Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów dotyczące mikroprzerzutów występujących u pacjentów z rakiem jelita grubego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bardzo czułe wykrywanie mikroprzerzutów indukowanych przez znakowane GFP, pochodzące od pacjentów organoidy raka jelita grubego u myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wykrycie mikroprzerzutów pochodzących z organoidów guza jelita grubego w odległych narządach u myszy może być trudne.

Procedurę z Yu Okazawą zademonstrują Kosuke Mizukoshi i Yu Koyama, doktoranci i chirurdzy z mojej grupy. Aby wygenerować organoidy komórek ludzkiego raka jelita grubego, najpierw dodaj 150 mikrolitrów sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na studzienkę do 12-dołkowej płytki na lodzie. Gdy wszystkie studzienki zostaną pokryte, inkubuj płytkę przez 30 do 60 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w celu zestalenia żeli.

Następnie ponownie zawieś osad komórek ksenoprzeszczepu nowotworowego pochodzącego od pacjenta w świeżej pożywce do hodowli organoidów raka jelita grubego uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą lub FCS, aby uzyskać stężenie trzy razy 10 do pięciu komórek na mililitr i umieść jeden mililitr komórek na każdej sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego ranka ostrożnie przenieś supernatanty hodowlane, w tym pływające komórki, do 1,5-mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek w celu ich odwirowania i ponownie zawieś granulki w 70 mikrolitrach świeżej sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na lodzie.

Aby zwiększyć żywotność komórek raka jelita grubego, nałóż pływającą komórkę nowotworową zawierającą sztuczną macierz zewnątrzkomórkową z powrotem na studzienki pokryte sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową i inkubuj kultury komórek nowotworowych przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy nowy żel macierzy zewnątrzkomórkowej stężeje, nakarm kultury jednym mililitrem świeżej pożywki do hodowli komórek organoidowych raka jelita grubego uzupełnionej 1% FCS i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po siedmiu do 10 dniach hodowli należy odłączyć organoidy mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i przenieść organoidy do 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek w celu ich odwirowania.

Następnie ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach PBS z delikatnym stukaniem w celu ponownego odwirowania. Aby oddzielić organoidy raka jelita grubego, dodaj 500 mikrolitrów roztworu enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych do probówek i wymieszaj, delikatnie stukając. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej dodać do komórek 500 mikrolitrów pożywki uzupełnionej 1% FBS i bardzo delikatnie kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórkową, aby rozbić organoidy.

Delikatne pipetowanie ludzkich organoidów CRC podczas przetwarzania ma kluczowe znaczenie dla utrzymania nienaruszonej formacji sferoidowej w hodowli. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach 5X bulionu lentiwirusowego GFP i 400 mikrolitrach świeżej pożywki organoidowej raka jelita grubego. Niezbędne jest zakażenie ludzkich organoidów CRC wysokim mianem lentiwirusa GFP, w szczególności w celu osiągnięcia prawie 100% zakażenia CRC.

Dostosuj objętość w każdej probówce, aby uzyskać pięć razy 10 do pięciu zdysocjowanych komórek nowotworowych na 500 mikrolitrów średniego stężenia i umieść 500 mikrolitrów komórek w każdym dołku sztucznej 12-dołkowej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową, jak pokazano. Po 18 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś pływające, zawierające komórki supernatanty do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek w celu odwirowania, a następnie ponownie zawiesić granulki w 70 mikrolitrach sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na probówkę na lodzie. Aby zwiększyć żywotność komórek raka jelita grubego, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na organoidy nowotworowe na 12-dołkowej płytce i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut.

Gdy powłoka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej zestala się, nakarmić kultury jednym mililitrem świeżej pożywki do hodowli organoidów CRC uzupełnionej 1% FCS i zwrócić komórki do inkubatora hodowli komórkowych na trzy dni. Następnie obserwuj zainfekowane komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić prawie 100% dodatni wynik GFP i zwróć komórki do inkubatora na kolejne cztery do sześciu dni. Aby ustalić mysi model spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów z CRC, należy rozdzielić organoidy znakowane GFP, jak pokazano, i rozcieńczyć zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w ilości pięć razy 10 do pięciu komórek nowotworowych na 50 mikrolitrów PBS uzupełnionych 50% sztucznym stężeniem macierzy zewnątrzkomórkowej.

Załaduj 50 mikrolitrów komórek na mysz do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 22 i umieść komórki nowotworowe na lodzie. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i umieść pierwszą znieczuloną mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyciągnij błonę śluzową odbytnicy z odbytu i natychmiast wstrzyknij komórki nowotworowe do błony podśluzowej odbytnicy.

Aby ustalić eksperymentalny model przerzutów ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów z CRC, należy rozcieńczyć zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w stężeniu cztery razy 10 do czterech komórek na 50 mikrolitrów i załadować 50 mikrolitrów komórek na mysz do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 22. Umieść pierwszą znieczuloną mysz NOG w pozycji leżącej na ławce i wykonaj małe nacięcie w dolnej części lewej flanki. Użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby ostrożnie przeciąć otrzewną i odsłonić śledzionę, a następnie użyj pęsety, aby chwycić tłuszcz przyczepiony do śledziony.

Następnie powoli wstrzyknij 50 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych do śledziony, uważając, aby nie zaobserwowano wycieku. Po wstrzyknięciu i zszyciu wszystkich myszy w razie potrzeby, należy zwrócić zwierzęta do ich domowych klatek i sprawdzić, czy szwy nie przeciekają i nie są zdolne do życia jeden dzień po dostarczeniu komórek nowotworowych. Użyj suwmiarki do cotygodniowego pomiaru guzów, zbierając guzy pierwotne i odpowiednie tkanki aż do odpowiednich eksperymentalnych punktów końcowych.

Przenieś wypreparowane guzy i narządy do pięciu mililitrów lodowatego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego na lodzie i obserwuj wypreparowane tkanki pod mikroskopem stereofluorescencyjnym, aby ocenić ich ekspresję GFP. Jak wykazano, zakażenie organoidami CRC lentiwirusem GFP, jak wykazano, powoduje, że prawie wszystkie organoidy wyrażają bardzo jasną GFP. Ortotopowe i dośledzionowe wstrzyknięcie organoidów znakowanych GFP do myszy NOG wtórnego biorcy ujawnia tworzenie się guzów pierwotnych GFP w miejscu ortotopowym, a także w płucach większości badanych myszy po 2,5 miesiąca po wstrzyknięciu.

Co więcej, przerzuty do wątroby obserwuje się u zwierząt biorców NOG po miesiącu od wstrzyknięcia dośledzionowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać mikroprzerzuty organoidów ludzkich komórek raka jelita grubego znakowanych GFP po ich wprowadzeniu do myszy biorcy. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że skuteczność naprowadzania guza i przerzutów organoidów ludzkich komórek raka jelita grubego u myszy jest w dużej mierze zależna od zmienności międzypacjentniczej oryginalnych komórek nowotworowych.