Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura

Ponieważ FAP są mediatorami regeneracji mięśni i patologicznego zwłóknienia, nasz protokół pozwala na scharakteryzowanie dynamiki FAP po urazie mięśni i izolację FAP do badań in vitro lub ex vivo. Do tej pory badania prowadzono wyłącznie na FAP wyizolowanych od myszy. Nasz protokół umożliwia skuteczną izolację FAP od większego szczura, zapewniając znacznie większą dostępność tkanek do dalszych testów.

Wydłużony czas przetwarzania tkanek może negatywnie wpłynąć na żywotność FAPs. Jeśli jednocześnie przetwarzanych jest wiele próbek, zaleca się, aby dwóch operatorów wykonywało protokół jednocześnie, aby zmaksymalizować żywotność izolowanych komórek. Zacznij od umieszczenia pobranej tkanki mięśniowej w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek.

Delikatnie rozerwij i zmiel tkankę kleszczami i usuń tkankę łączną, aby uzyskać około trzech do czterech milimetrów sześciennych kawałków. Przenieś tkankę minstera do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej sześć mililitrów DMEM i 1% penicyliny-streptomycyny. Następnie aktywuj 365 mikrolitrów roztworu kolagenazy II, dodając 10 mikrolitrów 300-milimolowego roztworu chlorku wapnia.

Dodaj aktywowany roztwór kolagenazy II do zawiesiny tkankowej, aby uzyskać końcowe stężenie 250 jednostek na mililitr. Inkubować probówki w wytrząsarce przez godzinę i w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 240 x g z ręcznym mieszaniem co 15 minut, aby usunąć tkankę przylegającą do boku probówki. Po godzinie inkubacji dodać do próbki 100 mikrolitrów kolagenazy II i 50 mikrolitrów dypazy.

Następnie należy pobrać próbki pipetą 15 do 20 razy pipetą serologiczną, aż roztwór będzie jednorodny. Ponownie inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 240 x g, mieszając ręcznie co 15 minut. Powoli ścinaj próbki roztworu mięśniowego przez 20-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 20 przez 10 cykli.

Następnie umieść sitko do komórek o średnicy 40 mikronów na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i zwilż je, pipetując pięć mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Pipetować próbkę po jednym mililitrze na raz przez sitko. Po przefiltrowaniu całej próbki umyj sitko komórkowe DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną, aby uzyskać całkowitą objętość próbki do 25 mililitrów.

Podziel objętość próbki równomiernie na dwie 15-mililitrowe stożkowe probówki i odwiruj w temperaturze 15 stopni Celsjusza, 400 x g przez 15 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy RBC w temperaturze pokojowej przez siedem minut. Następnie dodaj dziewięć mililitrów buforu do mycia, aby doprowadzić objętość do 10 mililitrów i odwirować w temperaturze 15 stopni Celsjusza, 400 x g przez 15 minut.

Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do przemywania wody. Przenieś odpowiednią objętość komórek do oddzielnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i wymieszaj ją z niebieskim barwnikiem trypanowym. Policz żywe komórki pod mikroskopem świetlnym za pomocą hemocytometru.

W przypadku cytometrii przepływowej przenieś od jednego do 2 milionów komórek na próbkę eksperymentalną do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Doprowadzić objętość próbki do jednego mililitra za pomocą buforu do przemywania i umieścić probówkę na lodzie. Skonfiguruj wszystkie kontrolki dla eksperymentu.

W przypadku kontroli komórek należy podsycić od 500 000 do 1 miliona komórek w jednym mililitrze buforu płuczącego w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i umieścić ją na lodzie. Jeśli doświadczenie jest przeprowadzane po raz pierwszy, należy również dołączyć jednobarwne zawiesiny komórek. Aby skonfigurować kontrolę koralików, dodaj około 150 000 dodatnich koralików kompensacyjnych do każdej oznaczonej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Przygotuj kontrolę żywotności, przenosząc połowę objętości komórki z probówki żywotności do odświeżenia 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki oznaczonej jako martwa. Inkubuj martwą probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, a następnie umieść ją na lodzie. Po inkubacji włóż martwe komórki z powrotem do probówki żywotności.

Zawiesiny jednokomórkowe, w tym próbki doświadczalne i kontrolne należy odwirować w temperaturze 500 x g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek w 100 mikrolitrach buforu do przemywania po zassaniu supernatantu. Dodać przeciwciała zgodnie z warunkami kontrolnymi lub eksperymentalnymi i delikatnie przesunąć próbkę, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Następnie inkubuj je na lodzie w ciemności przez 15 minut.

W celu uzyskania kulek kompensacyjnych inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Doprowadzić objętość każdej próbki do jednego mililitra, dodając 900 mikrolitrów buforu płuczącego do zawiesiny jednokomórkowej i 900 mikrolitrów PBS do kontroli kulek kompensacyjnych. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe przy 500 x g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, a kontrole kulek kompensacyjnych przy 300 x g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Po odwirowaniu próbek odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 300 mikrolitrach buforu do płukania, a kontrole perełkowe w 300 mikrolitrach PBS i 150 000 ujemnych kulek kompensacyjnych. Próbki komórek należy przechowywać na próbkach lodu i kulek w temperaturze pokojowej pod folią aluminiową. Kontynuuj akwizycję cytometrii przepływowej, konfigurując strategię bramkowania w celu identyfikacji włóknisto-adipogennych komórek progenitorowych i miogennych komórek progenitorowych.

W analizie reprezentatywnej potwierdzono udaną koniugację przeciwciała Sca-1 APC z pojedynczym barwieniem kulek kompensacyjnych i zawiesin komórkowych generowanych ze zdrowego mięśnia brzuchatego łydki szczura. Pięć różnych stężeń Sca-1 APC miareczkowano na zawiesinach jednokomórkowych, a optymalne stężenie przeciwciała określono na podstawie największej intensywności fluorescencji przy minimalnym barwieniu tła. Identyfikacje FAP i MP metodą cytometrii przepływowej u szczurów mięsnych łydek przeprowadzono przy użyciu przedstawionej tutaj strategii bramkowania.

Próbki zostały najpierw bramkowane, aby wykluczyć zanieczyszczenia w liczeniu koralików. Komórki zostały następnie bramkowane, aby wykluczyć dublety zarówno według charakterystyki rozproszenia przedniego, jak i bocznego. Żywotność otrzymanych komórek oceniano poprzez barwienie SYTOX Blue.

Ujemne singlelety SYTOX Blue oceniano pod kątem CD31 i CD45 w celu wykluczenia frakcji Lin+. Oceniono populację Lin. Komórki, które były pojedyncze dodatnie dla Sca-1, zostały oznaczone jako FAP, a komórki, które były pojedynczo dodatnie dla VCAM-1, zostały oznaczone jako MP.

W przypadku koimmunobarwienia bezpośrednio po sortowaniu, świeżo wyizolowana populacja FAP wykazywała dodatnie barwienie na PDGFRalpha bez zanieczyszczenia komórkami Pax7 dodatnimi. I odwrotnie, posortowana populacja MP wybarwiona na obecność Pax7 z brakiem komórek PDGFRalfa-dodatnich. FAP wykazały zróżnicowane fibroblasty i adipocyty w dniu 12 w adipogennych pożywkach różnicujących z ekspresją odpowiednio białka 1 specyficznego dla fibroblastów i perylipiny 1.

Obecność neutralnych trójglicerydów i lipidów z dojrzałych adipocytów była widoczna przy barwieniu czerwienią olejową O. Dodatkowo FAP wykazały obecność kolagenu typu I i brak zanieczyszczających miocytów. MP wyhodowane w pożywkach różnicowania miogennego w dniu 12 wykazywały obecność dojrzałych miocytów i połączonych wielojądrowych miotub oraz były wolne od fibroblastów i zanieczyszczenia adipocytów.

Stosując tę technikę do izolowania żywych komórek do długotrwałej hodowli, naukowcy muszą zapewnić stosowanie techniki aseptycznej, a jednocześnie wydajną pracę, aby zapewnić dobrą żywotność komórek.