Name: Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę generowania organoidów nowotworowych z mysich modeli raka prostaty. Technika ta umożliwia badanie biologii guzów i testowanie terapii przeciwnowotworowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Laboratorium Calvina Kuo na Uniwersytecie Stanforda za dostarczenie komórek HEK293 stabilnie transfekowanych za pomocą mysiego Noggin-Fc lub myszego Rspo1-Fc HA. Chcielibyśmy również podziękować dr Deanowi Tangowi za umożliwienie nam dostępu do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego w jego laboratorium. Prace te były wspierane przez CA179907 D.W.G. z National Cancer Institute. Udostępnione zasoby w Roswell Park Comprehensive Cancer Center były wspierane przez National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li>
<li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li>
<li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li>
<li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242(2018).</li>
<li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li>
<li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+mouse+cancer+models%3A+a+maze+of+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li>
<li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+prostate%3A+a+basic+anatomical+and+histological+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Bosnian+Journal+of+Basic+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li>
<li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+Bone%3A+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents%2C+Methods%2C+and+Their+Effects+on+Bone+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li>
<li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li>
<li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K%2FmTOR+and+AR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li>
<li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają powiązań finansowych do ujawnienia.

Krytyczne kroki w protokole rozwarstwienia guza prostaty i generowania organoidów Usunięcie tkanki innej niż prostata i dokładne rozwarstwienie guza prostaty myszy ma kluczowe znaczenie dla optymalnego generowania organoidów nowotworowych, ponieważ zarówno komórki nabłonkowe niezwiązane z prostatą, jak i normalne komórki nabłonka prostaty będą wytwarzać organoidy. W przypadku litych guzów gruczołu krokowego kluczowe znaczenie ma wyizolowanie obszarów żywotnego guza w celu usunięcia zanieczyszczenia ...

Od końca lat 80. możliwość zmiany genów poprzez rekombinację homologiczną znacznie posunęła naprzód badania nad systemami biologicznymi1. Indukowalne, tkankowo lub komórkowo specyficzne systemy promotoryczne i rekombinazy specyficzne dla miejsca, takie jak Cre-loxP, przyczyniły się do zaawansowanych badań genetycznych, ułatwiając kontrolę nad modyfikacjami genetycznymi zarówno czasowo, jak i przestrzennie2,3,4. Połączenie tych strategii genetycznych stworzyło szeroki wachlarz eksperymentalnych systemów modelowych5,6,7.
Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są integralnym narzędziem do oceny, jak poszczególne geny lub grupy genów wpływają na rozwój i choroby ssaków. W przedklinicznych badaniach nad rakiem GEMM są najbardziej fizjologicznie istotną i rygorystyczną metodą badania rozwoju, progresji i leczenia raka8. Nasze laboratorium specjalizuje się w generowaniu i charakteryzowaniu nowotworowych GEMM.
Najbardziej najczęściej diagnozowanym nowotworem nieskórnym wśród mężczyzn w Stanach Zjednoczonych jest rak prostaty (PCa). Większość pacjentów z PCa ma chorobę niskiego ryzyka i wysokie prawdopodobieństwo przeżycia, ale wskaźniki przeżycia drastycznie spadają, gdy choroba jest diagnozowana w zaawansowanym stadium lub jeśli celowana terapia hormonalna indukuje progresję do agresywnych, nieuleczalnych podtypów PCa9,10. Nasze laboratorium opracowało GEMM, które wykorzystują floksowane allele jednego lub więcej genów supresorowych nowotworu. Rekombinacja i utrata ekspresji genu supresorowego nowotworu zachodzi specyficznie w prostacie, ponieważ wprowadziliśmy transgen z rekombinazą Cre za promotorem probasinu, aktywowany tylko w komórkach nabłonka prostaty11,12. Wyhodowaliśmy również nasze GEMM tak, aby zawierały transgen reporterowy Cre o nazwie mT/mG, który indukuje ekspresję białka fluorescencyjnego pomidora w komórkach pozbawionych ekspresji Cre i białka zielonej fluorescencji (GFP) w komórkach z klasą Cre13. Chociaż prezentacja tej metody i nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że GEMM badamy w naszym laboratorium, protokół ten może być wykorzystany do generowania organoidów raka prostaty z dowolnego modelu mysiego. Jednak, jak omówiono szczegółowo w naszej sekcji wyników reprezentatywnych, zaobserwowaliśmy, że niektóre cechy guza są optymalne do generowania organoidów raka prostaty.
W ostatnim dziesięcioleciu nowe metody hodowli komórek z tkanek pochodzenia nabłonkowego doprowadziły do znacznego postępu w naszej zdolności do modelowania układów narządów in vitro14,15. Termin "hodowla komórkowa 3D" został przypisany technikom związanym z tworzeniem i utrzymywaniem organoidów, które można ogólnie zdefiniować jako struktury składające się z komórek, które składają się z wtórnej architektury napędzanej przez cechy linii komórkowej specyficznej dla narządu16. Te nowe metody różnią się od klasycznej hodowli komórkowej 2D tym, że komórki nie wymagają transformacji ani unieśmiertelnienia w celu długotrwałego wzrostu; w ten sposób hodowle 3D normalnych komórek można porównać z komórkami chorymi. Jest to szczególnie cenne w badaniach nad rakiem, w których normalne hodowle komórkowe zazwyczaj nie były dostępne. Ponadto organoidy spontanicznie tworzą wtórne architektury tkanek z odpowiednio zróżnicowanymi typami komórek, co czyni je lepszym systemem modelowym do zrozumienia raka in vitro niż linie komórkowe 2D17. Nasze laboratorium stworzyło linie organoidów 3D z guza wyizolowane z naszych GEMM PCa, aby uzupełnić nasze dane in vivo i przeprowadzić eksperymenty, które nie byłyby wykonalne w GEMM. 
W tym artykule prezentujemy pisemne i wizualne protokoły pełnej sekcji zwłok PCa GEMMs, w tym preparację różnych mysich płatów prostaty i zmian przerzutowych. Opisujemy i pokazujemy krok po kroku metodę generowania organoidów z guzów prostaty myszy w oparciu o protokół wcześniej opublikowany przez Drosta i wsp. do wyprowadzania organoidów z normalnej tkanki nabłonka prostaty myszy18.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna + 2,21 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>1 1/4 cala, 23 G, jednorazowe igły do strzykawek</td><td>Becton Dickinson</td><td>Z192430</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldehyd</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowana waga analityczna DMEM/F12+++</td><td>Gibco</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toledo</td><td>30216623</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Tablica sekcyjna</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-1</td><td></td></tr><tr><td>EHS Matryca mięsaka, Pathclear Lot#19814A10</td><td>Wyprodukowana przez Trevigen</td><td>Zarekwirowany w National Cancer Institute w Frederick National Laboratory</td><td>Posiadacz grantów z National Cancer Institute może wnioskować o matrycę</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Sigma</td><td>25-060</td><td></td></tr><tr><td>ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>25-005</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylo-L-Cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Skalpel Mettler Toledo</td><td>30216561</td><td></td></tr><tr><td>#23</td><td>World Precision Instruments</td><td>504176</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #7, 16 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500238</td><td></td></tr><tr><td>Jednokrawędziowa żyletka z włókna węglowego</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej, 10 cm, proste</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do przysłony ze stali nierdzewnej, 10 cm, zakrzywiona końcówka, ząbkowana</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki narzędziowe Nugent ze stali nierdzewnej, końcówka prosta, ząbkowana</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Y-276632 (inhibitor skał)</td><td>APExBIO</td><td>Samolot A3008</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Metody oparte na rekombinacji homologicznej do modyfikacji genów znacznie przyczyniły się do rozwoju badań biologicznych. Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są rygorystyczną metodą badania rozwoju i chorób ssaków. Nasze laboratorium opracowało kilka GEMM raka prostaty (PCa), które nie wykazują ekspresji jednego lub wielu genów supresorowych przy użyciu specyficznego dla miejsca systemu rekombinazy Cre-loxP i promotora specyficznego dla prostaty. W tym artykule opisujemy naszą metodę sekcji zwłok tych GEMM PCa, koncentrując się przede wszystkim na rozwarstwieniu guzów prostaty myszy. Nowe metody opracowane w ciągu ostatniej dekady ułatwiły hodowlę komórek pochodzących z nabłonka w celu modelowania układów narządów in vitro w trzech wymiarach. Szczegółowo opisujemy również metodę hodowli komórek 3D w celu generowania organoidów nowotworowych z mysich PCa GEMM. Przedkliniczne badania nad rakiem zostały zdominowane przez hodowle komórkowe 2D i modele ksenoprzeszczepów pochodzące od linii komórkowych lub od pacjentów. Metody te nie obejmują mikrośrodowiska guza, co jest ograniczeniem w stosowaniu tych technik w badaniach przedklinicznych. GEMM są bardziej fizjologicznie istotne dla zrozumienia nowotworzenia i progresji raka. Hodowla organoidów nowotworowych to system modelowy in vitro, który podsumowuje architekturę guza i charakterystykę linii komórkowej. Ponadto metody hodowli komórkowych 3D pozwalają na wzrost normalnych komórek w celu porównania z kulturami komórek nowotworowych, co jest rzadko możliwe przy użyciu technik hodowli komórkowych 2D. W połączeniu, zastosowanie GEMM i hodowli komórek 3D w badaniach przedklinicznych może potencjalnie poprawić naszą wiedzę na temat biologii nowotworów.

Reprezentatywne obrazy z sekcji zwłok myszy z dużym, wypełnionym płynem pierwotnym guzem prostaty w obszarze przedniej części prostaty przedstawiono na Rysunku 2A. W przeciwieństwie do tego, Rysunek 2B pokazuje reprezentatywne obrazy z sekcji zwłok myszy z dużym, litym pierwotnym guzem prostaty, w którym poszczególne obszary prostaty są nierozróżnialne. Obrazy z fluorescencyjnej dyssekcji przedstawiają ten sam lity guz prostaty ...

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Hodowle organoidów myszy bardziej przypominają organizację komórek in vivo niż tradycyjne hodowle komórkowe. W badaniach nad rakiem organoidy modelują oryginalny guz lepiej niż linie komórkowe 2D i mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii przeciwnowotworowych in vitro w celu opracowania nowych terapii lekowych. W celu ekstrakcji en bloc układu moczowo-płciowego samca myszy chwyć poduszeczkę tłuszczową po obu stronach pęcherza moczowego i pociągnij w górę, aby odsłonić jądro.Ostrożnie wypreparuj każde jądro z dala od reszty okolicy moczowo-płciowej. Delikatnie unieś pęcherz tak, aby okolica moczowo-płciowa była uniesiona razem, odsłaniając cewkę moczową pod spodem. Trzymając pęcherz, skieruj nożyczki na spodniej stronie grzbietowej prostaty, aby naciąć cewkę moczową.Cała okolica moczowo-płciowa zostanie uwolniona z jamy brzusznej. Po usunięciu układu moczowo-płciowego odsłonięte zostaną węzły chłonne miednicy znajdujące się bezpośrednio za układem moczowo-płciowym i po obu stronach kręgosłupa. Aby usunąć węzły chłonne, ustaw proste kleszcze pod tkanką limfatyczną i pociągnij do góry.Następnie chwyć odbytnicę prostymi kleszczami i przetnij, ciągnąc za odbytnicę, aby rozplątać całą okrężnicę i jelito cienkie w poszukiwaniu zmian przerzutowych w krezkowych węzłach chłonnych. Po usunięciu całej kości biodrowej kontynuuj ciągnięcie dwunastnicy, aby odsłonić żołądek. Przetnij przełyk, aby całkowicie usunąć żołądek.W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek zmian przerzutowych w węzłach chłonnych należy dokładnie wyciąć te węzły z dala od jelita w celu przechowywania w PBS. Po usunięciu żołądka śledziona może zostać pobrana z grzbietowej strony brzucha w celu przechowywania w 4% paraformaldehydzie. Usunąć wątrobę do przechowywania w PBS.Usuń nerki z obu stron kręgosłupa wraz z wszelkimi węzłami chłonnymi nerkowymi zawierającymi zmiany przerzutowe. Aby odsłonić klatkę piersiową, ostrożnie przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej. Podciśnienie uwolnione w obrębie klatki piersiowej odsłoni serce i płuca.Pociągnij za mostek, aby jeszcze bardziej otworzyć klatkę piersiową. Przeskanuj brzuszną powierzchnię klatki piersiowej wzdłuż klatki piersiowej w poszukiwaniu zmian przerzutowych w węzłach chłonnych klatki piersiowej w celu wycięcia, jeśli występują. Nadal trzymając mostek, odetnij brzuszną klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i płuc, a następnie pociągnij za serce, aby przeciąć pod płucami.Aby całkowicie usunąć serce i płuca en bloc, przetnij wszystkie przednie naczynia krwionośne w tchawicy. Ostrożnie przenieść serce bez uszkadzania tkanki płucnej lub zmian przerzutowych do płuc do pojemnika PBS. W celu wypreparowania guza prostaty umieść obszar moczowo-płciowy pod mikroskopem preparacyjnym.Użyj pary prostych kleszczy i pary zakrzywionych kleszczy, aby przewrócić obszar moczowo-płciowy na jego powierzchnię grzbietową. Zlokalizuj proksymalny obszar prostaty, który można zidentyfikować po różowo-czerwonym kolorze cewki moczowej. Chwyć mocno cewkę moczową, aby umożliwić manipulację tkanką moczowo-płciową za pomocą zakrzywionych kleszczy.Zlokalizuj podstawę pęcherzyków nasiennych, aby umożliwić ich ostrożne usunięcie. Następnie użyj zakrzywionej strony kleszczy, aby usunąć nasieniowody oraz jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej. Nadal mocno trzymając cewkę moczową i bliższy obszar prostaty, użyj cienkich spiczastych nożyczek, aby usunąć pęcherz moczowy z cewki moczowej.Trzymając mocno bliższy obszar prostaty i cewkę moczową prostymi kleszczami, chwyć przedni obszar prostaty zakrzywioną stroną kleszczy, aby mocno odciągnąć tkankę od pęcherza moczowego i reszty prostaty. Umieść przednią tkankę prostaty w PBS i zlokalizuj brzuszny obszar prostaty. W ten sam sposób usuń brzuszną okolicę prostaty.Jeśli obszar boczny można odróżnić od obszaru grzbietowego, usuń boczny obszar prostaty po obu stronach. Następnie usuń grzbietowy obszar prostaty i umieść proksymalny obszar prostaty w 4% paraformaldehydzie. Po zmieleniu umieść kawałki guza w 15-mililitrowej probówce buforu wytrawiającego na półtorej do dwóch godzin trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec trawienia rozsiać strawioną tkankę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Przesuń rurkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji należy pięciokrotnie rozprowadzić zawiesinę tkanek za pomocą standardowej końcówki pipety P1000. Umieścić probówkę z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe pięć minut inkubacji i rozcierania. W przypadku galwanizacji z kopułą matrycy umyj strawione komórki w dziewięciu mililitrach zimnego podłoża, a następnie zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżego podłoża w celu policzenia. A po policzeniu ponownie zbierz komórki przez odwirowanie. Rozcieńczyć komórki nowotworowe w odpowiedniej objętości macierzy.Ostrożnie wrzuć 200 mikrolitrów roztworu komórek matrycowych do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Gdy kopuły całkowicie zastygną, dodaj dwa mililitry pożywki organoidowej prostaty uzupełnionej androgenem R1881 i inhibitorem ROCK do każdej studzienki.Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Fluorescencyjne obrazy preparacyjne ujawniają zielone białko fluorescencyjne lub ekspresję GFP przez lite guzy prostaty, co wskazuje, że komórki nowotworowe wyrażają Cre. Wątroba i płuca tego samego zwierzęcia wykazują przerzuty wykazujące ekspresję GFP, co pokazuje, że guzy te pochodzą z pierwotnego guza prostaty.Węzeł chłonny miednicy tej myszy wyraża GFP, a nie pomidora, co wskazuje, że ten przerzutowy guz wyprzedził węzeł chłonny i nie pozostała żadna normalna tkanka. W pierwszym dniu hodowli zaczynają tworzyć się małe organoidy wygenerowane z litego guza gruczołu krokowego z komórkami wyrażającymi ekspresję pomidora i GFP obecnymi w hodowli organoidów guza. Jednak w siódmym dniu i później, gdy organoidy guza prostaty są w pełni uformowane, organoidy wyrażają GFP, ale nie pomidora, co sugeruje, że organoidy pochodzą z komórek nowotworowych wykazujących ekspresję Cre, a nie z normalnych komórek nabłonkowych.W pierwszym dniu hodowli małych organoidów powstałych z wypełnionego płynem guza gruczołu krokowego w hodowli organoidów obecne są zarówno komórki pomidora, jak i GFP. Organoidy z wypełnionych płynem guzów prostaty wyrażają GFP lub pomidora w siódmym dniu i później, co wskazuje jednak, że organoidy powstały z komórek, które nie wyrażają Cre. Aby zachować orientację podczas pobierania tkanki prostaty, należy przez cały czas zwracać uwagę na pozycje pęcherza moczowego i cewki moczowej.Po wytworzeniu organoidy mogą być wykorzystywane w zastosowaniach związanych z obrazowaniem, analizą biologii molekularnej i badaniami przesiewowymi leków.

generation-tumor-organoids-from-genetically-engineered-mouse-models

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Organoidy pochodzące z nowotworów są rodzajem modelu hodowli komórek 3D, który może zachować patologiczne cechy i specyficzną dla narządu linię komórkową guzów. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują organoidy z guza prostaty z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy.

Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Poznaj metodę generowania organoidów nowotworowych z mysich modeli raka prostaty. Technika ta umożliwia badanie biologii guzów i testowanie terapii przeciwnowotworowych in vitro.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Przeglądaj więcej filmów