej.
- Analityka: Wskazanie pomiarów, odczytów lub wyników statystycznych, które pomagają zespołom porównywać warunki za pomocą dopasowanych modeli klirensu i obliczeń czasu połowicznego rozpadu (tau).
- Badania translacyjne: Powiązanie metody z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów tylko wtedy, gdy źródło wspiera to poprzez analizę stabilności wydzielanego białka w rozwijających się embrionach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawienie metody jako wielokrotnego zasobu, a nie jednorazowej techniki, poprzez umożliwienie pomiaru kinetyki klirensu dowolnego białka z możliwością znakowania w organizmach dostępnych optycznie.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie wstrzykiwania mRNA, obrazowania konfokalnego oraz analizy zaniku fluorescencji.
- Zapotrzebowanie na instrumentację i infrastrukturę analityczną, w tym mikroskop konfokalny, system fotokonwersji UV oraz oprogramowanie PI F DAP oparte na języku Python.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie generowania masek, segmentacji przedziałów oraz spójności obrazowania w serii czasowej.
- Rozważania dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych w zależności od dostępności optycznej i protokołów utrzymania embrionów.
- Praktyczne ograniczenia opisane w materiale źródłowym, obejmujące żywotność embrionów podczas obrazowania oraz dokładne rozróżnienie sygnału wewnątrzkomórkowego od zewnątrzkomórkowego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Generating a Photoconvertible Fusion Construct and Injecting Dechorionated Zebrafish Embryos
3:22
Mounting Zebrafish Embryos for Photoconversion and Confocal Imaging
4:37
Photoconverting and Measuring the Decrease of the Photoconverted Signal
6:47
Analyzing the Data Using PyFDAP
8:18
Results: Half-life of Squint-Dendra2 as Determined by Fluorescence Decay After Photoconversion during Embryogenesis
9:19
Conclusion
