Name: Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczej komórki u myszy dzięki połączonej perfuzji tkanki płucnej in-situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę wykrywania przerzutów do płuc u myszy z rozdzielczością pojedynczej komórki dzięki perfuzji in situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ. Technika ta znacząco poprawia widoczność mikroprzerzutów poprzez eliminację zakłóceń związanych z krwią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Luborowi Borsigowi (Instytut Fizjologii Uniwersytetu w Zurychu) za porady dotyczące techniki perfuzji płuc.
Niniejsza praca była finansowana z grantów przyznanych przez Krebsliga w kantonie Zurych, Fundację Waltera L. i Johanny Wolf w Zurychu, Fundację Lydii Hochstrasser w Zurychu, Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (SNF) w Szwajcarii, Schweizerischer Verein Balgrist oraz Uniwersytet w Zurychu.

1. Perfuzja i utrwalanie płuc in-situ
<ol>
 <li>Zanurzyć myszy w narkozie poprzez wstrzyknięcie d.o. ~150 μl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) zawierającej 112,5 mg/kg (masy ciała) ketaminy, 16,5 mg/kg ksylazyny i 15 mg/kg acepromazyny (lub za pomocą innej narkozy zawierającej odpowiednie leki przeciwbólowe).</li>
 <li>Gdy odruchy myszy przestaną być widoczne, unieruchomić ją na stole operacyjnym na grzbiecie i zwilżyć sierść 70% etanolem, aby przycisnąć włosy do ciała.</li>
 <li>Rozciąć skórę od brzucha aż do szyi i odsunąć ją na boki lub usunąć.</li>
 <li>Otworzyć otrzewną i klatkę piersiową, tworząc odpowiednio duży otwór. Unikać przerwania dużych naczyń (np. vena jugularis), aby nie zmniejszyć wydajności późniejszej perfuzji.</li>
 <li>Przeciąć vena cava caudalis poniżej wątroby.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 20 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G powoli wstrzyknąć 10-15 ml PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuca staną się całkowicie białe, a serce przestanie bić (asystolia).</li>
 <li>Zacisnąć naczynia krwionośne powyżej wątroby i przepony za pomocą klamry naczyniowej.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 10 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G wstrzyknąć ~2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) w PBS do prawej komory.</li>
 <li>Odsłonić tchawicę poza klatką piersiową. Za pomocą tej samej strzykawki wstrzyknąć ~3 ml 3% PFA w PBS do tchawicy w części czaszkowej (poza klatką piersiową), aż płuca zostaną nadmuchane. Natychmiast po wyjęciu igły zacisnąć tchawicę poniżej miejsca nakłucia klamrą naczyniową i odczekać 10 min w celu utrwalenia.</li>
 <li>Przeciąć naczynia krwionośne powyżej klamry naczyniowej, usunąć klamrę i wstrzyknąć ~2 ml PBS do prawej komory, aby usunąć nadmiar PFA.</li>
 <li>Nakłuć igłą dolne części wszystkich płatów płuc, usunąć klamrę naczyniową z tchawicy i wstrzyknąć 3-5 ml roztworu medium zatapiającego PolyFreeze/PBS w stosunku 1:1 do tchawicy poniżej pierwszego nakłucia, aż PFA w płatach płuc zostanie zastąpione roztworem.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć płuca, odciągając serce pęsetą i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne oraz tchawicę. Pozostawić serce połączone z płucami.</li>
 <li>W zależności od planowanej analizy tkanki płucnej kontynuować zgodnie z protokołami opisanymi w sekcjach 2 lub 3. W przypadku chęci wykonania obu analiz, usunąć jeden płat płuca i postąpić zgodnie z opisem w punkcie 3. Pozostałe płaty połączone z sercem przetworzyć zgodnie z opisem w punkcie 2.</li>
</ol>
2. Wizualizacja komórek przerzutowych guza znakowanych lacZ w całych płatach płuc
<ol>
 <li>Umieścić płuco w plastikowym kubku z dopasowaną pokrywką i utrwalić w 2% formaldehydzie w PBS w temperaturze pokojowej przez 30-60 min.</li>
 <li>Usunąć roztwór utrwalający i dokładnie przemyć 3 razy w PBS.</li>
 <li>Dodać co najmniej 10 ml świeżo przygotowanego roztworu barwiącego 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozydem (X-Gal) (roztwór stokowy X-Gal [40 mg/ml w dimetyloformamidzie] rozcieńczony 1:40 w podstawowym roztworze barwiącym; pH 7,1 (Tabela 1); chronić przed światłem).</li>
 <li>Położyć kawałek gazy na wierzchu pływającego płuca, aby utrzymać je całkowicie w roztworze, a pokrywkę nałożyć na naczynie luźno, aby umożliwić wymianę powietrza.</li>
 <li>Inkubować w 37 °C przez 3-5 hr, chroniąc przed światłem.</li>
 <li>Usunąć roztwór X-Gal, wypłukać raz w PBS w celu usunięcia pozostałości roztworu X-Gal (opcjonalnie) i dodać 4% PFA.</li>
</ol>
3. Wizualizacja komórek przerzutowego guza znakowanych lacZ w krioprzekrojach płuc
<ol>
 <li>Wypełnij oznakowaną formę do zatapiania w 1/3 nierozcieńczonym medium do zatapiania PolyFreeze. Umieść na wierzchu płat płuca i dolej medium do zatapiania, aż płat zostanie całkowicie przykryty. Staraj się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Inkubuj zatopione płuca w temperaturze 4 °C przez 20 min.</li>
 <li>Następnie powoli zamroź zatopione płuca w mieszaninie suchego lodu i izopentanu, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Wykonaj kriostatyczne przekroje o grubości 7-10 μm i osadź je na szkiełkach przedmiotowych SuperFrostPlus.</li>
 <li>Próbki natychmiast inkubuj z roztworem barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 hr w komorze wilgotnościowej.</li>
 <li>Płucz szkiełka w PBS 2 razy przez 5 min, a następnie krótko w wodzie destylowanej.</li>
 <li>Wykonaj przeciwbarwienie za pomocą nuclear fast red przez 10-30 sec, wypłucz w wodzie destylowanej i zamontuj preparaty za pomocą Immu-Mount.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Asai et al. zgłosili w oryginalnym artykule na temat modelu mysiego OS LM8 pochodzącego od linii Dunn, że guzy pierwotne s.c. wywodzące się z rodzicielskich komórek Dunn, w przeciwieństwie do tych pochodzących z wysoce przerzutowej podlinii LM8, nie tworzą spontanicznie wykrywalnych przerzutów do płuc u syngenicznych myszy C3H14. Przy zastosowaniu opisanych tutaj technik ponownie zbadaliśmy tworzenie przerzutów w mysich modelach OS Dunn/LM8. Wykorzystaliśmy stabilnie transdukowane lacZ komórki Dunn i LM8 oraz protokół perfuzji i fiksacji płuc in-situ u myszy. Reprezentatywne obrazy perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym podskórnie wstrzyknięto transdukowane lacZ oraz nietransdukowane kontrolne komórki Dunn i LM8, przedstawiono na Rysunku 1. U myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami Dunn przerzuty makroskopowe i mikroskopowe pozostały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych (Rysunek 1A, i-iv). Jednakże, co ciekawe, u myszy wstrzykniętych komórkami Dunn-lacZ barwienie X-gal ujawniło niebieskie ogniska mikroprzezrutowe pojedynczych komórek lub małych skupisk komórkowych (&lt; 0,1 mm) na powierzchni nieperfundowanych płuc (Rysunek 1A, vi). Perfuzja i fiksacja płuc in-situ dodatkowo poprawiły wykrywalność mikroprzezrutów Dunn-lacZ (Rysunek 1A, viii). Nie zaobserwowano jednak rozrostu do ognisk makroskopowych (Rysunek 1A, v, vii).
U myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami LM8 w nieprzepłukanych płucach rozpoznano półprzezroczyste, ledwo wykrywalne ogniska makroprzerzutów o średnicy większej niż 0,1 mm (Rysunek 1B, i). Perfuzja płuc (Rysunek 1B, iii) nie poprawiła wykrywalności tych ognisk. Jednak u myszy wstrzykniętych komórkami LM8-lacZ na powierzchni nieprzepłukanych organów wykryto liczne, zabarwione X-Gal na niebiesko makroprzerzuty (Rysunek 1B, v) oraz mikroprzerzuty (Rysunek 1B, vi). Co więcej, perfuzja płuc dodatkowo poprawiła wykrywalność makro- i mikroprzerzutów (Rysunek 1B, vii-viii). W konsekwencji mikro- i makroprzerzuty stały się widoczne z większą gęstością i w większej liczbie, głównie ze względu na przejrzystość przepłukanej tkanki, w której widoczne stały się również ogniska znajdujące się pod powierzchnią organu.
Dodatkowa analiza histologiczna z wykorzystaniem krioprzekrojów tkanki płuc potwierdziła lepszą wykrywalność przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto komórki Dunn i LM8 transdukowane lacZ. U myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dunn-lacZ lub LM8-lacZ, w przeciwieństwie do myszy z guzami pierwotnymi z odpowiednich komórek kontrolnych, w przekrojach płuc rozpoznano mikroprzerzuty lub nawet pojedyncze ogniska komórkowe (Rysunek 2). Co więcej, makroprzerzuty były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM8-lacZ, niż u zwierząt, którym wstrzyknięto kontrolne komórki LM8 (Rysunek 2C, D).
<img alt="Analiza histologiczna, Dunn vs LM8-lacZ; efekty perfuzji, wyniki barwienia tkanek, mikroskopia." src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Wykrywanie przerzutów spontanicznych komórek Dunn (A) i LM8 (B) nietransdukowanych (i-iv) oraz transdukowanych lacZ (v-viii) w płucach nieperfundowanych (i, ii, v, vi) i perfundowanych (iii, iv, vii, viii) myszy C3H. Przerzuty w reprezentatywnych całych płucach barwionych X-Gal (v, vii w A i B) oraz w odpowiadających im powiększeniach (vi, viii w A i B) mają kolor niebieski. Ogniska makroprzerzutowe (&gt; 0.1 mm) w organach myszy wstrzykniętych nieoznakowane komórki LM8 (i-iv w B) zaznaczono gwiazdkami. Obszary pokazane w powiększeniach są reprezentatywne dla całych płuc. Paski skali wskazują 1 mm na obrazach całych płuc i 0.1 mm w powiększeniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Analiza histologiczna tkanki płuc, schemat; proces eksperymentalny z wynikami barwienia komórek." src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Wykrywanie mikroprzewidziewów Dunn i LM8 w krioskrzykach płuc. Przekroje tkanki płuc zatopionej w O.C.T. inkubowano w roztworze barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 hr w komorze wilgotnościowej, a następnie barwiono kontrastowo Nuclear Fast Red. Strzałki wskazują ogniska mikroprzewidziewów rozpoznane w przekrojach płuc myszy wstrzykniętych komórkami Dunn-lacZ (B) lub LM8-lacZ (D). Mikroprzewidziewy pozostały niewykrywalne w przekrojach płuc myszy wstrzykniętych nietransdukowanymi komórkami Dunn (A) lub LM8 (C). Paski skali wskazują 0.1 mm.

<ol><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoussens%2C+LM+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 295, 2387-2392 (2002).</li>
<li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li>
<li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538(2011).</li>
<li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li>
<li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li>
<li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+lacZ+gene%3A+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li>
<li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li>
<li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li>
<li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+and+cancer+revisited%3A+mechanistic+connections+involving+platelets%2C+P-selectin%2C+carcinoma+mucins%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn%2FLM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li>
<li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+%28LM8%29+with+high+metastatic+potential+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tutaj wyniki w mysim modelu OS Dunn/LM8 demonstrują skuteczność nowo opracowanej metody, która łączy barwienie X-Gal z lacZ-oznaczone komórki nowotworowe za pomocą in situ perfuzja/utrwalanie tkanki płucnej. To połączenie obu technik umożliwia wykrywanie zmian mikrometalstatycznych z wysoką czułością, aż do poziomu pojedynczej komórki, a także poprawia wizualizację makrometalstaz na powierzchni płuc (Rycina 1) a także w przekrojach płuc (Rysunek 2). Choć barwienie X-Gal pozwala również na wykrywanie (mikro)przerzutów w innych narządach, in situ perfuzja/utrwalanie poprawia wykrywalność ognisk przerzutowych w tkankach innych niż płuca jedynie w niewielkim stopniu ze względu na naturalną barwę krwi i tkanek tych organów13Nawet jeśli perfuzja jest skierowana do innego narządu, np. wątroby, usunięcie krwi jedynie częściowo poprawiłoby kontrast między barwieniem X-Gal a naturalnym kolorem narządu. Metoda ta jest jednak możliwa do zastosowania w przypadku każdego rodzaju lacZ-oznaczone komórki nowotworowe drastycznie poprawią wykrywalność przerzutów do płuc, aż do poziomu uśpionych pojedynczych komórek w mikroprzerzutach, oraz umożliwią łatwą i wiarygodną kwantyfikację makro- i mikroprzerzutów. Ograniczeniem tej metody oraz wszystkich innych technik opartych na genach reporterowych, w tym lucyferazie i białkach fluorescencyjnych, jest stabilność ekspresji transgenu. Jak pokazano w Rycina 2dnie wszystkie komórki nowotworowe w ogniskach makrometastatycznych są zabarwione na niebiesko, co wskazuje na brak aktywności beta-galaktozydazy. Może to być związane z martwicą, jednak bardziej prawdopodobną przyczyną jest utrata ekspresji transgenu. Zaobserwowaliśmy, że komórki Dunn i LM8 bardzo skutecznie wykazują obniżenie poziomu ekspresji lacZ or inne transgeny, nawet przy ciągłej selekcji na ekspresję. W związku z tym w niedawnych badaniach przeszliśmy na mysie linie komórkowe osteosarkoma K12 i K7M2 oraz ludzkie linie HOS, 143B i SaOS-2, z których wszystkie zachowały stabilną lacZ ekspresja in vitro oraz in vivo do 100% w czasie.
Po zapewnieniu stabilnej ekspresji lacZ, technika ta może zostać zastosowana w badaniach z wykorzystaniem komórek nowotworowych z manipulacjami genetycznymi, np. w celu mechanistycznego zbadania procesu kolonizacji tkanek13, a także w opracowywaniu i testowaniu nowych terapii mających na celu eradykację ognisk przerzutowych15,16. Ponadto może ona służyć jako wzorzec do ulepszania obecnych technik obrazowania radiologicznego, takich jak PET, (mikro)CT i MRI, stosowanych do wczesnego wykrywania przerzutów. W niedawnym badaniu PET (nieopublikowanym) z zastosowaniem różnych znaczników zweryfikowaliśmy wykryte in vivo przerzuty do płuc następnie ex vivo za pomocą opisanego protokołu. W trwającym badaniu z wykorzystaniem nowego mikro-CT dla małych zwierząt (SkyScan) jesteśmy obecnie w stanie wykryć przerzuty do płuc in vivo do wielkości 0,5 mm oraz ex vivo do 0,3 mm, jednak dążymy do uzyskania rozdzielczości 0,1 mm. Co ciekawe, jest to granica wielkości, którą ustaliliśmy w celu rozróżnienia makro- od mikroprzerzutów przy zastosowaniu łączonej metody perfuzji in-situ i barwienia X-Gal. Podkreśla to ponownie czułość i użyteczność tej prostej i kosztowo efektywnej techniki.

<table><tbody><tr><td>Narketan10 (ketamina)</td><td>V&amp;#233;toquinol AG</td><td></td><td>roztwór o stężeniu 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna (xylazine) </td><td>Streuli Pharma AG</td><td></td><td>roztwór o stężeniu 20 mg/ml </td></tr><tr><td>Prequilan (acepromazyna)</td><td>Fatro S.p.A.</td><td></td><td>roztwór o stężeniu 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kleszczyki naczyniowe Serrefine typu Bulldog</td><td>Fine Science Tools</td><td>18051-35</td><td>zakrzywiony, 35 mm</td></tr><tr><td>Plastikowy kubek z pokrywką</td><td>Semadeni</td><td>2988</td><td>kubki 25 ml z pokrywkami</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-&amp;#946;-D-galaktozyd (X-Gal); proszek</td><td>Axxora</td><td>ALX-582-002-G005</td><td>rozpuścić w N,N-dimetyloformamidzie do stężenia 40 mg/ml, przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C &amp;deg;C </td></tr><tr><td>Podstawowy roztwór barwiący, zrównoważony do pH 7,1, przechowywany w ciemności w temperaturze 4°C &amp;deg;C przez maks. 1 miesiąc</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>100 ml/L 10xPBS, 1,64 g/L K3Fe(CN)6, 2,1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% deoksycholan sodu</td></tr><tr><td>Medium do zatapiania PolyFreeze</td><td>Polysciences; dystrybutor w Szwajcarii: Brunschwig</td><td>19636-1</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>kriostat Leica CM1850</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka SuperFrost</td><td>Menzel</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear-Fast Red – roztwór siarczanu glinu</td><td>Division Chroma Waldeck GmbH&amp;dystrybutor amp;Co KG: Medite</td><td>84-0241-00</td><td></td></tr><tr><td>Immu-Mount</td><td>Thermo Electron, dystrybutor w Szwajcarii: Histocom</td><td>9990412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego przekładu treści JoVE na język polski, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i precyzji naukowej.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie x-gal komórek nowotworowych znakowanych lacz

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Przerzuty są główną przyczyną zgonów w większości typów nowotworów, w związku z czym stanowią kluczowy punkt zainteresowania w badaniach nad rakiem. Jednakże wykrywanie przerzutów utajonych za pomocą obrazowania radiologicznego oraz skuteczność ich eradykacji terapeutycznej pozostają ograniczone.
Choć modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w badaniach nad nowotworami1, monitorowanie i wizualizacja przerzutów mikro pozostaje wyzwaniem, a niedokładna ocena rozprzestrzeniania się przerzutów w badaniach przedklinicznych może prowadzić do rozczarowujących wyników w badaniach klinicznych2. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie udoskonaleniem metod, które pozwoliłyby na powtarzalne i wiarygodne wykrywanie przerzutów w tkankach prawidłowych, aż do poziomu pojedynczych komórek. Główny nacisk kładzie się zatem na techniki umożliwiające wykrywanie komórek nowotworowych in vivo, takie jak mikrotomografia komputerowa (micro-CT), pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie bioluminescencyjne lub fluorescencyjne3,4. Obecnie optymalizujemy te techniki w celu monitorowania in vivo wzrostu guza pierwotnego i przerzutowania w różnych modelach osteosarkoma. Niektóre z tych technik mogą być również stosowane do analizy przerzutów ex vivo obok metod klasycznych, takich jak qPCR5, FACS6 czy różne rodzaje barwień histologicznych. W ramach punktu odniesienia ustanowiliśmy w niniejszym badaniu stabilną transfekcję lub transdukcję komórek nowotworowych genem lacZ kodującym bakteryjny enzym β-galaktozydazę, która metabolizuje chromogenny substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosyd (X-Gal) do nierozpuszczalnego barwnika w kolorze indygo7, co umożliwia wysoce czułe i selektywne histochemiczne barwienie komórek nowotworowych w tkankach mysich ex vivo na poziomie pojedynczych komórek, jak pokazano w niniejszym materiale. Jest to niskokosztowe narzędzie niewymagające zaawansowanego sprzętu, które pozwala na precyzyjną walidację przerzutów8 w badaniach oceniających nowe terapie przeciwnowotworowe9-11. Czynnikiem ograniczającym barwienie X-gal jest niski kontrast w stosunku do np. czerwonego zabarwienia związanego z krwią w tkankach dobrze unaczynionych. W tkance płuc problem ten można rozwiązać poprzez perfuzję płuc in-situ – technikę opracowaną niedawno przez Borsiga et al.12, która polega na perfuzji płuc myszy pod narkozą w celu usunięcia z nich krwi, a następnie utrwaleniu i zablokowaniu ich in-situ w stanie nadmuchania poprzez tchawicę. Metoda ta zapobiega również zapadaniu się płuc, a tym samym zachowuje morfologię funkcjonalnych pęcherzyków płucnych, co poprawia jakość tkanki do analizy histologicznej. W niniejszym badaniu opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje połączenie barwienia X-gal komórek nowotworowych wykazujących ekspresję lacZ oraz perfuzji i utrwalania tkanki płucnej in-situ. Ten udoskonalony protokół umożliwia wysokoczułe wykrywanie pojedynczych komórek przerzutowych w płucach i pozwolił nam w niedawnym badaniu wykryć „uśpione” mikroprzerzuty w płucach w modelu mysim13, który pierwotnie opisywany był jako nieprzerzutowy14.

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Przerzuty są główną przyczyną zgonów w większości typów nowotworów, w związku z czym stanowią kluczowy obszar badań nad rakiem. Jednakże wykrywanie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest poprawa wykrywalności mikroprzerzutów w płucach myszy ex vivo przy jednoczesnym zachowaniu architektury napowietrzonych płuc. Osiąga się to poprzez wstępną perfuzję płuc in situ za pomocą PBS w celu usunięcia krwi, która stanowi główne źródło tła kolorystycznego w tej tkance. Kolejne etapy polegają na napowietrzeniu płuc poprzez wstrzyknięcie PFA, a następnie ich odcięcie, aby utrwalić tkankę płucną w stanie napowietrzenia.Następnie usuwa się płuco i utrwala je dalej w PFA lub poszczególne płaty płuc są zatapiane w celu wykonania krioprzekrojów. Końcowe etapy polegają na barwieniu tkanek w roztworze Xal i wizualizacji komórek nowotworowych LA zag; ostatecznie przerzuty w całych płatach płuc lub w przekrojach tkanki płucnej można wykryć na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopu binokularnego lub mikroskopu świetlnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sky standing on its own, jest znaczna poprawa wykrywalności mikroprzerzutów dzięki usunięciu tła związanego z krwią.Protokół należy rozpocząć od znieczulenia myszy poprzez podanie wewnątrzbrzuszne ketaminy, ksylazyny i acepromazyny w około 150 µL PBS. Po ustąpieniu odruchów bólowych u myszy, należy unieruchomić zwierzę na stole operacyjnym. Następnie należy odsunąć i wygładzić sierść za pomocą 70% etanolu.Otwórz skórę od brzucha aż do szyi. Odciągnij skórę na boki lub usuń ją. Ostrożnie otwórz otrzewną w klatce piersiowej, aby zapobiec przerwaniu dużych naczyń, takich jak żyły szyjne.Zwiększy to wydajność perfuzji. Teraz należy przekciąć żyłę główną dolną serca pod wątrobą, używając strzykawki 20 ml z igłą o rozmiarze 21-24 G. Powoli wstrzyknij od 10 do 15 ml PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuca staną się całkowicie białe, a serce przestanie bić.Następnie należy zacisnąć naczynia krwionośne powyżej wątroby i przepony za pomocą zacisku naczyniowego. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 mililitrów 3% paraformaldehydem i za pomocą igły o rozmiarze od 21 do 24 G wstrzyknąć do prawej komory około dwóch mililitrów.Odsłoń tchawicę poza klatką piersiową i napompuj płuco, wstrzykując do tchawicy od zewnątrz klatki piersiowej około trzech mililitrów aldehydu. Następnie, niezwłocznie po wyjęciu igły, zacznij tchawicę w miejscu nakłucia za pomocą zacisku naczyniowego i odczekaj 10 minut, aby umożliwić utrwalenie. Następnie przetnij naczynia krwionośne powyżej zacisku naczyniowego.Następnie zdejmij zacisk i wstrzyknij około dwóch mililitrów PBS do prawej komory, aby usunąć nadmiar formaldehydu. Przebij igłą dolne części wszystkich płatów płuc i zdejmij zacisk naczyniowy z tchawicy. Teraz wstrzyknij od trzech do pięciu mililitrów rozcieńczonego roztworu do zatapiania do tchawicy w odstępach czasowych od poprzedniej iniekcji.Przerwij wstrzykiwanie, gdy paraformaldehyd w płatach płuc zostanie zastąpiony przez roztwór. Ostrożnie wyjmij płuca, wyciągając serce pęsetą i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne oraz tchawicę. Upewnij się, że serce pozostaje połączone z płucami.Odłóż jeden płat do preparowania skrawków mrożonych, a pozostałą tkankę płucną wykorzystaj do barwienia całych organów. Umieść płuco w plastikowym kubku z dopasowaną pokrywką i utrwal je w 2% formaldehydzie w PBS. Połóż kawałek gazy na płucach, aby utrzymać je w roztworze, i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.Po pół godzinie należy usunąć roztwór utrwalający i dokładnie przemyć tkankę PBS-em 3 razy. Przygotować świeży, gotowy do użycia roztwór Xal, rozcieńczając 1 mL roztworu stokowego Xal w stosunku 1:40 w podstawowym roztworze barwiącym, a następnie wlać co najmniej 10 mL tego roztworu do naczynia. Płuca należy przykryć kawałkiem gazy. Luźno zamknąć pokrywę, aby umożliwić wymianę powietrza, i inkubować w temperaturze 37°C przez 3 do 5 godzin, chroniąc przed światłem.Po inkubacji należy usunąć roztwór xal. Płuca należy przepłukać raz PBS, aby usunąć pozostałości roztworu xal, a następnie dodać co najmniej 10 milliliters 4% paraformaldehydu w PBS. Tkanka jest teraz gotowa do badania histologicznego i może być przechowywana przez dłuższy czas w 4% PFA w temperaturze four degrees Celsius.Zacznij od wypełnienia jednej trzeciej formy do zatapiania nierozcieńczonym medium zatapiającym poly forze. Następnie umieść płat płuca w formie i dodawaj medium, aż płat zostanie całkowicie przykryty. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, a następnie inkubuj zatopiony płat w temperaturze 4 °C przez 20 minut.Następnie przygotuj zakonserwowane płuca do cięcia, zamrażając je powoli w mieszaninie suchego lodu i izopentanu. W razie potrzeby można je teraz przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Na kriostacie wytnij krioprzekroje płata o grubości od 7 do 10 µm i przymocuj je do dostępnych w handlu szkiełek przeznaczonych do krioprzekrojów. Po przymocowaniu natychmiast inkubuj przekroje w roztworze barwiącym XAL w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w komorze z nawilżaczem. Następnego dnia przepłucz szkiełka w PBS dwukrotnie, przez 5 minut podczas każdego płukania.Następnie krótko wypłucz preparaty w wodzie destylowanej. Teraz przeprowadź przeciwbarwienie preparatów przy użyciu nuclear fast red przez 10 sekund, aby uzyskać słabe przeciwbarwienie, które sprawi, że xal będzie bardziej widoczny, a następnie natychmiast spłucz barwnik wodą destylowaną. Aby uzyskać ciemniejsze przeciwbarwienie, wydłuż czas do 30 sekund lub więcej.Preparaty należy zamontować przy użyciu medium do montażu preparatów immunocytochemicznych. Ponownie zbadano tworzenie przerzutów w modelach osteosarkoma (OS) myszy DONLM8. Wykorzystano opisane tutaj reprezentatywne obrazy perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym jednocześnie wstrzyknięto transdukowane lacy oraz nietransdukowane kontrolne komórki DONLM8, a także płuc myszy, którym wstrzyknięto kontrolne komórki DON.Przerzuty makroskopowe i mikroskopowe pozostały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych. Co ciekawe, u myszy wstrzykniętych komórkami dun LA Z barwienie xgl ujawniło niebieskie ogniska mikroprzerzutowe pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek na powierzchni płuc nieperfundowanych; perfuzja i fiksacja płuc in situ dodatkowo poprawiły wykrywalność mikroprzerzutów dun la z, jednak nie zaobserwowano rozrostu do ognisk makroskopowych u myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami LM eight. W płucach nieperfundowanych rozpoznano przezroczyste, ledwo wykrywalne ogniska makroprzerzutowe o średnicy większej niż 0,1 millimeter. Perfuzja płuc nie poprawiła wykrywalności tych ognisk.Jednak u myszy, którym wstrzyknięto komórki LAC Z, na powierzchni nieprzepłukanych organów wykryto liczne niebieskie makroprzerzuty zabarwione X gal. Na powierzchni nieprzepłukanych organów stwierdzono również obecność mikroprzerzutów. Ponadto perfuzja płuc dodatkowo poprawiła wykrywalność makro- i mikroprzerzutów.W konsekwencji mikro- i makroprzerzuty stały się widoczne z większą gęstością i w większej liczbie, głównie dzięki przezroczystości perfundowanej tkanki, w której widoczne stały się również ogniska znajdujące się pod powierzchnią narządu. Dodatkowa analiza histologiczna z wykorzystaniem krioprzestrojów tkanki płuc potwierdziła poprawę wykrywalności przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto komórki LAX Z transdukowane i LM eight, a także u myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dun LAX Z. W przekrojach płuc zidentyfikowano mikroprzerzuty, a nawet pojedyncze ogniska komórkowe.Nie zaobserwowano tego u myszy z guzami pierwotnymi poszczególnych komórek kontrolnych. Co więcej, przerzuty makroskopowe były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM eight LA C, niż u zwierząt z kontrolnymi komórkami LM eight. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić perfuzję i utrwalenie płuc w ZI two oraz późniejsze barwienie przerzutów w wyciętych płucach.Technika ta stanowi wysoce czułą metodę końcowego odczytu rozprzestrzeniania się przerzutów w płucach w dowolnym badaniu nad nowotworami, a także może służyć jako punkt odniesienia dla udoskonalenia obecnych technik obrazowania in vivo, takich jak micro ct PET i MRI, wykorzystywanych do wczesnego wykrywania ognisk przerzutowych.

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Poprawione Wizualizowanie Przerzutów do Płuc na Pojedynczych Komórkach u Myszy poprzez Połączoną In-situ Perfuzję Tkanki Płucnej i Barwienie X-Gal lacZ-Znaczników Komórek Guzowych

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj metodę wykrywania przerzutów do płuc u myszy z rozdzielczością pojedynczej komórki dzięki perfuzji in situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ. Technika ta znacząco poprawia widoczność mikroprzerzutów poprzez eliminację zakłóceń związanych z krwią.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczej komórki u myszy dzięki połączonej perfuzji tkanki płucnej in-situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Przeglądaj więcej filmów