Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczej komórki u myszy dzięki połączonej perfuzji tkanki płucnej in-situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa wykrywania mikroprzerzutów w płucach myszy ex vivo przy jednoczesnym zachowaniu napompowanej architektury płuc. Osiąga się to poprzez uprzednią perfuzję płuc in situ U za pomocą PBS w celu usunięcia krwi, która jest głównym źródłem kolorowego tła w tej tkance. Kolejne kroki to nadmuchanie płuca przez wstrzyknięcie PFA, a następnie uszczypnięcie, aby utrwalić tkankę płucną pod napompowaniem.

Następnie płuco jest usuwane i dalej osadzane w PFA lub pojedyncze płaty płuc są osadzane w celu kriosekcji. Ostatnim krokiem jest barwienie tkanek w roztworze Xal i wizualizacja komórek nowotworowych LA zag, ostatecznie przerzuty na całe płaty płuc lub w skrawkach tkanki płucnej można wykryć aż do poziomu pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub mikroskopu świetlnego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak niebo stojące samodzielnie, jest to, że wykrywalność mikroprzerzutów jest znacznie lepsza dzięki usunięciu tła związanego z krwią.

Rozpocznij protokół od znieczulenia myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy, ksylazyny i ace promazyny w około 150 mikrolitrach PBS. Kiedy odruchy bólowe myszy nie są już obserwowane, przymocuj ją na stole operacyjnym. Wróć na dół i zaczesz włosy 70% etanolem.

Otwórz skórę od brzucha aż po szyję. Pociągnij skórę na boki lub usuń ją. Ostrożnie otwórz otrzewną w klatce piersiowej, aby zapobiec pęknięciu dużych naczyń, takich jak żyła szyjna.

Poprawi to skuteczność perfuzji. Teraz przetnij żyłę główną pod wątrobą za pomocą 20-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze od 21 do 24. Powoli wstrzyknąć od 10 do 15 mililitrów PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuco będzie całkowicie białe, a serce przestanie bić.

Następnie ściśnij naczynia krwionośne nad wątrobą i przeponą za pomocą zacisku naczyniowego. Załadować 10-mililitrową strzykawkę 3% aldehydem paraform i za pomocą igły o rozmiarze od 21 do 24 wstrzyknąć do prawej komory. Około dwóch mililitrów.

Odsłoń tchawicę na zewnątrz klatki piersiowej i napompuj płuco, wstrzykując do tchawicy około trzech mililitrów aldehydu z zewnątrz klatki piersiowej. Następnie natychmiast po wyjęciu igły ściśnięć tchawicę przypiętą do nakłucia zaciskiem naczyniowym i odczekać 10 minut, aby umożliwić utrwalenie. Następnie przeciąć naczynia krwionośne powyżej zacisku naczyniowego.

Następnie zdejmij zacisk i wstrzyknij około dwóch mililitrów PBS do prawej komory, aby usunąć nadmiar formaldehydu energetycznego. Nakłuć dolne części wszystkich płatów płuc igłą i usunąć zacisk naczyniowy przy tchawicy. Teraz wstrzyknąć od trzech do pięciu mililitrów rozcieńczonego roztworu do osadzania w tchawicy rozpieszczonej do drugiego wstrzyknięcia.

Należy przerwać wstrzyknięcie, gdy paraforma ukryta w płatach płuc zostanie zastąpiona roztworem. Ostrożnie usuń płuco, ciągnąc serce kleszczami i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne i tchawicę. Upewnij się, że serce jest połączone z płucami.

Odłóż jeden płat na kriosekcje i wykorzystaj pozostałą tkankę płucną do całego długiego barwienia. Umieść płuco w plastikowym kubku ze szczelnie zamykającą się pokrywką i przymocuj je 2% formaldehydem i PBS. Połóż kawałek gazy na płucach, aby utrzymać go w roztworze i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.

Po pół godzinie usunąć roztwór utrwalający i dokładnie umyć chusteczkę PB S3 razy, przygotować świeżo gotowy do użycia roztwór xal, rozcieńczając jeden mililitr roztworu podstawowego Xal, jeden do 40 w podstawowym roztworze barwiącym i dodać co najmniej 10 mililitrów do kubka. Zanurz płuco kawałkiem gazy. Zabezpiecz luźno pokrywkę, aby umożliwić wymianę powietrza i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu godzin, chroniąc przed światłem.

Po inkubacji usunąć roztwór xal. Przepłukać płuca raz PBS, aby usunąć resztki roztworu xal i dodać co najmniej 10 mililitrów 4% aldehydu paraform do PBS. Tkanka jest teraz gotowa do badania histologicznego i może być długo przechowywana w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zacznij od napełnienia jednej trzeciej formy do zatapiania nierozcieńczonym medium do zatapiania poly forze. Następnie załaduj płat płuc do formy i kontynuuj dodawanie pożywki, aż płat zostanie całkowicie pokryty. Ostrożnie unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza, teraz inkubuj osadzony płat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie przygotuj osadzone płuca do cięcia, powoli zamrażając je w mieszaninie suchego lodu i izop pentanu. W razie potrzeby można je teraz przenieść do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania na kriosacie Wycięte sekcje kriogeniczne krzywki o grubości od siedmiu do 10 mikronów Zamontuj sekcje na dostępnych na rynku szkiełkach gotowych do sekcji kriogenicznych Po zamontowaniu natychmiast inkubuj sekcje w roztworze barwiącym xal w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w wilgotnej komorze. Następnego dnia przepłukać szkiełka w PBS dwa razy przez pięć minut na płukanie.

Następnie krótko spłucz w wodzie destylowanej. Teraz przeciwbarwić szkiełka za pomocą szybkiego jądrowo czerwonego barwnika przez 10 sekund, aby uzyskać słabą plamę przeciwstawną, która sprawia, że xal jest bardziej dominujący, i natychmiast spłucz plamę przeciwdziałającą wodą destylowaną. Aby uzyskać ciemniejszą plamę, wydłuż czas do 30 sekund lub więcej.

Zamontuj slajdy za pomocą mocowania immunologicznego. Ponownie zbadano powstawanie przerzutów w wykonanych modelach LM ośmiu mysich systemów operacyjnych. Korzystając z opisanych tutaj reprezentatywnych obrazów perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym jednocześnie wstrzyknięto wiotkie transdukowane i nietransdukowane transdukowane niett kontrolowane komórki done i LM osiem u myszy, którym wstrzyknięto kontrolowane komórki wykonane.

Przerzuty makroskopowe i mikroskopowe pozostawały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych. Ale co ciekawe, u myszy, którym wstrzyknięto komórki dun LA Z, barwienie xgl ujawniło niebieskie ogniska mikroprzerzutów pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek na powierzchni nieperfundowanych płuc in situ perfuzja i utrwalenie płuc dodatkowo poprawiają wykrywalność mikroprzerzutów dun la z, jednak nie zaobserwowano wzrostu do ognisk makroskopowych u myszy, którym wstrzyknięto kontrolną półprzezroczystość komórek LM, Ledwo wykrywalne ogniska przerzutowe makro o średnicy większej niż 0,1 milimetra rozpoznano w płucach bez perfuzji. Perfuzja płuc nie poprawiła wykrywania ognisk.

Jednak u myszy, którym wstrzyknięto zjedzone komórki LAC Z, na powierzchni nieperfundowanych narządów wykryto wielokrotne makroprzerzuty na niebiesko zabarwione X gal. Mikroprzerzuty wykryto również na powierzchni narządów nieperfundowanych. Co więcej, perfuzja płuc jeszcze bardziej poprawiła wykrywalność makro i mikroprzerzutów.

W konsekwencji przerzuty mikro i makro stawały się widoczne w większej gęstości i większej liczbie, głównie ze względu na przezierność perfundowanej tkanki, w której widoczne stawały się również ogniska pod powierzchnią narządu. Dodatkowa analiza histologiczna z wykorzystaniem kriogenicznych skrawków tkanki płucnej potwierdziła lepszą wykrywalność przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto transdukcję LAX Z i osiem komórek LM u myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dun LAX Z. W wycinkach płuc rozpoznano mikroprzerzuty, a nawet ogniska jednokomórkowe.

Nie zaobserwowano tego u myszy z pierwotnymi nowotworami odpowiednich komórek kontrolnych. Co więcej, przerzuty makro były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto osiem komórek LA C LM, niż u zwierząt z kontrolnymi ośmioma komórkami LM. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić perfuzję i utrwalenie płuc w ZI dwa, a następnie zabarwienie przerzutów w wyciętych płucach.

Technika ta jest bardzo czułym punktem końcowym odczytywanym pod kątem rozmieszczenia przerzutów w płucach we wszelkiego rodzaju badaniach nad rakiem, a także może służyć jako punkt odniesienia dla ulepszenia obecnych technik obrazowania in vivo, takich jak mikro ct PET i MRI, stosowanych do wczesnego wykrywania zmian przerzutowych.