Name: Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Naucz się mierzyć stabilność białek w żywych zarodkach Danio rerio za pomocą techniki FDAP. Ta metoda pozwala określić czas połowicznego zaniku białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jeffreyowi Farrellowi, Jamesowi Gagnonowi i Jennifer Bergmann za komentarze do manuskryptu. KWR był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program podczas opracowywania testu FDAP. Praca ta była wspierana przez granty z NIH dla AFS oraz przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (Emmy Noether Program), Towarzystwa Maxa Plancka i Human Frontier Science Program (Nagroda za rozwój kariery) dla PM.

1. Tworzenie fotokonwertowalnego konstruktu fuzyjnego i wstrzykiwanie do zdechorionowanych zarodków rybki danio
<ol>
	<li>Przygotować funkcjonalny konstrukt zawierający białko docelowe połączone z fotokonwertowalnym białkiem zielono-czerwonym (patrz Dyskusja), a następnie przeprowadzić transkrypcję in vitro w celu otrzymania mRNA z czapeczką kodującego białko fuzyjne, zgodnie z opisem u Müller et al., 201219.</li>
	<li>Użyć pronazy do usunięcia chorionów z około 30 embrionów danio pręgowanego w stadium jednej komórki. Alternatywnie można przeprowadzić dechorionację embrionów ręcznie za pomocą pęsety28. 
	Uwaga: Embriony muszą zostać poddane dechorionacji przed późniejszym obrazowaniem. Jeśli jest to pożądane, embriony można injektować przez chorion i przeprowadzić dechorionację później, bezpośrednio przed obrazowaniem.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy pronazy z Streptomyces griseus o stężeniu 5 mg/ml w standardowym medium dla embrionów danio pręgowanego19. Delikatnie mieszać roztwór na kołysarce w temperaturze RT przez 10 min, aby proteaza całkowicie się rozpuściła. Rozdzielić roztwór w aliquoty po 2 ml do probówek do mikrocentryfugi i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przenieść embriony w stadium jednej komórki do szklanej lub powlekanej agarozą plastikowej szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej ~8 ml medium dla embrionów. Dodać do szalki 2 ml rozmrożonego roztworu zapasowego pronazy i inkubować w temperaturze RT od 5 do 10 min.</li>
		<li>Unikać wystawiania embrionów na działanie powietrza lub kontaktu z plastikiem, ponieważ oba te czynniki mogą spowodować pęknięcie zdechorionowanych embrionów. Napełnić szklany zlew o pojemności 200 ml medium dla embrionów. Przenieść embriony do zlewka, przechylając szalkę Petriego podczas zanurzania jej w medium.</li>
		<li>Po opadnięciu embrionów na dno zlewka odlać większość medium dla embrionów, a następnie wlać do zlewka świeże medium. Delikatny ruch wirowy powstający podczas wlewania medium do zlewka powoduje oddzielenie osłabionych chorionów od embrionów.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zdechorionowane embriony do powlekanej agarozą szalki do injekcji29 przy użyciu szklanej pipety Pasteura z opalonym końcem. Opalenie końcówki pipety zapobiega uszkodzeniu embrionów przez ostre krawędzie szkła.</li>
	<li>Współinjektować mRNA oraz koniugat Alexa488-dekstranu o masie 3 kDa29,30 (Rycina 1B; sugerowane ilości mRNA i Alexa488-dekstranu znajdują się w sekcji Dyskusja). Injektować bezpośrednio do centrum komórki (nie do żółtka), aby zapewnić równomierny rozkład mRNA i barwnika fluorescencyjnego po rozpoczęciu podziałów. 
	Uwaga: Sygnał Alexa488 zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wygenerowania masek kompartymentacyjnych w celu odróżnienia fluorescencji wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej.</li>
	<li>Przenieść injektowane embriony do dołka plastikowej płytki sześciodołkowej powleczonego 1–2% agarozą i wypełnionego medium dla embrionów. Inkubować w ciemności w temperaturze 28 °C, aż embriony osiągną późne stadium sfery31 (około 5 h po zapłodnieniu). Kontrolować embriony co 1 do 2 h pod stereomikroskopem i usuwać wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku obumarcia embrionów.</li>
</ol>
2. Montowanie zarodków danio pręgowanego do fotokonwersji i obrazowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym
<ol>
	<li>Za pomocą stereomikroskopu zidentyfikować od jednego do pięciu zdrowych embrionów, a następnie użyć szklanej pipety Pasteura z wypaloną końcówką, aby przenieść je z naczynia.</li>
	<li>Delikatnie wprowadzić embriony do probówki do mikrocentryfugi zawierającej ~1 ml roztopionej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x pożywce dla embrionów Danieau (patrz Lista Materiałów) (Rysunek 2A). 
	Uwaga: Temperatura agarozy powinna wynosić od 40 do 42 °C; wyższe temperatury mogą uszkodzić embriony.</li>
	<li>Wciągnąć embriony z powrotem do pipety wraz z niewielką ilością agarozy. Delikatnie nanieść agarozę i embriony na szkiełko nakrywkę naczynia z szklanym dnem (Rysunek 2B). Należy upewnić się, że grubość szkiełka nakrywkowego jest kompatybilna z obiektywem mikroskopu konfokalnego.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby można ponownie użyć szklanej pipety. Aby oczyścić pipetę z pozostałości agarozy i zapobiec zapchaniu, należy szybko kilkukrotnie pobrać i wypuścić pożywkę dla embrionów. W tym celu obok stereomikroskopu należy ustawić probówkę 15 ml wypełnioną ~5 ml pożywki dla embrionów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyć metalowej sondy, aby ustawić embriony tak, by biegun zwierzęcy (blastoderm) był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego. Należy pracować szybko, ponieważ agaroza krzepnie w ciągu 20–30 s. Za pomocą stereomikroskopu monitorować położenie embrionów i w razie potrzeby korygować je aż do stężenia agarozy.</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.1–2.4 aż do zamontowania pożądanej liczby embrionów. 
	Uwaga: W typowym eksperymencie na szkiełku nakrywkowym zmieści się bez problemu cztery krople agarozy, z których każda zawiera cztery lub pięć embrionów. Podczas jednego idealnego eksperymentu można zobrazować około 16 embrionów (Rysunek 2C).</li>
	<li>Po zastygnięciu agarozy wypełnić naczynie z szklanym dnem 1x pożywką dla embrionów Danieau.</li>
</ol>
3. Fotokonwersja i pomiar spadku sygnału po fotokonwersji
Do rozmiaru i współczynnika załamania światła zarodków zebrafish odpowiedni będzie obiektyw wodny 25X lub 40X. Najlepiej zastosować olej immersyjny o współczynniku załamania światła takim samym jak woda, zamiast samej wody, ponieważ woda odparowałaby w ciągu pięciogodzinnego eksperymentu. Należy upewnić się, że olej immersyjny jest przeznaczony do stosowania z obiektywem wodnym (a nie olejowym).
<ol>
	<li>Nanieś dużą kroplę olejku imersyjnego na obiektyw, aby upewnić się, że film olejowy między obiektywem a szkiełkiem podstawowym nie zostanie przerwany podczas przemieszczania stolika do różnych pozycji zarodków w trakcie obrazowania. Stabilnie umieść naczynko z szklanym dnem na stoliku, aby nie przesunęło się ono podczas ruchu stolika. Jeśli to możliwe, użyj podgrzewanego stolika ustawionego na 28 °C, co jest temperaturą optymalną dla rozwoju zebrafish.</li>
	<li>Zdefiniuj pozycję każdego zarodka w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Dostosuj głębokość z dla każdego zarodka, starając się celować mniej więcej w tę samą płaszczyznę w każdym z nich. 
	Uwaga: Głębokość około 30 μm od bieguna zwierzęcego jest odpowiednia, ponieważ na tym poziomie można uniknąć warstwy otaczającej zarodek, maksymalizując obszar obrazowania i minimalizując rozproszenie światła. Pojedynczy przekrój optyczny o grubości ~3.3 μm dostarcza wystarczających danych; nie ma potrzeby pozyskiwania stosu z (z-stack) (patrz Sekcja 5).</li>
	<li>Podczas eksperymentu zbierz dwa sygnały: sygnał „zielony” z koniugatu Alexa488-dextran — który zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wyizolowania fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej — oraz sygnał „czerwony” z białka fuzyjnego po jego fotokonwersji.
	<ol>
		<li>Wzbudź Alexa488 za pomocą lasera 488 nm i zbierz emitowaną fluorescencję w zakresie od ~500 do 540 nm. Uwaga: Po fotokonwersji wiele białek fotokonwertowalnych z zielonego na czerwony (np. Dendra2) może być wzbudzanych laserem 543 nm i emitować fluorescencję w zakresie od ~550 do 650 nm. Dostosuj parametry w zależności od użytego białka fotokonwertowalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskaj obrazy „przed fotokonwersją” i skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu konfokalnego tak, aby obrazowało każdą z wcześniej zdefiniowanych pozycji (z kroku 3.2) przy odpowiednich warunkach obrazowania co 10 lub 20 min w ciągu pięciogodzinnego przebiegu czasowego (patrz Sekcja 5 i Dyskusja).</li>
	<li>Aby przeprowadzić fotokonwersję białka fuzyjnego, przełącz na obiektyw 10X i wystaw grupy zarodków na światło UV z lampy łukowej rtęciowej z filtrem wzbudzenia ~300–400 nm przy 100% mocy przez 2 min. Przesuwaj ostrość wzdłuż osi z, aby zapewnić jednorodną fotokonwersję (patrz Sekcja 5). Upewnij się, że olejek imersyjny nie skapie na obiektyw 10x podczas fotokonwersji. 
	Uwaga: Przesuwanie ostrości podczas fotokonwersji można zautomatyzować, aby uniknąć zmienności między operatorami.</li>
	<li>Bezzwłocznie po fotokonwersji przełącz z powrotem na obiektyw 25X lub 40X. Upewnij się, że wcześniej zdefiniowane pozycje z kroku 3.2 są nadal dokładne. Jeśli naczynko przesunęło się podczas fotokonwersji, ponownie zdefiniuj pozycje zarodków.
	<ol>
		<li>Uruchom program stworzony w kroku 3.4 i kontynuuj obrazowanie przez 5 h. Odnotuj czas, który upłynął między fotokonwersją a rozpoczęciem obrazowania dla każdego zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Okazjonalnie sprawdzaj przebieg eksperymentu. Monitoruj poziom pożywki Danieau i uzupełniaj ją w razie potrzeby. Zrestartuj oprogramowanie, jeśli ulegnie zawieszeniu.</li>
	<li>Aby wyznaczyć wartości fluorescencji tła, które zostaną wykorzystane podczas analizy danych do oszacowania asymptoty modelu wykładniczo malejącego, włącz do eksperymentu kilka zarodków, które zostały wstrzyknięte Alexa488-dextranem, ale nie mRNA. Aby wyznaczyć szum przyrządu, który również zostanie wykorzystany w późniejszej analizie danych, wykonaj obraz w nieobecności próbki.</li>
</ol>
4. Analiza danych przy użyciu PyFDAP
<ol>
	<li>Wizualnie sprawdź zestawy danych z przebiegu czasowego dla każdego embrionu. Odrzuć zestawy danych z embrionów, które obumarły podczas obrazowania, uległy znacznemu przesunięciu, wykazują bardzo niski poziom sygnału po fotokonwersji lub zawierają obszary komórek, które wyglądają nietypowo i przestały się poruszać oraz dzielić (co jest typowe dla embrionów uszkodzonych lub chorych). 
	Uwaga: Sporadycznie w jednym lub dwóch obrazach w przeciwnym razie użytecznego zestawu danych mogą pojawić się pęcherzyki w oleju imersyjnym lub inne artefakty. Odnotuj obrazy zawierające artefakty; zostaną one odrzucone na późniejszym etapie, a pozostałe punkty czasowe z takiego zestawu danych nadal mogą zostać poddane analizie.</li>
	<li>Do analizy danych FDAP wykorzystaj pakiet oprogramowania PyFDAP oparty na języku Python. PyFDAP oblicza okresy półtrwania poprzez wyznaczenie średniej intensywności czerwonej fluorescencji wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej na każdym obrazie oraz dopasowanie danych do funkcji wykładniczo malejącej56 (Ryc. 3).
	<ol>
		<li>Pobierz PyFDAP (patrz Lista materiałów).</li>
		<li>Użyj PyFDAP, aby oddzielić wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy sygnał po fotokonwersji (Ryc. 3A,B). Wykorzystaj sygnał Alexa488, który jest ściśle wewnątrzkomórkowy, do stworzenia maski wewnątrzkomórkowej. Nałóż tę maskę na odpowiadający jej obraz w kanale czerwonym, aby zapobiec uwzględnieniu pikseli wewnątrzkomórkowych podczas obliczania średniej intensywności zewnątrzkomórkowej. Aby zmierzyć średnią intensywność wewnątrzkomórkową, odwróć maskę.</li>
		<li>W programie PyFDAP wyświetl obrazy z nałożonymi maskami wygenerowane w kroku 4.2.2. Wizualnie sprawdź te obrazy i odrzuć zestawy danych, w których maski nie odróżniają precyzyjnie przestrzeni wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej (powinno to zdarzać się rzadko; należy zauważyć, że błony komórkowe są zawarte w obrazach, w których zamaskowano przestrzeń zewnątrzkomórkową, ale można je usunąć poprzez zmianę algorytmu progowania lub wprowadzenie maski błony (np. za pomocą membrane-CFP)). Odrzuć również pojedyncze obrazy zawierające artefakty (np. pęcherzyki w oleju imersyjnym) zidentyfikowane w kroku 4.1.</li>
		<li>Użyj PyFDAP do obliczenia średnich intensywności fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej dla każdego obrazu. PyFDAP oblicza te średnie poprzez zsumowanie intensywności pikseli znajdujących się poza maską i podzielenie wyniku przez całkowitą liczbę zsumowanych pikseli.</li>
		<li>Dopasuj dane fluorescencji (Ryc. 3C) do następującej funkcji wykładniczej: 
		<img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" alt="Równanie zaniku wykładniczego c(t)=c₀e⁻ᵏᵗ+y₀; badanie kinetyczne; wzór matematyczny." data-altupdatedat="1787630408000"> 
		gdzie t to czas po fotokonwersji, c(t) to intensywność dla danej wartości t, c0 to intensywność przy t = 0, k to stała szybkości oczyszczania, a y0 to asymptota, do której dąży funkcja wraz ze spadkiem fluorescencji (Ryc. 1D). Wartość y0 może zostać ograniczona na podstawie pomiarów z kroku 3.819.</li>
		<li>Użyj PyFDAP do obliczenia zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych okresów półtrwania białka (τ) na podstawie stałych szybkości oczyszczania (k) przy użyciu następującego związku: 
		<img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq2.jpg" width="153" alt="Wzór na obliczanie okresu półtrwania, τ = ln(2)/k, równanie fizyczne, koncepcja rozpadu promieniotwórczego." data-altupdatedat="1787630408000"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Eksperymenty kontrolne w celu oceny fotoblaknięcia, niezamierzonej fotokonwersji oraz jednorodności fotokonwersji
<ol>
	<li>Ocena fotowybielania 
	Uwaga: Fotowybielanie może powodować artefaktowy spadek intensywności fluorescencji, który odzwierciedla właściwości wybielania białka fluorescencyjnego oprócz usuwania badanego białka.
	<ol>
		<li>Aby ocenić ewentualne fotowybielanie, przeprowadź jeden zestaw eksperymentów FDAP z 10 min interwałami między obrazowaniem a drugi zestaw z 20 min interwałami między obrazowaniem (Rycyna 4). Przeanalizuj dane z obu zestawów eksperymentów za pomocą PyFDAP zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
		<li>Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów z interwałami 10 i 20 min. Dłuższe okresy półtrwania w eksperymentach z interwałami 20 min wskazują na istotne fotowybielanie. Jeśli okresy półtrwania w obu eksperymentach są identyczne, fotowybielanie nie stanowi istotnego problemu.</li>
		<li>Alternatywnie można ocenić fotowybielanie poprzez wykonanie serii około 30 obrazów bezpośrednio po fotokonwersji. Znaczny spadek intensywności fluorescencji wskazuje na istotne fotowybielanie.</li>
		<li>Jeśli wykryto fotowybielanie, należy zastosować mniejszą moc lasera, skrócić czas obrazowania lub rozważyć użycie bardziej fotostabilnego białka fotokonwersyjnego32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena niezamierzonej fotokonwersji. 
	Uwaga: Dendra2 może ulec fotokonwersji pod wpływem naświetlania 488 nm27. Podczas wzbudzania Alexa488 laserem 488 nm, zgodnie z opisem w kroku 3.3.1, możliwa jest niezamierzona fotokonwersja, a w konsekwencji artefaktowy wzrost pozornego okresu półtrwania badanego białka. Jednak my oraz inni autorzy33 stwierdziliśmy, że naświetlanie 488 nm jest nieefektywną metodą fotokonwersji w embrionach danio-pręgowanego.
	<ol>
		<li>Aby wykryć niezamierzoną fotokonwersję, przeprowadź eksperyment kontrolny opisany w kroku 5.1.1. Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów z interwałami 10 i 20 min. Krótsze okresy półtrwania w eksperymentach z interwałami 20 min wskazują na istotną niezamierzoną fotokonwersję. Jeśli okresy półtrwania w obu eksperymentach są identyczne, niezamierzona fotokonwersja nie stanowi istotnego problemu.</li>
		<li>Jeśli wykryto niezamierzoną fotokonwersję, należy zastosować mniejszą moc lasera 488 nm i krótsze czasy obrazowania, aby uniknąć niezamierzonej fotokonwersji białka Dendra2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena jednorodności fotokonwersji. 
	Uwaga: Jeśli fotokonwersja jest przesunięta w stronę bieguna zwierzęcego embrionu, spadek fluorescencji będzie zależny od dyfuzji białka lub przemieszczania się komórek do głębszych płaszczyzn (Rycina 5A).
	<ol>
		<li>Aby określić, czy fotokonwersja jest jednorodna, wyeksponuj wydzielane białko fotokonwersyjne (dla eksperymentów z zewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi) lub cytoplazmatyczne białko fotokonwersyjne (dla eksperymentów z wewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi). Przeprowadź fotokonwersję w zwykły sposób, a następnie co 20 min przez 80 min wykonuj stos Z (z-stack) obejmujący większość blastodermy.</li>
		<li>Jeśli fotokonwersja jest przesunięta w stronę bieguna zwierzęcego, intensywność fluorescencji w głębszych płaszczyznach będzie z czasem rosnąć z powodu dyfuzji lub przemieszczania się komórek (Rycina 5B). Jeśli wykryto niejednorodną fotokonwersję, podczas fotokonwersji należy ustawić ostrość głębiej w embrionach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Powodzenie eksperymentu FDAP zależy od wytworzenia funkcjonalnego fotokonwertowalnego białka fuzyjnego. Znakowanie białka może wpływać na jego aktywność biologiczną i/lub właściwości biofizyczne, w tym na jego lokalizację, rozpuszczalność i stabilność36-41. Przygotuj się na przetestowanie aktywności kilku różnych konstruktów fuzyjnych, aby znaleźć taki, który jest aktywny. Odkryliśmy, że zmiana położenia białka fotokonwertowalnego w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania lub użycie dłuższych ł...

Poziomy białek w komórkach i organizmach są determinowane przez ich tempo produkcji i klirens. Okres półtrwania białka może wynosić od kilku minut do dni1-4. W wielu układach biologicznych stabilizacja lub klirens kluczowych białek ma istotny wpływ na aktywność komórkową. Modulacja wewnątrzkomórkowej stabilności białka jest wymagana do progresji cyklu komórkowego5,6, sygnalizacji rozwojowej7-9, apoptozy10 oraz prawidłowego funkcjonowania i utrzymania neuronów11,12. Stabilność białek zewnątrzkomórkowych wpływa na dystrybucję i dostępność wydzielanych białek, takich jak morfogeny13,14, w tkance.
W ciągu ostatnich kilku dekad, stabilność białek była głównie oceniana w hodowlach komórkowych za pomocą radioaktywnego znakowania impulsami lub eksperymentów z cykloheksymidem15. W takich eksperymentach z pogonią za impulsami komórki są albo przejściowo wystawione na "impuls" radioaktywnych prekursorów aminokwasów, które są włączane do nowo zsyntetyzowanych białek, lub są wystawione na działanie cykloheksymidu, który hamuje syntezę białek. Wyhodowane komórki są następnie zbierane w różnych punktach czasowych i stosuje się immunoprecypitację, po której następuje autoradiografia (w eksperymentach z radioaktywnym impulsem pościgowym) lub western blot (w eksperymentach z cykloheksymidem) w celu ilościowego określenia klirensu białka w czasie.
Konwencjonalne testy stabilności białek mają kilka wad. Po pierwsze, białka w tych testach często nie ulegają ekspresji w ich endogennym środowisku, ale raczej w kulturze tkankowej, a czasem w komórkach różnych gatunków. W przypadku białek, których stabilność jest zależna od kontekstu, podejście to jest problematyczne. Po drugie, nie jest możliwe śledzenie klirensu białek w poszczególnych komórkach lub organizmach w czasie, a dane z tych testów odzwierciedlają średnią z różnych populacji komórek w różnych punktach czasowych. Ponieważ poszczególne komórki mogły zaczynać z różnymi ilościami białka, mogły przyjąć znacznik radioaktywny lub cykloheksymid w różnym czasie lub mogą mieć różną kinetykę klirensu, takie zagregowane dane mogą być mylące. Wreszcie, w przypadku eksperymentów z cykloheksymidem, dodanie inhibitora syntezy białek może mieć niezamierzone skutki fizjologiczne, które mogą sztucznie zmienić stabilność białka16-18. Tych niedociągnięć można uniknąć, stosując Fluorescencyjny Rozpad Po Fotokonwersji (FDAP), technikę, która wykorzystuje fotokonwertowalne białka do dynamicznego pomiaru klirensu białek w organizmach żywych19-25 (patrz Dyskusja na temat ograniczeń techniki FDAP).
Białka fotokonwertowalne to białka fluorescencyjne, których właściwości wzbudzenia i emisji zmieniają się po ekspozycji na określone długości fal światła26. Jednym z powszechnie stosowanych wariantów jest Dendra2, białko fotokonwertowalne "zielono-czerwone", które początkowo ma właściwości wzbudzenia i emisji podobne do białek zielonej fluorescencji, ale po ekspozycji na światło UV - "fotokonwersja" - jego właściwości wzbudzenia/emisji stają się podobne do tych z białek czerwonej fluorescencji23,27. Co ważne, nowe białko wytworzone w wyniku fotokonwersji nie będzie miało takich samych właściwości wzbudzenia/emisji jak białko fotokonwertowane, co pozwoli na rozdzielenie produkcji i klirensu podczas fotokonwersji i obserwację tylko puli białka fotokonwertowanego. Znakowanie interesujących białek za pomocą białek fotokonwertowalnych zapewnia zatem wygodny sposób znakowania pulsacyjnego białek w nienaruszonych, optycznie dostępnych organizmach żywych.
W testach FDAP (Rysunek 1A), białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczane białkiem fotokonwertowalnym i ulega ekspresji w żywym organizmie (Rysunek 1B). Białko fuzyjne ulega fototransformacji, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1C). Dane są następnie dopasowywane do odpowiedniego modelu w celu określenia okresu półtrwania białka fuzyjnego (ryc. 1D).
Opisany tutaj test FDAP został zaprojektowany w celu określenia zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych w zarodkach danio pręgowanego podczas wczesnej embriogenezy19. Jednak podejście to można dostosować do dowolnego przezroczystego organizmu modelowego, który toleruje obrazowanie na żywo, i można je wykorzystać do monitorowania klirensu dowolnego możliwego do znakowania białka wewnątrzkomórkowego lub zewnątrzkomórkowego. Warianty opisanej tutaj techniki przeprowadzono na hodowanych komórkach20,23 i zarodkach Drosophila22 oraz myszy21.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (do pobrania z następującej strony internetowej: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Zainstaluj i obsługuj zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie internetowej PyFDAP; PyFDAP jest kompatybilny z systemami operacyjnymi Linux, Mac i Windows.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Do generowania zakrytego mRNA do wstrzykiwań do zarodków</td></tr><tr><td>Koniugat Alexa488-dekstranu, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Jednoczesne wstrzykiwanie z mRNA w celu stworzenia masek wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych</td></tr><tr><td>6-dołkowe plastikowe naczynie</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Inkubuj zarodki w studzienkach pokrytych agarozą, aż będą gotowe do montażu</td></tr><tr><td>Pożywka dla zarodków</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Sól oceaniczna instant, 1&nbsp; mg/L błękitu metylenowego w wodzie z odwróconej osmozy dostosowanej do pH 7 z NaHCO3</td></tr><tr><td>Proteaza z Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Przygotować zapas 5 mg/ml i użyć w 1&nbsp; mg/ml do dechorionacji zarodków w stadium jednokomórkowym</td></tr><tr><td>Szklana szalka</td><td></td><td></td> Petriego o średnicy 5 cm <td>Do dechorionacji zarodków</td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td></td><td></td><td>200 ml Do dechorionacji zarodków Aparatura</td></tr><tr><td></td><td></td> do<td>mikroiniekcji</td><td>Do wstrzykiwania mRNA i barwnika do zarodków w stadium jednokomórkowym</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td>Do wstrzykiwania i montowania zarodków</td></tr><tr><td>1x pożywka</td><td></td><td></td> Danieau <td>Rozcieńczyć agarozę o niskiej temperaturze topnienia i przeprowadzić obrazowanie w tym podłożu; receptura: 0,2 mm przefiltrowany roztwór 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,3 mM CaCl2, 5&nbsp; mM HEPES pH 7,2</td></tr><tr><td>UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Do montowania zarodków; stosować w stężeniu 1% w pożywce Danieau: dodać 200 mg do 20 ml pożywki Danieau, mikrofalować aż do rozpuszczenia, a następnie podwielokrotność 1&nbsp; ml do probówek do mikrowirówek; Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C, ponownie stopiony w temperaturze 70&nbsp; &deg; C i schłodzony do 40&#8211; 42 &stopnie; C gdy jest gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Kimble Chase (przez Fishera)</td><td>63A53WT</td><td>Do montażu zarodków; podpal końcówkę, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków przez postrzępione krawędzie</td></tr><tr><td>Metalowa sonda</td><td></td><td></td><td>Do pozycjonowania zarodków podczas montażu</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Użyj odpowiedniej grubości szkła nakrywkowego dla swojego celu; podany tutaj numer części dotyczy szkła nakrywkowego nr 1.5</td></tr><tr><td>Probówka 15 ml wypełniona ~5 ml pożywką zarodkową</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Do płukania resztek agarozy z pipety Pasteura</td></tr><tr><td>Odwrócony laserowy skaningowy mikroskop</td><td></td><td></td> konfokalny <td>Lampa rtęciowa, 488&nbsp; Wymagany jest laser nm, laser 543 nm i odpowiednie zestawy filtrów</td></tr><tr><td>Etap</td><td></td><td></td> podgrzewany <td>Aby utrzymać zarodki w optymalnej temperaturze 28 & stopni; C podczas eksperymentu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie konfokalne zdolne do obrazowania</td><td></td><td></td> poklatkowego <td>Musi być w stanie zdefiniować wiele pozycji i automatycznie je obrazować w określonych odstępach czasu&nbsp;</td></tr><tr>Obiektyw <td></td><td></td><td>wodny 25X lub 40X</td><td>Obiektyw do obrazowania</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td></td><td></td> powietrzny 10X <td>Obiektyw do fotokonwersji</td></tr><tr><td>Olejek</td><td></td><td></td><td>immersyjny Olejek immersyjny o tym samym współczynniku załamania światła co woda</td></tr></tbody></table>

pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (fdap)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Stabilność białek wpływa na wiele aspektów biologii, a pomiar kinetyki klirensu białek może dostarczyć ważnych informacji na temat systemów biologicznych. W eksperymentach FDAP można zmierzyć klirens białek w organizmach żywych. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym, wyrażanym in vivo i fotokonwertowanym, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany. Dane są następnie wyposażane w odpowiedni model klirensu w celu określenia okresu półtrwania białka. Co ważne, kinetykę klirensu populacji białek w różnych przedziałach organizmu można badać oddzielnie poprzez zastosowanie masek przedziałowych. Podejście to zostało wykorzystane do określenia wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych podczas rozwoju danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy protokół eksperymentów FDAP na zarodkach danio pręgowanego. Powinno być możliwe użycie FDAP do określenia kinetyki klirensu dowolnego białka dającego się oznaczyć w dowolnym optycznie dostępnym organizmie.

Metodę FDAP wykorzystano do wyznaczenia okresów półtrwania białek sygnalizacyjnych pozakomórkowych w embrionach ryb zebrafish19. Jedno z tych białek, Squint, indukuje ekspresję genów mezendodermalnych podczas embriogenezy34. Squint-Dendra2 aktywuje ekspresję genów mezendodermalnych na poziomach zbliżonych do nieoznaczonego białka Squint, co wykazano w testach qRT-PCR oraz hybrydyzacji in situ19. Do embrionów wstrzyknięto jednocześnie dekstran Alexa488 oraz mRNA kodujące Squint-De...

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej stabilności białek w żywych zarodkach zebry danio młodego. Osiąga się to poprzez znakowanie interesującego białka fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym oraz poprzez wstrzykiwanie mRNA, kodującego fuzję, a także barwnik fluorescencyjny do zarodków danio pręgowanego. Następnie fotokonwertowalne białko fuzyjne jest poddawane fotokonwersji, która pulsacyjnie znakuje białko.W tym przykładzie białko fuzyjne jest wydzielane, a następnie rozpad wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej intensywności fotokonwersji jest monitorowany w czasie i wyposażony w funkcję wykładniczo malejącą w celu określenia wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania białka fuzyjnego. Wyniki pokazują stabilność in vivo fotokonwertowalnych białek fuzyjnych w oparciu o rozpad sygnału fluorescencyjnego w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i rozwoju.Na przykład, jak stabilność wpływa na dystrybucję i dostępność białek. Używamy naszego oprogramowania EP do analizy danych FD DP. EP jest dostępny bezpłatnie na naszej stronie internetowej: Po wygenerowaniu zakrytego mRNA w kodowaniu kodowania zielonego do czerwonego konwertowalnego białka fuzyjnego o znaczeniu przenieś około 31 zarodków zebry w fazie komórkowej na plastikową szalkę Petriego o średnicy pięciu centymetrów pokrytą szkłem lub różą agarową zawierającą około ośmiu mililitrów pożywki zarodkowej.Dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego i rozmrożonego roztworu podstawowego do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Napełnij szklany głośnik pożywką dla zarodków i unikając wystawiania zarodków na działanie powietrza lub plastiku, przenieś zarodki do zlewki, przechylając szalkę Petriego podczas zanurzania jej w pożywce. Gdy zarodki osiądą na dnie zlewki, wylej większość podłoża i ostrożnie załóż je na świeże podłoże.Łagodne wirowanie świeżej pożywki spowoduje, że zarodki stracą osłabioną powłokę. Po powtórzeniu prania użyj szklanej pipety PE z płomieniowaną końcówką, aby przenieść powleczone zarodki do naczynia iniekcyjnego pokrytego agarozą. Następnie wstrzyknij mRNA i trzykilodaltonową nić Alexa 4 88 DExT sprzężoną bezpośrednio do środka komórki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mRNA i barwnika.Gdy rozpocznie się rozszczepienie, przenieś wstrzyknięte zarodki do studzienki pokrytej od 1 do 2% agarozy w sześciodołkowym plastikowym naczyniu wypełnionym zarodkiem, pożywką i inkubuj w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż zarodki osiągną późne stadium kuli za pomocą mikroskopu stereoskopowego, zidentyfikuj od jednego do pięciu zdrowych zarodków i użyj szklanej pipety PEs z płomieniowaną końcówką, aby usunąć je z naczynia. Delikatnie wyrzuć zarodki do mikroprobówki wirówkowej zawierającej około jednego mililitra stopionego 1% aros o niskiej temperaturze topnienia w jednym pożywce dla zarodków z dajo. Następnie wciągnij zarodki z powrotem do pipety wraz z kilkoma aros.Następnie delikatnie wysuń aros i zarodki na okładkę. Szklanka naczynia ze szklanym dnem. Aby ponownie użyć szklanej pipety, należy usunąć resztki aros, aby zapobiec zatkaniu, szybko pipetując pożywkę zarodkową w górę i w dół, działając szybko, zanim aros stwardnieje.Użyj metalowej sondy, aby ustawić zarodki tak, aby słup zwierzęcia był skierowany w stronę szkła nakrywkowego pod mikroskopem stereoskopowym. Monitoruj pozycje zarodków i w razie potrzeby dostosuj, aż agarro stwardnieje. Gdy agarro stężeje, użyj jednego x pożywki z zarodków danio, aby napełnić szklane naczynie.Aby przygotować się do konwersji zdjęć, ustaw inkubator na 28 stopni Celsjusza i umieść dużą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie, aby upewnić się, że film olejowy między obiektywem a szkłem nakrywkowym nie pęknie, gdy etap przesuwa się do różnych pozycji zarodka. Podczas bezpiecznego obrazowania umieść naczynie ze szklanym dnem na stoliku, aby naczynie nie przesuwało się, gdy stage się porusza. Następnie w pakiecie oprogramowania mikroskopu konfokalnego określ pozycję każdego zarodka.Dostosuj głębokość Z dla każdego zarodka i spróbuj skierować się mniej więcej na tę samą płaszczyznę w każdym zarodku, używając zarówno laserów 4 88, jak i 5 43 nanometrów. Uzyskaj obrazy przed konwersją zdjęć. Następnie skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu konfokalnego tak, aby obrazowało każdą z wcześniej zdefiniowanych pozycji z odpowiednimi warunkami obrazowania.Co 10 lub 20 minut lub pięciogodzinny kurs fotograficzny w celu fotokonwersji białka fuzyjnego zmienia się na obiektyw 10 x i wystawia grupy zarodków na działanie światła UV z lampy rtęciowej z filtrem o długości około 300 do 400 nanometrów przy 100% mocy wyjściowej przez dwie minuty. Przesuń ostrość wzdłuż osi Z, aby zapewnić jednolitą konwersję zdjęć po konwersji zdjęć. Natychmiast przełącz się z powrotem na obiektyw 25x lub 40x i potwierdź, że poprzednio zdefiniowane pozycje są nadal dokładne.Jeśli szalka przesunęła się podczas konwersji zdjęcia, ponownie określ pozycje zarodków. Rozpocznij kurs czasu obrazowania i pozwól mu działać przez pięć godzin. Zwróć uwagę na czas, jaki upłynął między konwersją zdjęcia a rozpoczęciem obrazowania dla każdego zarodka.Od czasu do czasu sprawdzaj eksperyment i monitoruj poziom pożywki Danielle, dodając więcej, jeśli to konieczne. Zacznij od wizualnej kontroli zestawów danych dotyczących przebiegu czasu z każdego zarodka. Odrzuć zestawy danych z zarodków, które zmarły podczas obrazowania, które uległy znacznemu przesunięciu, które mają bardzo niski poziom sygnału konwersji zdjęć lub które zawierają obszary komórek, które wyglądają nietypowo i które przestały się poruszać i dzielić.Korzystając z pakietu oprogramowania opartego na Pythonie, PI F DAP tworzy maskę przy użyciu sygnału Alexa 4 88, który jest ściśle wewnątrzkomórkowy. Aby oddzielić wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy sygnał konwersji zdjęć, nałóż maskę na odpowiedni obraz kanału czerwonego, aby zapobiec uwzględnianiu pikseli wewnątrzkomórkowych. Obliczając średnią intensywność zewnątrzkomórkową w celu zmierzenia średniej intensywności wewnątrzkomórkowej, odwróć maskę, wyświetl wygenerowane zamaskowane obrazy i wizualnie je sprawdź, a następnie odrzuć zestawy danych, w których maski nie odróżniają dokładnie przestrzeni wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej.Użyj PI F DAP, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej dla każdego obrazu. Następnie dopasuj dane fluorescencji, jak pokazano tutaj, zgodnie z wytycznymi w protokole tekstowym i oblicz białko zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe. Okres półtrwania tau od współczynnika klirensów.Zez Constance K jest wydzielanym białkiem, które indukuje ekspresję genów endodermalnych mis podczas embriogenezy danio pręgowanego. W tym eksperymencie zarodkom wstrzyknięto jednocześnie dekstran Alexa 4 88 i mRNA kodujący zeza DENDRA dwa i poddano testowi F DAP. Jak pokazano tutaj, intensywność sygnału przekształconego w zdjęcie zewnątrzkomórkowe zmniejsza się z czasem.Za pomocą PI F dap wygenerowano zewnątrzkomórkowe profile intensywności z 23 zarodków, a dane wyposażono w model klirensu pierwszego rzędu. Wyniki wskazują na średni okres półtrwania tau wynoszący 116 minut. Podobne profile intensywności i białka.Okresy półtrwania uzyskiwano, gdy odstępy między obrazowaniem wynosiły 10 lub 20 minut. Sugerowanie, że wybielanie zdjęć lub niezamierzona konwersja zdjęć nie przyczyniły się znacząco do zmian intensywności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać zaniku fluorescencji po konwersji zdjęć.Do pomiaru in vivo. Okresy półtrwania fotokonwertowalnych białek fuzyjnych w żywych zarodkach danio pręgowanego.

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ocena stabilności białka w żywych zarodkach danio prążkowanego za pomocą zanikającej fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Naucz się mierzyć stabilność białek w żywych zarodkach Danio rerio za pomocą techniki FDAP. Ta metoda pozwala określić czas połowicznego zaniku białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Przeglądaj więcej filmów