Name: Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji progenitorów włóknisto-adipogennych (FAP) i miogennych (MP) z mięśni szkieletowych szczura. Protokół wykorzystuje kolagenazę i cytometrię przepływową do identyfikacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Obiektom Cytometrii Przepływowej na Uniwersytecie w Ottawie oraz Centrum Badawczemu Keenan dla Nauk Biomedycznych (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto za ich wiedzę i wskazówki w zakresie optymalizacji protokołu cytometrii przepływowej/FACS przedstawionego w tym manuskrypcie. Praca ta została sfinansowana przez Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) na rzecz JB.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Zoptymalizowany, zwalidowany protokół izolacji FAP dla mięśni szczurów jest niezbędny dla badaczy, którzy chcą badać modele urazów, które nie są wykonalne u myszy z przyczyn biologicznych lub technicznych. Na przykład myszy nie są optymalnym modelem zwierzęcym do badania przewlekłych urazów miejscowych lub neurodegeneracyjnych, takich jak długotrwałe odnerwienie. Z biologicznego punktu widzenia krótka żywotność i szybkie starzenie się myszy utrudniają dokładne wyznaczenie mięśni równości z powodu odnerwienia spowodowaneg...

Fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) to populacja rezydujących multipotencjalnych komórek progenitorowych w mięśniach szkieletowych, które odgrywają kluczową rolę w homeostazie, naprawie i regeneracji mięśni, a także pośredniczą w patologicznych reakcjach na uszkodzenie mięśni. Jak sama nazwa wskazuje, FAP zostały pierwotnie zidentyfikowane jako populacja progenitorowa z potencjałem do różnicowania się w fibroblasty i adipocyty1 i miały być kluczowymi mediatorami infiltracji włóknisto-tłuszczowej mięśni szkieletowych w przewlekłych urazach i chorobach. Dalsze badania wykazały, że FAP są dodatkowo zdolne do osteogenezy i chondrogenezy2,3,4. W związku z tym są one szerzej zapisywane w literaturze jako przodkowie mezenchymalni lub zrębowiskowe3,5,6,7,8. W ostrym uszkodzeniu mięśni szkieletowych FAP pośrednio wspomagają regeneracyjną miogenezę poprzez przejściową proliferację, aby zapewnić korzystne środowisko dla aktywowanych komórek satelitarnych mięśni i ich dalszych miogennych odpowiedników progenitorowych (MPS) 1,9,10. Równolegle z udaną regeneracją, FAP przechodzą apoptozę, przywracając swoją liczebność do poziomów wyjściowych1,9,10,11. Natomiast w przewlekłych urazach mięśni FAP zastępują sygnały proapoptotyczne, co skutkuje ich trwałością9,10,11 i nieprawidłową naprawą mięśni.
Badania in vivo oceniające komórkowe i molekularne mechanizmy, za pomocą których FAP pośredniczą w reakcjach mięśni, wykorzystywały do tej pory mysie modele zwierzęce1,7,9,10,11,12,13,14. Podczas gdy genetycznie modyfikowane myszy są potężnymi narzędziami do wykorzystania w tych analizach, mały rozmiar zwierzęcia ogranicza dostępność tkanek do badań w długoterminowych modelach miejscowych urazów, w których atrofia mięśni może być głęboka, takich jak odnerwienie pourazowe. Ponadto pomiar siły mięśniowej i funkcji fizycznych wymaga pomiarów ex vivo lub in situ, które wymagają przerwania myszy, lub metod in vivo, które wymagają operacji i/lub znieczulenia ogólnego, aby umożliwić ocenę zdolności skurczowej mięśni15,16,17,18,19,20. U szczurów istnieją dobrze zweryfikowane i globalnie wykorzystywane analizy funkcjonalne mięśni, a także analizy bardziej złożonych zachowań motorycznych, takich jak analiza chodu (np. wskaźnik funkcji kulszowych, analiza CatWalk) i są one wykonywane u zwierząt obudzonych i poruszających się spontanicznie21,22,23,24. To dodatkowo optymalizuje zasady minimalnej zachorowalności w doświadczeniach na zwierzętach oraz liczby wykorzystywanych zwierząt badawczych. W ten sposób szczur zapewnia badaczowi FAP dodatkową elastyczność w postaci większej objętości uszkodzonych mięśni do analiz białek i komórek oraz zdolność do przeprowadzania seryjnych ocen statycznej i dynamicznej aktywności funkcjonalnej i zachowań kompleksu mięśniowego u czujnego zwierzęcia.
FAP zostały przede wszystkim zidentyfikowane i wyizolowane z próbek całych mięśni za pomocą cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Są to testy laserowe, które są w stanie zidentyfikować wiele określonych populacji komórek na podstawie charakterystycznych cech, takich jak rozmiar, ziarnistość i specyficzna kombinacja powierzchni komórki lub markerów wewnątrzkomórkowych25. Jest to bardzo korzystne w badaniu układu narządów, takiego jak mięśnie szkieletowe, ponieważ homeostaza i regeneracja są złożonymi, wieloczynnikowymi procesami koordynowanymi przez wiele typów komórek. W badaniu przeprowadzono nowatorskie badanie, w którym zidentyfikowano FAP, a także MP, przy użyciu metod cytometrii przepływowej w myszy1. Wykazali, że FAP mają charakter mezenchymalny, ponieważ brakuje im antygenów powierzchniowych specyficznych dla komórek pochodzenia śródbłonkowego (CD31), krwiotwórczego (CD45) lub miogennego (Integryna-α7 [ITGA7]), ale wykazują ekspresję mezenchymalnego markera komórek macierzystych Sca-1 (antygen komórek macierzystych 1)1 i różnicują się w hodowli na komórki fibrogenne i adipogenne. Inne badania wykazały udaną izolację mezenchymalnych komórek progenitorowych w mięśniach w oparciu o ekspresję alternatywnego markera komórek macierzystych, receptora alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα)2,7,8, a dalsza analiza wykazała, że prawdopodobnie jest to ta sama populacja komórek, co FAPs3. FAP są obecnie powszechnie identyfikowane w cytometrii przepływowej przy użyciu Sca-1 lub PDGFRα jako markera selekcji pozytywnej1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31. Stosowanie PDGFRα jest jednak preferowane dla tkanek ludzkich, ponieważ bezpośredni ludzki homolog mysiego Sca-1 nie został jeszcze zidentyfikowany32. Ponadto inne białka powierzchniowe komórek zostały zgłoszone jako markery MP (np. VCAM-1), stanowiąc potencjalną alternatywę dla ITGA7 jako wskaźnika komórek linii miogennej podczas izolacji FAPs33.
Chociaż cytometria przepływowa/FACS jest potężną metodologią badania roli i potencjału patogennego FAP w mięśniach szkieletowych1,9,10,11,13,29, jest ograniczony technicznie przez specyfikę i optymalizację wymaganych odczynników. Ponieważ cytometria przepływowa i izolacja FAP została opracowana i przeprowadzona na mysich modelach zwierzęcych1,9,10,11,29, stanowi to wyzwanie dla badaczy, którzy chcą badać FAP w innych organizmach modelowych. Wiele czynników, takich jak optymalna wielkość tkanki do przetworzenia, a także swoistość i dostępność odczynników i/lub przeciwciał, różni się w zależności od użytego gatunku.
Oprócz technicznych przeszkód w badaniu FAPów w nowym modelu zwierzęcym, były one w dużej mierze badane w ostrym, toksycznym otoczeniu - zwykle za pomocą domięśniowego zastrzyku chemicznego lub kardiotoksyny. Ocena długoterminowej dynamiki FAP ogranicza się przede wszystkim do oceny dystrofii mięśniowej Duchenne'a, przy użyciu modelu myszy mdx9,10,11, oraz modeli złożonych uszkodzeń mięśni, takich jak masywne naderwanie stożka rotatorów, gdzie równoczesne przecięcie ścięgna i odnerwienie jest wykonywane na mięśniach barku26,27,28. Reakcja FAPs na wyłączną zniewagę przewlekłego odnerwienia pourazowego, częstego zjawiska w wypadkach przy pracy w przemyśle ciężkim, rolnictwie i urazach okołoporodowych (uraz splotu ramiennego)34,35,36,37 ze znaczną zachorowalnością, nie została tak dobrze scharakteryzowana, często ograniczona do krótkoterminowego przedziału czasowego11,38.
Opisujemy metodę identyfikacji i izolowania FAPów i MP od zdrowych, jak również poważnie zanikowych i zwłóknieniowych mięśni szkieletowych u szczurów. Po pierwsze, wykazano identyfikację CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAP i CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MP przy użyciu protokołu barwienia trawienia tkanek i cytometrii przepływowej, a następnie walidację naszych wyników przeprowadza się poprzez hodowlę i barwienie immunocytochemiczne komórek izolowanych FACS. Korzystając z tej metody, opisujemy również nowy przebieg czasowy FAP w długoterminowym izolowanym modelu uszkodzenia odnerwionego u szczura.

<table><tbody><tr><td>5 ml polipropylenowa probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalki do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>130185</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe 12 mm, nr 2</td><td>VWR</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Beckton Dickenson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>FroggaBio</td><td>91014</td><td></td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 20 Beckton</td><td>Dickenson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta serologiczna</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>40&mikro; m sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific 22363547</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>FroggaBio</td><td>TB50</td><td></td></tr><tr><td>AbC Całkowita kompensacja przeciwciał Koraliki&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu, odczynnik klasy</td><td>Bioshop</td><td>AMC303.500</td><td></td></tr><tr><td>APC Conjugation Kit, 50-100&micro; g</td><td>Biotium</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex Wodne podłoże montażowe</td><td>Merck</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>Biolaminina 411 LN</td><td>Biolamina</td><td>LN411</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Bioshop</td><td>CCL444.500</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Plus Absolutne koraliki do liczenia</td><td>ThermoFisher</td><td>C36995</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Milipor Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalne</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>(+)4,5 g/L D-Glukoza (+)L-glutamina (+)110 mg/L Pirogronian sodu </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>FisherScientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>FACSClean Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FACSRinse Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td></td><td></td>340346</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa Płyn osłonkowy</td><td>Beckton Dickenson</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Beckton Dickenson</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Fluorescencyjne podłoże montażowe</td><td>Dako</td><td>S302380-2 Koza anty-mysie</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 555 Przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10 Media</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>11550043</td><td>(+) Czerwień fenolowa (+) L-glutamina (-) HEPES</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (1X)</td> <td>Wielokomórkowa</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica końska</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Reichert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, minimum 99,5% miareczkowanie</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>ThermoFisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki transformujący czynnik wzrostu &beta; 1 (hTGF-&beta; 1)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8915LF</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5879</td><td>Znany również jako 3-izobutylo-1-metyloksantyna</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Znany również jako 2-propanol</td></tr><tr><td>Lewis Rat, samica</td><td>Charles River Kingston</td><td>004 (kod szczepu)</td> <td>200-250 gramów używany</td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20 Cytometr laboratoryjny</td><td>Beckton Dickenson</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5417R</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Mysz Anti-CD31::FITC Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab33858</td><td>Klon TLD-3A12</td></tr><tr><td>Mysz Anti-CD45::FITC Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>202205</td><td>Klon myszy OX-1</td></tr><tr><td>Anti-CD106::P E Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>200403</td><td>Znany również jako VCAM-1</td></tr><tr><td>Mysie badania rozwojowe przeciwciał anty-MHC</td><td>Bank hybrydoma (DSHB)</td><td>N/A</td><td>Znany również jako MF20</td></tr><tr><td>Mysie badania rozwojowe przeciwciał anty-PAX7</td><td>Bank Hybridoma (DSHB)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina, 10</td>% <td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Millipore Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do koniugacji PE-Cy7 Abcam</td><td>ab102903</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4 (1X)</td> <td>Gibco</td><td>10010-023</td> <td>(-) Chlorek wapnia (-) Chlorek magnezu </td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu, klasa odczynnika</td><td>Bioshop</td><td>PBC401.250</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw fibroblastom króliczym 1 (FSP-1)</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-32347</td><td>FSP-1 znany również jako S100A4</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało</td> <td>anty-integrynowe-a7Abcam</td><td>ab203254</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-lamininowe</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-perylipinowe-1</td><td>Abcam</td><td>ab3526</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Sca-1</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB4336</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-kolagenowe typu I królika</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td>Znany również jako Col1a1</td></tr><tr><td>Rekombinowany anty-PDGFR królika Przeciwciało alfa</td><td>Abcam</td><td>ab203491</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>Gibco</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazon</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (fap) i miogennych progenitorów (mp) w mięśniach szkieletowych u szczura

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenne Progenitory (FAP) to rezydujące komórki śródmiąższowe w mięśniach szkieletowych, które wraz z miogennymi przodkami (MP) odgrywają kluczową rolę w homeostazie, urazach i naprawie mięśni. Obecne protokoły identyfikacji i izolacji FAP, cytometria przepływowa/sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) oraz badania oceniające ich funkcję in vivo, zostały przeprowadzone wyłącznie na myszach. Większy wrodzony rozmiar szczura pozwala na bardziej wszechstronną analizę FAP w modelach uszkodzeń mięśni szkieletowych, zwłaszcza w mięśniach poważnie zanikowych lub gdy badacze wymagają znacznej masy tkankowej do przeprowadzenia wielu dalszych testów. Szczur dodatkowo zapewnia większy wybór testów funkcjonalnych mięśni, które nie wymagają uspokojenia ani poświęcenia zwierząt, minimalizując w ten sposób zachorowalność i wykorzystanie zwierząt poprzez umożliwienie seryjnych ocen. Protokoły cytometrii przepływowej/FACS zoptymalizowane dla myszy są specyficzne dla gatunku, w szczególności ograniczone charakterystyką dostępnych na rynku przeciwciał. Nie zostały one zoptymalizowane pod kątem oddzielania FAP od szczurów lub silnie zwłókniałych mięśni. Opracowano protokół cytometrii przepływowej/FACS do identyfikacji i izolacji FAP i MP zarówno ze zdrowych, jak i odnerwionych mięśni szkieletowych szczurów, opierając się na zróżnicowanej ekspresji markerów powierzchniowych CD31, CD45, Sca-1 i VCAM-1. Ponieważ specyficzne dla szczurów, zwalidowane cytometrią przepływową przeciwciała pierwszorzędowe są poważnie ograniczone, przeprowadzono wewnętrzną koniugację przeciwciała skierowanego przeciwko Sca-1. Korzystając z tego protokołu, potwierdzono udaną koniugację Sca-1, a identyfikację FAP i MP za pomocą cytometrii przepływowej zwalidowano za pomocą hodowli komórkowej i barwienia immunologicznego FAP i MP izolowanych przez FACS. Na koniec przedstawiamy nowy przebieg czasowy FAP w przedłużonym (14 tygodni) modelu denerwacji szczurów. Metoda ta daje badaczom możliwość badania FAP w nowym modelu zwierzęcym.

Identyfikacja FAP i MP za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem nowego panelu przeciwciał zawierającego Sca-1 i VCAM-1 
Strategia bramkowania w celu identyfikacji FAP w mięśniach szczura opiera się na protokołach cytometrii przepływowej dla myszy29, w których wyodrębnia się komórki CD31-dodatnie (śródbłonkowe) i CD45-dodatnie (hematopoetyczne) (określane jako linia [Lin]), a następnie analizuje profil fluorescencyjny ...

Ten protokół przedstawia metodę izolowania komórek progenitorowych fibro-adipogennych (FAP) i miogennych (MP) z mięśni szkieletowych szczurów. Wykorzystanie szczura w modelach urazów mięśni zapewnia zwiększoną dostępność tkanek z mięśni zanikowych do analizy oraz szerszy repertuar zwalidowanych metod oceny siły mięśni i chodu u zwierząt poruszających się swobodnie.

Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Ponieważ FAP są mediatorami regeneracji mięśni i patologicznego zwłóknienia, nasz protokół pozwala na scharakteryzowanie dynamiki FAP po urazie mięśni i izolację FAP do badań in vitro lub ex vivo. Do tej pory badania prowadzono wyłącznie na FAP wyizolowanych od myszy. Nasz protokół umożliwia skuteczną izolację FAP od większego szczura, zapewniając znacznie większą dostępność tkanek do dalszych testów.Wydłużony czas przetwarzania tkanek może negatywnie wpłynąć na żywotność FAPs. Jeśli jednocześnie przetwarzanych jest wiele próbek, zaleca się, aby dwóch operatorów wykonywało protokół jednocześnie, aby zmaksymalizować żywotność izolowanych komórek. Zacznij od umieszczenia pobranej tkanki mięśniowej w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek.Delikatnie rozerwij i zmiel tkankę kleszczami i usuń tkankę łączną, aby uzyskać około trzech do czterech milimetrów sześciennych kawałków. Przenieś tkankę minstera do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej sześć mililitrów DMEM i 1% penicyliny-streptomycyny. Następnie aktywuj 365 mikrolitrów roztworu kolagenazy II, dodając 10 mikrolitrów 300-milimolowego roztworu chlorku wapnia.Dodaj aktywowany roztwór kolagenazy II

identification-isolation-characterization-fibro-adipogenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Ten protokół opisuje izolację mięśni szkieletowych i mięśni sercowych włóknisto-adipogennych (FAP) od myszy kolczastej (Acomys) poprzez dysocjację enzymatyczną i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. FAP uzyskane z tego protokołu mogą być skutecznie rozszerzane i różnicowane do miofibroblastów i adipocytów.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Poznaj metodę izolacji progenitorów włóknisto-adipogennych (FAP) i miogennych (MP) z mięśni szkieletowych szczura. Protokół wykorzystuje kolagenazę i cytometrię przepływową do identyfikacji komórek.

Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura

Przeglądaj więcej filmów