Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi
May 26th, 2026
Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o >90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.
Celem tych badań jest efektywne i szybkie wyizolowanie komórek z tkanki tłuszczowej. Tradycyjne trawienie to koszt czasu i może być nadmiernie trawione. Nasz pomiar enzymów i fal mechanicznych zapewnia łagodną dyspersję i skraca czas izolacji.
Na początek włóż kawałek podskórnej tkanki tłuszczowej uśpionej świni do naczynia do hodowli. Rozciąć wzdłuż naturalnej płaszczyzny między tkanką tłuszczową a skórą skórną, aby uzyskać kompletną warstwę ULB o grubości dwóch do trzech milimetrów. Przepłukaj ULB raz w lodowatej sterylnej soli fizjologicznej.
Po rozerwaniu naczynia do hodowli sterylnej waż tkankę na wstępnie sterylnej wybice. Na każde 1,8 grama tkanki dodaj 10 mililitrów lodowatego buforu D-Hanka i utrzymuj tkankę całkowicie zanurzoną. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby zidentyfikować i usunąć wszystkie widoczne naczynia krwionośne z tkanek.
Usuń wszelkie tkanki łączne i włókniste. Wyrzuć usunięte materiały do wyznaczonych pojemników na zagrożenia biologiczne. Przepłucz tkankę w buforze D-Hanka, aby usunąć resztki krwi i zanieczyszczeń.
Po rozerwaniu naczynia zważ tkankę w naczyniu do hodowli sterylnej na wstępnie sterylnej równowadze. Przenieś 1,8 grama fragmentów tkanki płukanej do sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Do probówki dodaj 800 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego tkanek typu A.
Użyj sterylnych nożyczek okulistycznych, aby pokroić tkankę w tubie na kawałki o wielkości około jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Przenieś tkankę mieloną wraz z otaczającym buforem do nowej rurki mikrowirówki. Dodaj do rurki 200 mikrolitrów środka dysocjacyjnego tkanek typu A.
Delikatnie obróć i potrząśnij ręką tubką trzy razy, aby wymieszać zawartość. Upewnij się, że fragmenty tłuszczu są całkowicie zanurzone w roztworze dysocjacyjnym. Sprawdź, czy korek rurki jest szczelnie zamknięty.
Włóż tubkę do metalowej kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez pięć do dziesięciu minut. Przenieś częściowo strawioną tkankę tłuszczową w buforze do sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, przeznaczonej do systemu dysocjacji mechanicznej. Uruchom gotowy program dla tkanki tłuszczowej, aby wykonać dysocjację mechaniczną za pomocą fali sinusoidalnej o częstotliwości 200 Hz.
Zbierz zawiesinę ogniwową i przepuścisz ją przez sitko ogniwa o średnicy 200 mikrometrów do nowej rurki wirówki 50 milimetrów. Dodaj do sita pięć mililitrów roztworu D-Hank do wstępnego schładzania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przepłucz sitko dwa razy roztworem D-Hank.
Wiruj zawiesina z filtrowanych ogniw przy 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj sterylnej pipety pasteura do aspiracji i odrzucenia nadmiarowej warstwy lipidowej, pozostawiając jeden mililitr buforu chroniącego warstwę adipocytów. Zbierz drugą warstwę zawierającą adipocyty, nie naruszając trzeciej i czwartej warstwy.
Aspiruj i odrzucaj trzecią warstwę. Dodaj jeden mililitr buforu D.Hanka do dolnej granulki zawierającej frakcję naczyniową stromalną, czyli SVF. Delikatnie zawiesz osad komórki w buforze, aby uzyskać stężenie komórek od dwóch do pięciu razy 10, do mocy sześciu komórek na mililitr.
Przygotuj zawiesinę ogniwa SVF w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. Trzymaj zawieszenie na lodzie do czasu użycia. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwa SVF oraz 10 mikrolitrów roztworu 0,4% trypan blue w sterylnej mikrowirówce o pojemności 0,5 mililitra.
Delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy razy. Przelej 10 mikrolitrów mieszaniny barwionych komórek na szkiełko liczące, odpowiednie dla automatycznego licznika komórek. Sprawdź, czy próbka wypełnia komorę całkowicie bez przepełnienia.
Włóż slajd liczący do automatycznego licznika komórek. Wybierz typ testu trypanowego niebieskiego i w razie potrzeby dostosuj zakres stężenia komórek. Naciśnij liczenie, aby rozpocząć automatyczne liczenie komórek.
Monitoruj obrazy z komory liczącej i obserwuj automatyczne rozróżnienie komórek żywych i martwych. Zapisz procent żywotności komórek oraz łączną liczbę żywotnych komórek wyświetlanych na ekranie instrumentów. Wykonaj trzy niezależne pomiary dla każdej próbki.
Oblicz średnią żywotność i wydajność komórek na gram tkanki tłuszczowej. Przygotuj roztwór barwniczy z pięcioma mikrogramami na mililitr huksa oraz jednym mikromolowym BODIPPY w D.Hank's. Inkubuj izolowane adipocyty w roztworze barwiącym przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Do przygotowania szkiełek do fluorescencji stosuj własnoręcznie wykonany, przyjazny adipocytom system szkiełek do mikroskopii fluorescencyjnej. Domowy system montażu przyjazny dla adipocytów umożliwił równomierny rozkład nienaruszonych adipocytów do wyraźnego obrazowania. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod prowadzących do stłoczonych, wielowarstwowych układów, wyekstrahowane adipocyty wykazywały nienaruszoną strukturę i prawidłową morfologię.
Wskaźnik przeżycia adipocytów uzyskanych metodą dysocjacji mechanicznej był istotnie wyższy w porównaniu z tradycyjną metodą hydrolizy enzymatycznej. Oczyszczone i hodowane komórki macierzyste pochodzące z tłuszczu wykazywały jednolitą morfologię fibroblastową z wydłużonymi, wrzecionowatymi komórkami ułożonymi w uporządkowany sposób. Większość komórek pozostała niezabarwiona, co wskazuje na żywotność, podczas gdy tylko niewielka część była zabarwiona na niebiesko, co oznaczało martwe komórki.
Protokół ten pozwala badaczom porównywać izolowane cechy komórek w magazynie tłuszczowym. Izolowane SVF z protokołu mogą być wykorzystywane do budowy organoidów oraz oczyszczania komórek macierzystych tłuszczowych. Przyszłe badania mogą jeszcze bardziej zoptymalizować metodę izolacji, biorąc pod uwagę różnice tkanki tłuszczowej w macierzy zewnątrzkomórkowej w różnych składach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a rapid and efficient protocol for isolating adipose-derived stem cells (ADSCs) from adipose tissue using a combination of enzymatic digestion and mechanical wave-based dissociation. The method, exemplified by the SoniConvert system, significantly reduces processing time, improves cell viability, and yields high-quality single-cell suspensions suitable for downstream applications in regenerative medicine and research.
Key Study Components
Area of Science
- Regenerative medicine
- Cell biology
- Stem cell isolation
Background
- ADSCs are valuable for tissue repair, disease modeling, and cell therapy due to their multipotency and immunomodulatory properties.
- Traditional isolation methods are time-consuming (1–3 hours), yield low cell viability (<70%), and suffer from batch variability.
- Efficient, reproducible isolation of high-viability ADSCs is critical for research and clinical translation.
- Mechanical wave-based dissociation offers a potential solution to these limitations.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a rapid, gentle, and reproducible protocol for isolating ADSCs from adipose tissue.
- To compare the new method's efficiency and cell viability with traditional enzymatic digestion protocols.
- To provide a platform compatible with various downstream applications, including organoid construction and cell culture.
Methods Used
- Harvesting and preparation of subcutaneous adipose tissue from euthanized pigs.
- Enzymatic digestion using a tissue-specific dissociation buffer and agent.
- Mechanical dissociation via a preset program using a 200 Hz sinusoidal wave (SoniConvert system).
- Filtration, centrifugation, and separation of stromal vascular fraction (SVF) and adipocytes.
- Cell viability assessment using trypan blue staining and automated cell counting.
- Fluorescence staining and microscopy to assess adipocyte morphology and integrity.
Main Results
- The core isolation process is completed in approximately 30 minutes, representing a >90% reduction in processing time compared to conventional methods.
- Cell viability of isolated ADSCs is 80–95%, significantly higher than traditional protocols.
- The method yields intact, morphologically normal adipocytes and uniform, viable ADSCs.
- Single-cell suspensions are suitable for primary culture, flow cytometry, cytotoxicity assays, and organoid construction.
Conclusions
- The combined enzymatic and mechanical wave-based protocol enables rapid, high-viability isolation of ADSCs.
- This approach reduces variability and preserves cell integrity, facilitating adipose tissue research and clinical applications.
- Future optimization may further improve isolation efficiency across different adipose depots.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Porcine Adipose Tissue Harvesting and Preparation
1:36
Dissociation of Adipose Tissue for Cell Isolation
3:08
Isolation of Adipocyte and Stromal Vascular Fractions (SVF)
4:21
Analysis of SVF Cell Suspension and Adipocyte Samples
6:16
Results
7:23
Conclusion
