Name: Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Poznaj techniki pobierania próbek z modeli świń do biobankowania. Naucz się metody zanurzeniowej do pomiaru objętości tkanek oraz techniki orientatora do generowania izotropowych przekrojów dla nieobciążonej analizy morfologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Lisie Pichl za doskonałą pomoc techniczną.

<ol><li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li>
<li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munich+MIDY+Pig+Biobank%3A+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li>
<li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li>
<li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li>
<li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+first+pig+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li>
<li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li>
<li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGundersen%2C+HJG+%22Haschek+and+Rousseaux%27s+Handbook+of+Toxicologic+Pathology%22">Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology</a>. Haschek, W. , 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).</li>
<li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+CV+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).</li>
<li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2818.1992.tb01497.x/abstract">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li>
<li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology%3A+Planning%2C+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li>
<li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li>
<li>Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattfeldt%2C+T+%22Normale+und+pathologische+Anatomie%22">Normale und pathologische Anatomie</a>. Doerr, W., Leonhardt, H. , Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li>
<li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li>
<li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7500483">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li>
<li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li>
<li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections%3A+Relevance+for+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroQuantology%22%5BJournal%5D)">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li>
<li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+microsc%22%5BJournal%5D)">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li>
<li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone+%28GH%29-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF1%29-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709(2016).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li>
<li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6ck%2C+P+%22Romeis+Mikroskopische+Technik%22">Romeis Mikroskopische Technik</a>. , Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).</li>
<li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuvarna%2C+KS+%22Bancroft%27s+theory+and+practice+of+histological+techniques%22">Bancroft's theory and practice of histological techniques</a>. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone. 1-654 (2013).</li>
<li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://err.ersjournals.com/content/15/101/107">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li>
<li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Generowanie zbiorów próbek z biobanków z modeli świń wymaga solidnych technik i protokołów do określania objętości narządów/tkanek, powtarzalnego generowania reprezentatywnych, nadmiarowych próbek tkanek odpowiednich dla szerokiego zakresu różnych metod analizy oraz do randomizacji orientacji skrawków próbki do ilościowych analiz stereologicznych. Metody opisane w niniejszym artykule są dostosowane do wielkości narządów i tkanek świń i zostały opracowane tak, aby skutecznie sprostać tym wymaganiom...

W medycynie translacyjnej świnie są coraz częściej używane jako duże modele zwierzęce1,2,3,4,5, ze względu na kilka korzystnych podobieństw między anatomią i fizjologią świni a człowiekiem, a także dostępność uznanych metod biologii molekularnej pozwalających na tworzenie dostosowanych, Genetycznie zmodyfikowane modele świń dla szerokiego zakresu stanów chorobowych1,4.
Jednak w porównaniu do modeli gryzoni, liczba zwierząt z danego modelu świni, które mogą być dostarczone do eksperymentów w dowolnym momencie, jest ograniczona. Wynika to z okresu między pokoleniami świń wynoszącego około jednego roku oraz nakładów finansowych i czasochłonnych niezbędnych do stworzenia modeli świń i hodowli zwierząt. Dlatego też pojedyncze zwierzęta w modelu świniowym, jak również próbki, które można uzyskać od tych świń, są bardzo cenne, szczególnie jeśli bada się genetycznie zmodyfikowane modele świń i/lub długoterminowe problemy eksperymentalne (np. późne powikłania chorób przewlekłych) u osób w podeszłym wieku2,6,7.
W trakcie jakiegokolwiek badania, wykonanie dodatkowych analiz, które nie zostały zaplanowane w początkowym projekcie eksperymentalnym badania, może później okazać się istotne, np. w celu rozwiązania różnych pytań wynikających z wcześniej odkrytych nieoczekiwanych wyników. Jeżeli odpowiednie próbki do takich dodatkowych doświadczeń nie są dostępne, konieczne mogą być nieproporcjonalnie wysokie koszty i czasochłonne wydatki w celu wygenerowania dodatkowych próbek świń i tkanek. Aby być przygotowanym na takie ewentualności, za ważne podejście uważa się generowanie kolekcji biobanków z zachowanymi próbkami zapasowymi różnych narządów, tkanek lub biopłynów, ilościowo i jakościowo nadających się do szerokiego zakresu późniejszych analiz2,6,7. Uzyskując optymalne korzyści z modelu świnionego, dostępność odpowiednich próbek z biobanku oferuje również unikalną możliwość przeprowadzenia szerokiego spektrum różnych metod analizy identycznych materiałów próbek na poziomie wielonarządowym u tych samych pojedynczych zwierząt, np. poprzez dystrybucję próbek do naukowców z różnych grup roboczych zorganizowanych w sieć badawczą2, 6,7. Ponadto "perspektywiczna" strategia pobierania próbek w biobankach również przyczynia się do zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych w badaniu. Korzyści płynące z biobankowania modelu świń zostały niedawno zademonstrowane w wielonarządowym, multiomicznym badaniu, w którym analizowano krzyżowość narządów w genetycznie zmodyfikowanym modelu długotrwałej cukrzycy świń, przy użyciu próbek z monachijskiego MIDY Pig Biobank2.
Istnieją pewne obowiązkowe wymagania, które próbki z biobanków muszą zazwyczaj spełniać, aby ustalić wiarygodność i interpretowalność wyników następnie przeprowadzonych analiz. Próbki muszą być generowane w sposób powtarzalny i muszą być reprezentatywne, tj. odpowiednio odzwierciedlać interesujące cechy morfologiczne i molekularne tkanki/narządu, z którego pobrano próbki7. Aby próbki nadawały się do szerokiego zakresu dalszych analiz, muszą być pobierane w wystarczających ilościach i przetwarzane zgodnie z wymaganiami (w tym warunkami czasowymi i temperaturowymi) różnych metod analitycznych, w tym opisowych analiz histopatologicznych, takich jak kriohistologia, histologia parafiny i tworzyw sztucznych, immunohistochemia, in situ hybrydyzacja, ultrastrukturalne analizy mikroskopu elektronowego i kliniczne laboratoryjne analizy diagnostyczne, a także analizy molekularne DNA, RNA, białek i metabolitów.
Aby umożliwić ocenę szerokiego zakresu różnych ilościowych parametrów morfologicznych, takich jak liczby, objętości, długości lub powierzchnie różnych struktur tkankowych za pomocą ilościowych analiz stereologicznych, należy przygotować losowe płaszczyzny przekroju próbek histologicznych odpowiednich narządów/tkanek7,8,9,10,11. W ilościowych badaniach morfologicznych niezwykle ważne jest precyzyjne określenie całkowitej objętości tkanki, narządu lub przedziału narządowego, z którego pobrano próbki (tj. przestrzeń odniesienia)7,9,12 do obliczenia bezwzględnych ilości interesujących parametrów w danym organie, tkance lub organizmie. Ostatecznie należy określić i uwzględnić efekt obkurczania tkanek związanego z osadzaniem podczas przygotowywania skrawków histologicznych13. W związku z tym, ilościowe analizy stereologiczne, zwłaszcza próbek archiwalnych (utrwalone próbki tkanek, osadzone bloki tkankowe, skrawki histologiczne itp.) z poprzednich badań są czasami poważnie ograniczone lub nawet niemożliwe12, szczególnie jeśli nie przeprowadzono wolumetrii odpowiednich narządów/tkanek, jeśli nie zastosowano odpowiednich projektów pobierania próbek, aby zagwarantować reprezentatywne próbki, jeśli liczba i ilość dostępnych pojedynczych próbek jest niewystarczająca, lub jeżeli przetwarzanie próbek jest niezgodne z oszacowaniem ilościowego(-ych) parametru(-ów) morfologicznego(-ych) będącego(-ych) przedmiotem zainteresowania. Ze względu na wieloraki możliwych czynników wpływających, nie można jednoznacznie stwierdzić, czy materiały archiwalne są wykorzystywane do analiz różnych ilościowych parametrów morfologicznych, ale zależy to od starannej oceny każdego indywidualnego przypadku.
Tak więc, ponieważ lokalizacja, rozmiar, liczba, przetwarzanie, kierunek przycinania i orientacja próbek mogą potencjalnie wpływać na wyniki kolejnych analiz, czynniki te mają ogromne znaczenie i muszą być brane pod uwagę w eksperymentalnym projekcie każdego badania. W odniesieniu do tych aspektów i szczególnych cech anatomii świń, niedawno ustanowiono kompleksowe, szczegółowe, wielkoskalowe wytyczne dotyczące pobierania próbek dostosowane do modeli świń, stanowiące solidne odniesienie do znormalizowanego, powtarzalnego i wydajnego generowania nadmiarowych, odpowiednio przetworzonych, wysokiej jakości próbek z ponad 50 różnych narządów i tkanek świń6,7.
Opisy metodologiczne i film instruktażowy pokazany w tym artykule dostarczają szczegółowych, ilustracyjnych, zrozumiałych, krok po kroku instrukcji do praktycznego wykonywania różnych technik wolumetrii, pobierania próbek tkanek i organów świń oraz przetwarzania próbek tkanek dla różnych metod dalszej analizy. Przedstawione techniki obejmują metody określania objętości i gęstości narządów/tkanek w oparciu o zasady Archimedesa i Cavalieri9, w tym określanie wymiarów trójwymiarowego skurczu tkanki związanego z zatopieniem w różnych podłożach do zatapiania14 podczas przetwarzania do badania histologicznego, zastosowanie praktycznych metod systematycznego losowego pobierania próbek ważonych objętością, przetwarzanie pobranej tkanki Próbki do różnych kolejnych analiz7,8,9,15, oraz generowanie odpowiednio zorientowanych i przetworzonych próbek do potencjalnych ilościowych analiz stereologicznych7,8,9,10,11. Przedstawione metody, oprócz ich zastosowania w projektach biobanków trzody chlewnej, są zasadniczo odpowiednie dla wszystkich badań oceniających ilościowe właściwości histomorfologiczne narządów/tkanek. Co więcej, systematyczne projekty losowego pobierania próbek są szczególnie korzystne dla generowania reprezentatywnych próbek w eksperymentach wykorzystujących metody analizy molekularnej do wykrywania zmian obfitości, np. RNA, białek lub metabolitów w różnych narządach i tkankach.
Następne akapity zawierają krótkie wprowadzenie do tych metod, podczas gdy ich praktyczne działanie jest opisane w sekcji protokołu.
Oznaczanie objętości narządów/tkanek 
Określenie masy i objętości narządów jest ważne w kilku warunkach eksperymentalnych, ponieważ czynniki te mogą wskazywać na zmiany, potencjalnie związane z eksperymentalnie badanymi czynnikami będącymi przedmiotem zainteresowania. Całkowita objętość narządu/tkanki jest również powszechnie wymagana do obliczenia bezwzględnych parametrów ilościowych (np. całkowitej liczby komórek) na podstawie stereologicznie oszacowanych liczbowych gęstości objętości (tj. liczby komórek na jednostkę objętości tkanki)7,12. Oprócz technik wykorzystujących skomplikowany sprzęt techniczny, takich jak tomografia komputerowa, istnieją zasadniczo trzy praktyczne metody powszechnie stosowane do określania bezwzględnej objętości narządu lub tkanki. Objętość narządu można określić za pomocą "bezpośredniego pomiaru objętościowego" zgodnie z zasadą Archimedesa, tj. pomiaru objętości wody lub soli fizjologicznej przemieszczonej przez konstrukcję po całkowitym zanurzeniu. Jednak w przypadku porównywalnie dużych narządów świń podejścia te są niepraktyczne i podatne na nieprecyzyjność, ponieważ wymagają bardzo dużych kolb miarowych. Wygodniej, objętość narządu/tkanki można obliczyć na podstawie jej masy i gęstości7,12,16, które można efektywnie określić za pomocą "metody zanurzenia"7,12,16 (Krok 1.1 Protokołu). Objętość narządów/tkanek można również oszacować za pomocą metod wolumetrycznych opartych na "zasadzie Cavalieriego" (1598–1647). Najprościej rzecz ujmując, zasada Cavalieriego mówi, że jeśli dwa obiekty są przecięte w płaszczyznach równoległych do płaszczyzny podłoża, a profile przekrojów przecięte przez dwa obiekty w odpowiednich odległościach od płaszczyzny podłoża mają te same powierzchnie, to oba obiekty mają taką samą objętość. W ten sposób objętość obiektów o dowolnym kształcie można oszacować jako iloczyn ich równoległych obszarów profilu przekroju, jednakowo odległych płaszczyzn przekroju i odległości między płaszczyznami przekroju. Jest to zrozumiałe przy następującej analogii: rozważmy dwa stosy składające się z tej samej liczby identycznych monet umieszczonych obok siebie, jeden stos z monetami ułożonymi w porządku jedna na drugiej, co daje cylindryczny kształt stosu monet, a drugi stos monet z monetami umieszczonymi poza środkiem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Chociaż kształty obu stosów monet są różne, ich objętości są takie same, ponieważ obszary monet na odpowiednich poziomach obu stosów (tj. obszary profili równoległych sekcji przecinających oba stosy monet w równych odległościach od ziemi) są identyczne. Szacowanie objętości narządów i tkanek świń przy użyciu zasady Cavalieriego7,12,15 jest opisane w kroku 1.2.
Określenie stopnia kurczenia się tkanek związanych z zagnieżdżeniem histologicznym 
W analizach kilku ilościowych parametrów morfologicznych mierzonych w histologicznych skrawkach tkanek należy określić i uwzględnić wpływ obkurczania się tkanki związanej z zatopieniem, występujący podczas przetwarzania tkanki do badania histologicznego. Stopień skurczu tkanki związanej z zatopieniem może być zmienny i zależy zarówno od tkanki, jej przetwarzania, jak i podłoża do zatapiania8,13,17,18,19. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany objętości próbki tkanki związane z osadzaniem (tj. głównie kurczenie się) zachodzą we wszystkich trzech wymiarach przestrzeni, a zatem wpływają na wszystkie parametry wymiarowe oszacowane za pomocą ilościowych analiz stereologicznych8. Zasadniczo zakres kurczenia się tkanki związany z osadzaniem, wyrażony jako liniowy współczynnik kurczenia się tkanki (f S), można oszacować, jak pokazano w kroku 1.3. i służy do korekcji (wrażliwych na skurcz) ilościowych parametrów morfologicznych<klasa sup="xref">14.
Systematyczne losowe pobieranie narządów/tkanek ważone objętością 
W celu ustanowienia biobanku próbek narządów/tkanek świń, metody systematycznego losowego pobierania próbek ważone objętościowo, takie jak opisane w kroku 2, okazały się praktycznymi, oszczędzającymi czas i skutecznymi technikami generowania reprezentatywnych, wielofunkcyjnych próbek tkanek7,8,9,15.
Generowanie izotropowych jednolitych sekcji losowych i pionowych jednolitych sekcji losowych dla ilościowych analiz stereologicznych 
Próbki tkanek z biobanku muszą być odpowiednie do zastosowania w szerokim zakresie różnych metod ilościowej analizy stereologicznej w celu oszacowania maksymalnej liczby parametrów, których nie można określić bez odpowiednio przygotowanej próbki. Prawie wszystkie ilościowe parametry stereologiczne można określić za pomocą "izotropowych (niezależnych) jednorodnych sekcji losowych (IUR)"8,9. W przekrojach IUR trójwymiarowa orientacja płaszczyzny przekroju próbki tkanki jest losowa. Można to osiągnąć poprzez randomizację położenia próbki tkanki względem położenia płaszczyzny przekroju, zgodnie z metodą "Isector"11 (krok 3.1 protokołu), lub przez randomizację orientacji płaszczyzny przekroju względem próbki tkanki, jak w metodzie "Orientator"10 (Krok 3.2 protokołu). W próbkach tkanek, takich jak próbki skóry lub błony śluzowej, wykazujące naturalnie występującą lub zdefiniowaną i prawidłowo identyfikowalną oś pionową, korzystne jest przygotowanie "pionowych jednolitych odcinków losowych (VUR)" (krok 3.3 protokołu) ściśle przeciętych w płaszczyźnie ich osi pionowej8,20. W celu pełnego omówienia teoretycznych podstaw próbkowania IUR/VUR oraz obszernego omówienia potencjalnych dalszych ilościowych analiz stereologicznych, zainteresowanego czytelnika odsyłamy do podręczników stereologii ilościowej w naukach przyrodniczych8,9.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Carl Roth GmbH, Niemcy</td><td>Agar (proszek), Kat.: 5210.3</td><td>Rozpuścić około 1 g agaru w 10 ml zimnej wody w szklanej lub plastikowej zlewce, podgrzać w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W, dwukrotnie zagotować roztwór, dokładnie mieszając. Odleć do formy, gdy jest jeszcze ciepły i pozwól stwardnieć. Uwaga: Podczas obchodzenia się z gorącym agarem z płynem należy nosić okulary ochronne i rękawice.</td></tr><tr><td>Suwmiarka</td><td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Niemcy</td><td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Kat.: 3664902</td><td>Każdy rodzaj suwmiarki (mechanicznej lub elektronicznej) również się nada.</td></tr><tr><td>Formy odlewnicze (metalowe)</td><td>Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Ederm&uuml; nde, Niemcy</td><td>Einbettsch&auml; lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Kat.: 14302b</td><td>Każdy inny rodzaj metalowej formy odlewniczej używanej do zatapiania parafiny również się sprawdzi.</td></tr><tr><td>Szablony kopiowania siatek krzyżowych (5mm - 6 cm)</td><td>n.a.n.a.Szablony</td><td></td> <td>kopiowania siatek krzyżowych (5mm - 6 cm) znajdują się w pliku danych uzupełniających Albl et al.&nbsp; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td></tr><tr><td>Kopiuj szablony okręgów równokątnych i cosinusoidalnych</td><td>n.a.n.a.Kopiuj</td><td></td> <td>szablony okręgów równokątnych i cosinusoidalnych są dostępne w Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) oraz w Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. W: Haschek i Rousseaux&acute; s Podręcznik Patologii Toksykologicznej. Wydanie 3, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td></tr><tr><td>Zaciski składane (klipsy do segregatorów YIHAI, 15 mm i 19 mm)</td> <td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., Chiny</td><td>Y10006 i Y10005</td><td>Każdy inny rodzaj standardowych zacisków biurowych również się sprawdzi.</td></tr><tr><td>Kleszcze (anatomiczne)</td><td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Kat.: 1-1811</td><td>Każdy rodzaj kleszczy anatomicznych się sprawdzi.</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4%</td><td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Niemcy</td><td>Formaldehyd 37/40 %, Kat.: 1000411525005</td><td>Rozcieńczyć do 4% ze stężonego roztworu. Bufor do neutralnego pH. Nosić odpowiednią ochronę oczu, rąk i dróg oddechowych. Próbki tkanek utrwalone w roztworze formaldehydu należy przetwarzać pod okapem wyciągowym i nosić okulary ochronne oraz rękawice laboratoryjne.</td></tr><tr><td>Papier milimetrowy (do kalibracji)</td><td>B&uuml; romarkt B&ouml; ttcher AG, Jena, Niemcy. www.bueromarkt-ag.de</td><td>Penig Millimeterpapier A4, Kat.: 2514</td><td>Każdy rodzaj papieru milimetrowego (wyskalowany w milimetrach) będzie odpowiedni.</td></tr><tr><td>Zlewki laboratoryjne (5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td><td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td>Becherglas SIMAX&reg; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Kat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td><td>Wystarczy każdy rodzaj szklanych lub plastikowych zlewek o pojemności 5 &ndash; 100 ml.</td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna(e)</td><td>Mettler Toledo GmbH, Gie&szlig; en, Niemcy</td><td>PM6000</td><td>Wszelkie standardowe wagi laboratoryjne o zakresach pomiarowych od 0,1 mg do około 20 g, odpowiednio od 100 mg do około 500 g będą odpowiednie</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius AG, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>BP61S</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza mikrotomu</td><td>Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Ederm&uuml; nde, Niemcy</td><td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td><td>Każdy rodzaj jednorazowych ostrzy do mikrotomów będzie dobry.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie/system morfometrii/planimetrii</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia (NIH)</td><td>ImageJ</td><td>Pobierz z https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td></tr><tr><td>Zeiss-Kontron, Eching, Niemcy</td><td>System analizy obrazu VideoplanTM</td><td>Brak w magazynie</td><td></td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny</td><td>Nikon</td><td>D40</td><td>Wystarczy każdy rodzaj cyfrowego aparatu fotograficznego, który można zamontować na statywie.</td></tr><tr><td>Folie plastikowe</td><td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Niemcy</td><td>Laser Overhead-Folie DINA4 Kat.:&nbsp; 3562</td><td>Wystarczy każda przezroczystość z tworzywa sztucznego do druku (laserowego).</td></tr><tr><td>Tabele liczb losowych</td><td>n.a.n.a.Tabele</td><td></td> <td>liczb losowych można wygodnie generować (ze zdefiniowaną liczbą liczb losowych i w określonych odstępach czasu) za pomocą generatorów liczb losowych, takich jak: https://www.random.org/</td></tr> <tr><td>Żyletki</td><td>Plano GmbH, Wetzlar, Niemcy</td><td>T5016</td><td>Każdy rodzaj żyletek się nada.</td></tr><tr><td>Linijka</td><td>B&uuml; romarkt B&ouml; ttcher AG, Jena, Niemcy. www.bueromarkt-ag.de</td><td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, przezroczysty, Nr kat.: ln30</td><td>Sprawdzi się również każdy rodzaj linijki w skali cm-mm.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9%)</td><td>Carl Roth GmbH, Niemcy</td><td>Natriumchlorid, >99% Kat.: 0601.1</td><td>Aby przygotować 0,9% sól fizjologiczną, rozpuść 9 g NaCl w 1000 ml wody destylowanej o temperaturze 20 stopni C.</td></tr><tr><td>Ostrza do skalpeli</td><td>Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BRAUN Ostrza chirurgiczne N&deg; 22</td><td>Wszelki rodzaj ostrzy skalpela się nada.</td></tr><tr><td>Skaner</td><td>Hewlett-Packard</td><td>hp scanjet 7400c</td><td>Sprawdzi się każdy typ standardowego skanera biurowego zdolnego do skanowania z rozdzielczością od 150-600 dpi.</td></tr><tr><td>Przykłady</td><td></td><td></td> samodzielnie <td>skonstruowanych urządzeń do krojenia można znaleźć w Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) oraz w pliku danych uzupełniających Albl et al.&nbsp; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td></tr><tr><td>Formy odlewnicze sferyczne (np. o średnicy 25,5 mm)</td><td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Niemcy</td><td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 mm</td><td>Formy odlewnicze sferyczne mogą być równie dobrze skonstruowane samodzielnie lub uzyskane od innych dostawców słodyczy (do pralin). Wskazane tutaj formy odlewnicze są w rzeczywistości pakowaniem/owijaniem pustych korpusów pralin (najpierw zjedz praliny, a następnie użyj opakowania do wygenerowania sekcji i-sektorowych)</td></tr><tr><td>Cienki drut</td><td>Basteln & Hobby Schobes, Stra&szlig; förth, Niemcy. www,bastel-welt.de</td><td>Messingdraht (0,3 mm) Nr kat.: 216464742</td><td>Każdy inny rodzaj cienkiego drutu również się nada.</td></tr><tr><td>Bibułka</td><td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td>Declcate Task Wipes-White, Kat.: 1-5305</td><td>Każdy inny rodzaj bibuły laboratoryjnej również się nada.</td></tr><tr><td>Wodoodporny długopis</td><td>Staedler Mars GmbH & Co KG, N&uuml; rnberg, Grmany</td><td>Lumocolor permanent 313, 0,4 mm, S,, Kat.: 313-2</td><td>Każdy inny rodzaj wodoodpornego pisaka również się sprawdzi.</td></tr></tbody></table>

strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

W translacyjnych badaniach medycznych, modele świń stają się coraz bardziej popularne. Biorąc pod uwagę wysoką wartość pojedynczych zwierząt, w szczególności genetycznie zmodyfikowanych modeli świń, oraz często ograniczoną liczbę dostępnych zwierząt w tych modelach, ustanowienie (biobankowych) kolekcji odpowiednio przetworzonych próbek tkanek nadających się do szerokiego spektrum późniejszych metod analiz, w tym analiz nieokreślonych w momencie pobierania próbek, stanowi sensowne podejście do pełnego wykorzystania wartości translacyjnej modelu. Jeśli chodzi o specyfikę anatomii świń, niedawno ustanowiono kompleksowe wytyczne dotyczące standaryzowanego generowania reprezentatywnych, wysokiej jakości próbek z różnych narządów i tkanek świń. Wytyczne te są niezbędnymi warunkami wstępnymi odtwarzalności wyników i ich porównywalności między różnymi badaniami i badaczami. Rejestrowanie podstawowych danych, takich jak masa i objętość narządów, określenie miejsc pobierania próbek i liczby próbek tkanek, które mają zostać wygenerowane, a także ich orientacja, rozmiar, kierunki przetwarzania i przycinania, są istotnymi czynnikami decydującymi o możliwości uogólnienia i użyteczności próbki do molekularnych, jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych. W tym miejscu przedstawiono poglądową, praktyczną, krok po kroku demonstrację najważniejszych technik generowania reprezentatywnego, wielofunkcyjnego próbki biobanku z tkanek świń. Opisane tu metody obejmują oznaczanie objętości i gęstości narządów/tkanek, stosowanie procedury systematycznego losowego pobierania próbek ważonych objętościowo dla narządów miąższowych poprzez liczenie punktowe, oznaczanie stopnia kurczenia się tkanek związanego z histologicznym zatapianiem próbek oraz generowanie losowo zorientowanych próbek do ilościowych analiz stereologicznych, takich jak izotropowe jednorodne losowe skrawki (IUR) generowane metodami "orientatora" i "Isektora", i pionowe jednorodne przekroje losowe (VUR).

Technika zanurzeniowa do oznaczania gęstości tkanek/narządów
Rysunek 12A-B przedstawia reprezentatywne oznaczenie gęstości i objętości świniowej nerki przy użyciu techniki zanurzeniowej opisanej w kroku 1.1 (Rysunek 1, Rysunek 2). Bardziej reprezentatywne wyniki pomiarów gęstości dodatkowych narządów i tkanek świni przedstawio...

Pokazano praktyczne zastosowanie i wydajność metod generowania reprezentatywnych próbek tkanek modeli zwierzęcych świń dla szerokiego spektrum dalszych analiz w projektach biobanków, w tym wolumetrii, systematycznego losowego pobierania próbek i różnicowego przetwarzania próbek tkanek dla jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych i molekularnych.

Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Ten film przedstawia dwie kluczowe techniki pobierania próbek i przetwarzania próbek tkanek świń z biobanku. Technika zanurzenia wiarygodnie szacuje całkowitą objętość narządów i tkanek, a technika orientatora generuje losowe izotropowe skrawki tkanek w celu bezstronnego oszacowania ilościowych parametrów morfologicznych. Główną zaletą techniki zanurzania do oznaczania gęstości tkanek jest to, że można ją zastosować do każdego rodzaju tkanki i daje wiarygodne wyniki zarówno dla małych, jak i dużych próbek.Zaletą techniki orientatora jest to, że jest ona bardzo wydajna i działa również z dużymi próbkami tkanek. Aby rozpocząć wolumetrię dużego narządu, należy wyciąć z narządu kawałek tkanki o odpowiedniej wielkości. Ostrożnie przetrzyj próbkę ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar krwi i płynu tkankowego.Następnie zważyć próbkę na wadze precyzyjnej i zanotować masę próbki. Dodaj 0,9% soli fizjologicznej do zlewki o odpowiedniej wielkości. Nie napełniaj całkowicie zlewki, aby zapobiec przelaniu się podczas wydrążania tkanek.Umieść zlewkę na wadze, a następnie zanurz kleszczyki lub samodzielnie skonstruowany uchwyt na próbkę w soli fizjologicznej, aż znak na kleszczach lub uchwycie

sampling-strategies-processing-biobank-tissue-samples-from-porcine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

To jest protokół optymalnego przygotowania tkanek do analiz genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych nietoperzy złapanych na wolności. Obejmuje protokoły chwytania i preparacji nietoperzy, konserwacji tkanek i hodowli komórek tkanek nietoperzy.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

W tym protokole zaprojektowano startery specyficzne dla świń, skonstruowano fragmenty DNA specyficzne dla świń zawierające plazmidy i ustalono standardowe krzywe do oznaczania ilościowego. Korzystając ze starterów specyficznych dla gatunku, cpsDNA określono ilościowo za pomocą qPCR w modelach przeszczepu komórek od świni do myszy oraz w modelach przeszczepu plam tętniczych od świni do małpy.

Kwantyfikacja krążącego DNA specyficznego dla świni we krwi w modelu ksenotransplantacji

Ten protokół szczegółowo opisuje technikę usuwania mózgu świni w całości i sekcji kilku obszarów mózgu, które są powszechnie badane w neurobiologii.

Ekstrakcja i sekcja udomowionego mózgu świni

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Charakterystyka komórek śródbłonka rozrostu krwi (BOEC) z krwi obwodowej świń

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Ten protokół opisuje wykonanie kraniektomii przy użyciu szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej na 3-miesięcznej duńskiej świni rasy Landrace. Dostęp odbywa się przez kość czołową i odsłania brzuszną oponę twardą i leżące poniżej półkule mózgowe. Procedura ta pozwala na dostęp do dużej części mózgu świni.

Dostęp do mózgu świni za pomocą szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej Kraniektomia

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Poznaj techniki pobierania próbek z modeli świń do biobankowania. Naucz się metody zanurzeniowej do pomiaru objętości tkanek oraz techniki orientatora do generowania izotropowych przekrojów dla nieobciążonej analizy morfologicznej.

Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

Przeglądaj więcej filmów