Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Hodowle organoidów myszy bardziej przypominają organizację komórek in vivo niż tradycyjne hodowle komórkowe. W badaniach nad rakiem organoidy modelują oryginalny guz lepiej niż linie komórkowe 2D i mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii przeciwnowotworowych in vitro w celu opracowania nowych terapii lekowych. W celu ekstrakcji en bloc układu moczowo-płciowego samca myszy chwyć poduszeczkę tłuszczową po obu stronach pęcherza moczowego i pociągnij w górę, aby odsłonić jądro.

Ostrożnie wypreparuj każde jądro z dala od reszty okolicy moczowo-płciowej. Delikatnie unieś pęcherz tak, aby okolica moczowo-płciowa była uniesiona razem, odsłaniając cewkę moczową pod spodem. Trzymając pęcherz, skieruj nożyczki na spodniej stronie grzbietowej prostaty, aby naciąć cewkę moczową.

Cała okolica moczowo-płciowa zostanie uwolniona z jamy brzusznej. Po usunięciu układu moczowo-płciowego odsłonięte zostaną węzły chłonne miednicy znajdujące się bezpośrednio za układem moczowo-płciowym i po obu stronach kręgosłupa. Aby usunąć węzły chłonne, ustaw proste kleszcze pod tkanką limfatyczną i pociągnij do góry.

Następnie chwyć odbytnicę prostymi kleszczami i przetnij, ciągnąc za odbytnicę, aby rozplątać całą okrężnicę i jelito cienkie w poszukiwaniu zmian przerzutowych w krezkowych węzłach chłonnych. Po usunięciu całej kości biodrowej kontynuuj ciągnięcie dwunastnicy, aby odsłonić żołądek. Przetnij przełyk, aby całkowicie usunąć żołądek.

W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek zmian przerzutowych w węzłach chłonnych należy dokładnie wyciąć te węzły z dala od jelita w celu przechowywania w PBS. Po usunięciu żołądka śledziona może zostać pobrana z grzbietowej strony brzucha w celu przechowywania w 4% paraformaldehydzie. Usunąć wątrobę do przechowywania w PBS.

Usuń nerki z obu stron kręgosłupa wraz z wszelkimi węzłami chłonnymi nerkowymi zawierającymi zmiany przerzutowe. Aby odsłonić klatkę piersiową, ostrożnie przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej. Podciśnienie uwolnione w obrębie klatki piersiowej odsłoni serce i płuca.

Pociągnij za mostek, aby jeszcze bardziej otworzyć klatkę piersiową. Przeskanuj brzuszną powierzchnię klatki piersiowej wzdłuż klatki piersiowej w poszukiwaniu zmian przerzutowych w węzłach chłonnych klatki piersiowej w celu wycięcia, jeśli występują. Nadal trzymając mostek, odetnij brzuszną klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i płuc, a następnie pociągnij za serce, aby przeciąć pod płucami.

Aby całkowicie usunąć serce i płuca en bloc, przetnij wszystkie przednie naczynia krwionośne w tchawicy. Ostrożnie przenieść serce bez uszkadzania tkanki płucnej lub zmian przerzutowych do płuc do pojemnika PBS. W celu wypreparowania guza prostaty umieść obszar moczowo-płciowy pod mikroskopem preparacyjnym.

Użyj pary prostych kleszczy i pary zakrzywionych kleszczy, aby przewrócić obszar moczowo-płciowy na jego powierzchnię grzbietową. Zlokalizuj proksymalny obszar prostaty, który można zidentyfikować po różowo-czerwonym kolorze cewki moczowej. Chwyć mocno cewkę moczową, aby umożliwić manipulację tkanką moczowo-płciową za pomocą zakrzywionych kleszczy.

Zlokalizuj podstawę pęcherzyków nasiennych, aby umożliwić ich ostrożne usunięcie. Następnie użyj zakrzywionej strony kleszczy, aby usunąć nasieniowody oraz jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej. Nadal mocno trzymając cewkę moczową i bliższy obszar prostaty, użyj cienkich spiczastych nożyczek, aby usunąć pęcherz moczowy z cewki moczowej.

Trzymając mocno bliższy obszar prostaty i cewkę moczową prostymi kleszczami, chwyć przedni obszar prostaty zakrzywioną stroną kleszczy, aby mocno odciągnąć tkankę od pęcherza moczowego i reszty prostaty. Umieść przednią tkankę prostaty w PBS i zlokalizuj brzuszny obszar prostaty. W ten sam sposób usuń brzuszną okolicę prostaty.

Jeśli obszar boczny można odróżnić od obszaru grzbietowego, usuń boczny obszar prostaty po obu stronach. Następnie usuń grzbietowy obszar prostaty i umieść proksymalny obszar prostaty w 4% paraformaldehydzie. Po zmieleniu umieść kawałki guza w 15-mililitrowej probówce buforu wytrawiającego na półtorej do dwóch godzin trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec trawienia rozsiać strawioną tkankę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Przesuń rurkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji należy pięciokrotnie rozprowadzić zawiesinę tkanek za pomocą standardowej końcówki pipety P1000. Umieścić probówkę z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe pięć minut inkubacji i rozcierania. W przypadku galwanizacji z kopułą matrycy umyj strawione komórki w dziewięciu mililitrach zimnego podłoża, a następnie zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżego podłoża w celu policzenia. A po policzeniu ponownie zbierz komórki przez odwirowanie. Rozcieńczyć komórki nowotworowe w odpowiedniej objętości macierzy.

Ostrożnie wrzuć 200 mikrolitrów roztworu komórek matrycowych do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Gdy kopuły całkowicie zastygną, dodaj dwa mililitry pożywki organoidowej prostaty uzupełnionej androgenem R1881 i inhibitorem ROCK do każdej studzienki.

Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Fluorescencyjne obrazy preparacyjne ujawniają zielone białko fluorescencyjne lub ekspresję GFP przez lite guzy prostaty, co wskazuje, że komórki nowotworowe wyrażają Cre. Wątroba i płuca tego samego zwierzęcia wykazują przerzuty wykazujące ekspresję GFP, co pokazuje, że guzy te pochodzą z pierwotnego guza prostaty.

Węzeł chłonny miednicy tej myszy wyraża GFP, a nie pomidora, co wskazuje, że ten przerzutowy guz wyprzedził węzeł chłonny i nie pozostała żadna normalna tkanka. W pierwszym dniu hodowli zaczynają tworzyć się małe organoidy wygenerowane z litego guza gruczołu krokowego z komórkami wyrażającymi ekspresję pomidora i GFP obecnymi w hodowli organoidów guza. Jednak w siódmym dniu i później, gdy organoidy guza prostaty są w pełni uformowane, organoidy wyrażają GFP, ale nie pomidora, co sugeruje, że organoidy pochodzą z komórek nowotworowych wykazujących ekspresję Cre, a nie z normalnych komórek nabłonkowych.

W pierwszym dniu hodowli małych organoidów powstałych z wypełnionego płynem guza gruczołu krokowego w hodowli organoidów obecne są zarówno komórki pomidora, jak i GFP. Organoidy z wypełnionych płynem guzów prostaty wyrażają GFP lub pomidora w siódmym dniu i później, co wskazuje jednak, że organoidy powstały z komórek, które nie wyrażają Cre. Aby zachować orientację podczas pobierania tkanki prostaty, należy przez cały czas zwracać uwagę na pozycje pęcherza moczowego i cewki moczowej.

Po wytworzeniu organoidy mogą być wykorzystywane w zastosowaniach związanych z obrazowaniem, analizą biologii molekularnej i badaniami przesiewowymi leków.