Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty
13 czerwca 2019
Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.
Hodowle organoidów myszy bardziej przypominają organizację komórek in vivo niż tradycyjne hodowle komórkowe. W badaniach nad rakiem organoidy modelują oryginalny guz lepiej niż linie komórkowe 2D i mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii przeciwnowotworowych in vitro w celu opracowania nowych terapii lekowych. W celu ekstrakcji en bloc układu moczowo-płciowego samca myszy chwyć poduszeczkę tłuszczową po obu stronach pęcherza moczowego i pociągnij w górę, aby odsłonić jądro.
Ostrożnie wypreparuj każde jądro z dala od reszty okolicy moczowo-płciowej. Delikatnie unieś pęcherz tak, aby okolica moczowo-płciowa była uniesiona razem, odsłaniając cewkę moczową pod spodem. Trzymając pęcherz, skieruj nożyczki na spodniej stronie grzbietowej prostaty, aby naciąć cewkę moczową.
Cała okolica moczowo-płciowa zostanie uwolniona z jamy brzusznej. Po usunięciu układu moczowo-płciowego odsłonięte zostaną węzły chłonne miednicy znajdujące się bezpośrednio za układem moczowo-płciowym i po obu stronach kręgosłupa. Aby usunąć węzły chłonne, ustaw proste kleszcze pod tkanką limfatyczną i pociągnij do góry.
Następnie chwyć odbytnicę prostymi kleszczami i przetnij, ciągnąc za odbytnicę, aby rozplątać całą okrężnicę i jelito cienkie w poszukiwaniu zmian przerzutowych w krezkowych węzłach chłonnych. Po usunięciu całej kości biodrowej kontynuuj ciągnięcie dwunastnicy, aby odsłonić żołądek. Przetnij przełyk, aby całkowicie usunąć żołądek.
W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek zmian przerzutowych w węzłach chłonnych należy dokładnie wyciąć te węzły z dala od jelita w celu przechowywania w PBS. Po usunięciu żołądka śledziona może zostać pobrana z grzbietowej strony brzucha w celu przechowywania w 4% paraformaldehydzie. Usunąć wątrobę do przechowywania w PBS.
Usuń nerki z obu stron kręgosłupa wraz z wszelkimi węzłami chłonnymi nerkowymi zawierającymi zmiany przerzutowe. Aby odsłonić klatkę piersiową, ostrożnie przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej. Podciśnienie uwolnione w obrębie klatki piersiowej odsłoni serce i płuca.
Pociągnij za mostek, aby jeszcze bardziej otworzyć klatkę piersiową. Przeskanuj brzuszną powierzchnię klatki piersiowej wzdłuż klatki piersiowej w poszukiwaniu zmian przerzutowych w węzłach chłonnych klatki piersiowej w celu wycięcia, jeśli występują. Nadal trzymając mostek, odetnij brzuszną klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i płuc, a następnie pociągnij za serce, aby przeciąć pod płucami.
Aby całkowicie usunąć serce i płuca en bloc, przetnij wszystkie przednie naczynia krwionośne w tchawicy. Ostrożnie przenieść serce bez uszkadzania tkanki płucnej lub zmian przerzutowych do płuc do pojemnika PBS. W celu wypreparowania guza prostaty umieść obszar moczowo-płciowy pod mikroskopem preparacyjnym.
Użyj pary prostych kleszczy i pary zakrzywionych kleszczy, aby przewrócić obszar moczowo-płciowy na jego powierzchnię grzbietową. Zlokalizuj proksymalny obszar prostaty, który można zidentyfikować po różowo-czerwonym kolorze cewki moczowej. Chwyć mocno cewkę moczową, aby umożliwić manipulację tkanką moczowo-płciową za pomocą zakrzywionych kleszczy.
Zlokalizuj podstawę pęcherzyków nasiennych, aby umożliwić ich ostrożne usunięcie. Następnie użyj zakrzywionej strony kleszczy, aby usunąć nasieniowody oraz jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej. Nadal mocno trzymając cewkę moczową i bliższy obszar prostaty, użyj cienkich spiczastych nożyczek, aby usunąć pęcherz moczowy z cewki moczowej.
Trzymając mocno bliższy obszar prostaty i cewkę moczową prostymi kleszczami, chwyć przedni obszar prostaty zakrzywioną stroną kleszczy, aby mocno odciągnąć tkankę od pęcherza moczowego i reszty prostaty. Umieść przednią tkankę prostaty w PBS i zlokalizuj brzuszny obszar prostaty. W ten sam sposób usuń brzuszną okolicę prostaty.
Jeśli obszar boczny można odróżnić od obszaru grzbietowego, usuń boczny obszar prostaty po obu stronach. Następnie usuń grzbietowy obszar prostaty i umieść proksymalny obszar prostaty w 4% paraformaldehydzie. Po zmieleniu umieść kawałki guza w 15-mililitrowej probówce buforu wytrawiającego na półtorej do dwóch godzin trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec trawienia rozsiać strawioną tkankę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Przesuń rurkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji należy pięciokrotnie rozprowadzić zawiesinę tkanek za pomocą standardowej końcówki pipety P1000. Umieścić probówkę z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe pięć minut inkubacji i rozcierania. W przypadku galwanizacji z kopułą matrycy umyj strawione komórki w dziewięciu mililitrach zimnego podłoża, a następnie zbierz komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżego podłoża w celu policzenia. A po policzeniu ponownie zbierz komórki przez odwirowanie. Rozcieńczyć komórki nowotworowe w odpowiedniej objętości macierzy.
Ostrożnie wrzuć 200 mikrolitrów roztworu komórek matrycowych do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Gdy kopuły całkowicie zastygną, dodaj dwa mililitry pożywki organoidowej prostaty uzupełnionej androgenem R1881 i inhibitorem ROCK do każdej studzienki.
Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Fluorescencyjne obrazy preparacyjne ujawniają zielone białko fluorescencyjne lub ekspresję GFP przez lite guzy prostaty, co wskazuje, że komórki nowotworowe wyrażają Cre. Wątroba i płuca tego samego zwierzęcia wykazują przerzuty wykazujące ekspresję GFP, co pokazuje, że guzy te pochodzą z pierwotnego guza prostaty.
Węzeł chłonny miednicy tej myszy wyraża GFP, a nie pomidora, co wskazuje, że ten przerzutowy guz wyprzedził węzeł chłonny i nie pozostała żadna normalna tkanka. W pierwszym dniu hodowli zaczynają tworzyć się małe organoidy wygenerowane z litego guza gruczołu krokowego z komórkami wyrażającymi ekspresję pomidora i GFP obecnymi w hodowli organoidów guza. Jednak w siódmym dniu i później, gdy organoidy guza prostaty są w pełni uformowane, organoidy wyrażają GFP, ale nie pomidora, co sugeruje, że organoidy pochodzą z komórek nowotworowych wykazujących ekspresję Cre, a nie z normalnych komórek nabłonkowych.
W pierwszym dniu hodowli małych organoidów powstałych z wypełnionego płynem guza gruczołu krokowego w hodowli organoidów obecne są zarówno komórki pomidora, jak i GFP. Organoidy z wypełnionych płynem guzów prostaty wyrażają GFP lub pomidora w siódmym dniu i później, co wskazuje jednak, że organoidy powstały z komórek, które nie wyrażają Cre. Aby zachować orientację podczas pobierania tkanki prostaty, należy przez cały czas zwracać uwagę na pozycje pęcherza moczowego i cewki moczowej.
Po wytworzeniu organoidy mogą być wykorzystywane w zastosowaniach związanych z obrazowaniem, analizą biologii molekularnej i badaniami przesiewowymi leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę sekcji zwłok i dissekcji modeli raka prostaty u myszy, ze szczególnym uwzględnieniem dissekcji guza prostaty. Zawiera również szczegółowy protokół generowania organoidalnych guzów prostaty u myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Hodowle organoidalne naśladują organizację komórek in vivo bliżej niż tradycyjne hodowle komórkowe.
- Organoidy są skutecznymi modelami oryginalnych guzów w badaniach nad rakiem.
- Mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii przeciwnowotworowych in vitro.
- Celem tego badania jest opracowanie nowych terapii lekowych za pomocą modeli organoidalnych.
Cel badania
- Przedstawić metodę dissekcji modeli raka prostaty u myszy.
- Dostarczyć protokół generowania organoidalnych guzów prostaty.
- Zwiększyć zrozumienie biologii guza poprzez modele organoidalne.
Stosowane metody
- En bloc ekstrakcja układu moczowo-płciowego samca myszy.
- Dissekcja jąder i pęcherza w celu ekspozycji prostaty.
- Cięcie cewki moczowej nożyczkami podczas trzymania pęcherza.
- Szczegółowy protokół generowania organoidów.
Główne wyniki
- Skuteczne techniki dissekcji modeli raka prostaty u myszy.
- Generowanie organoidów, które bliżej przypominają oryginalne guzy.
- Demonstracja organoidów jako platformy do testowania terapii.
- Zwiększone zrozumienie biologii raka prostaty.
Wnioski
- Przedstawione metody są skuteczne w badaniach nad rakiem prostaty.
- Organoidy zapewniają cenną narzędzie w badaniach nad rakiem.
- To podejście może prowadzić do ulepszonych strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Genetically engineered mouse models of prostate cancer provide a physiologically relevant system for studying tumorigenesis and therapeutic response. Combining these models with 3D tumor organoid culture enables in vitro systems that recapitulate tumor architecture and support drug screening. This approach improves predictive confidence in preclinical oncology research by bridging genetic models with functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor suppressor loss in prostate cancer using Cre-loxP models to validate genetic targets.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate tumor tissue from GEMMs for downstream organoid generation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates tumor organoids that maintain GFP expression from Cre-recombined tumor cells, enabling lineage tracking in drug response assays.
- Operational Value: Establishes a standardized 3D culture protocol using matrix domes and prostate organoid medium with R1881 and ROCK inhibitor for consistent tumor model propagation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports comparison of tumor and normal epithelial organoids via dual Tomato/GFP expression to assess tumor-specific phenotypes.
- Operational Value: Facilitates metastatic lesion detection in lymph nodes and organs during necropsy, informing preclinical models of cancer progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates genetic model dissection with 3D culture to support discovery biology, assay development, and translational validation in prostate cancer research.
- Discovery Biology: Enables functional validation of tumor suppressor pathways through Cre-dependent recombination in prostate-specific GEMMs.
- Screening: Produces organoid cultures suitable for drug screening applications after solidification and medium addition.
- Analytics: Allows fluorescence-based tracking of Cre activity (GFP) and recombination history (Tomato) to distinguish tumor-derived from normal epithelial organoids.
- Translational Research: Supports continuity from autochthonous tumor models to ex vivo drug testing via organoid platforms that retain genetic lineage markers.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable necropsy and organoid generation workflow applicable across multiple GEMMs and cancer types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by linking genetic models to functional 3D phenotypes that reflect in vivo tumor behavior.
- Operational Value: Standardizes tumor tissue processing and organoid formation to improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces reliance on 2D cell lines by providing genetically defined, microenvironment-informed models for preclinical testing.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates using organoid models that retain tumor-specific genetic signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse necropsy, prostate dissection, and fluorescence tissue identification.
- Dependent on dissection microscopy, centrifuges, pipettes, and temperature-controlled water baths for tissue processing.
- Necessitates standardized organoid medium supplemented with androgen R1881 and Y-27632 ROCK inhibitor for consistent culture.
- Requires adaptation of digestion and trituration steps based on tumor tissue consistency from different GEMMs.
- Limited by the need for fresh tissue processing post-necropsy to maintain organoid viability and genetic fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
En Bloc Male Urogenital System Extraction
1:08
Pelvic Lymph Node, Spleen, Liver, Kidney, Lung, Tibia, and Femur Extraction
3:16
Prostate Tumor Dissection
5:17
Tumor Tissue Digestion
6:07
Matrix Dome Plating
7:07
Results: Representative Solid and Fluid-filled Tumor Characterization
8:28
Conclusion
