Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Ogólnym celem tego protokołu jest wyczerpanie ekspresji genów w jelitach karaluchów za pomocą interferencji RNA poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w nośnikach liposomów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące opracowywania nowych metod zwalczania szkodników, takich jak to, czy powalenie niezbędnych genów na otwartym polu może zabić szkodniki? Główną zaletą tej techniki jest to, że liposom chroni dwuniciowy RNA specyficzny dla genu, aby zapewnić jego dostarczenie do komórki docelowej.

Procedurę zademonstrują Jia-Hsin Huang, doktor habilitowany, i Yun Liu, technik z mojego laboratorium. Na początek znieczul karaluchy na lodzie, aż przestaną się ruszać przez trzy minuty. Następnie podnieś owada za pomocą kciuka i palca wskazującego, aby uzyskać dostęp do jego brzusznej strony.

Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć końcówkę koksy tylnej nogi między koksy a krętarzem. Cięcie w innym miejscu na koksie jest mniej wydajne w przypadku kolekcji hemolimf. Teraz umieść mikropipetę o pojemności 10 mikrolitrów w miejscu nacięcia i delikatnie ściśnij brzuch, jednocześnie wciągając krwawiącą hemolimfę.

Powtarzaj ten proces, aż hemolimfa z pięciu karaluchów zostanie zebrana do jednej probówki mikrowirówkowej. Następnie krótko obracaj pulę hemolimfy przez 10 sekund. Następnie połącz 10 mikrolitrów hemolimfy z 50 mikrolitrami 1x bufor soli fizjologicznej dla owadów.

Teraz odwiruj rozcieńczoną hemolimfę przez 10 minut, aby wyciągnąć hemocyty z roztworu. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Na koniec określ ilościowo całkowite stężenie białka za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis i dostosuj stężenie każdej próbki do sześciu miligramów białka na mikrolitr.

Aby zebrać sok z jelita środkowego, najpierw znieczul karaluchy na lodzie. Następnie przenieś jeden na płytkę preparacyjną załadowaną zimnym 1x buforem soli fizjologicznej dla owadów i użyj szpilek do owadów, aby zabezpieczyć go brzuszną stroną do góry. Teraz wypreparuj brzuch za pomocą cienkiej pęsety.

Następnie usuń całe jelito i przenieś je do świeżego naczynia z 1x buforem soli fizjologicznej dla owadów. Następnie wyizoluj jelito środkowe, które jest obszarem między uprawą a kanalikami Malpighiego. Aby to zrobić, usuń przednią część zwierzęcia i usuń tylne jelito.

Następnie szybko przenieś jelito środkowe do probówki mikrowirówkowej ze 100 mikrolitrami buforu soli fizjologicznej dla owadów. Zbierz jelita środkowe sześciu karaluchów do tej samej probówki. Następnie wiruj rurkę przez 10 sekund.

Następnie odwiruj mieszaninę przez 10 minut, aby oddzielić hemocyty i tkanki jelitowe. Następnie przenieś supernatant do czystej probówki do mikrowirówki i dostosuj stężenie do sześciu miligramów białka na mikrolitr. Dwuniciowe lipopleksy RNA należy zużyć w ciągu godziny od przygotowania.

Podczas ich przygotowywania należy pamiętać o połączeniu całego rozcieńczonego odczynnika z rozcieńczonym dwuniciowym RNA w tym samym czasie. Następnie szybko zwiruj i inkubuj mieszaninę. Po przygotowaniu wymieszaj cztery mikrolitry dwuniciowego roztworu RNA z 10 mikrolitrami buforu soli fizjologicznej dla owadów jako kontrolę lub wymieszaj z 10 mikrolitrami wyekstrahowanych enzymów pobranych z hemolimfy lub soku z jelita środkowego.

Następnie wykonaj kontrolę hamowaną enzymatycznie, dodając dwa mikrolitry EGTA. W przeciwnym razie dodaj dwa mikrolitry wody wolnej od RNaz. Następnie inkubować próbki przez godzinę lub dłużej w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodać 200 mikrolitrów odczynnika ekstrakcyjnego i 40 mikrolitrów chloroformu, a następnie wirować. Następnie odwiruj próbki przez 10 minut. Następnie przenieś 150 mikrolitrów każdego supernatantu do nowej probówki i wytrącaj dwuniciowy RNA z każdej próbki, dodając 150 mikrolitrów izopropanolu i inkubując próbki na lodzie przez 15 minut.

Po inkubacji ponownie odwirować próbki i odrzucić supernatant. Następnie dwukrotnie umyj granulki RNA, dodając 200 mikrolitrów 70% etanolu do każdej granulki i odwirowując probówkę. Po drugim praniu suszyć dwuniciowe granulki RNA za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego przez trzy minuty.

Następnie ponownie zawieś granulki w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Na koniec sprawdź integralność traktowanego dwuniciowego RNA za pomocą 1,5% żelu agarozowego. Karm karaluchy dwa razy dziennie, godzinę po włączeniu świateł i godzinę przed wyłączeniem światła.

Rób to przez osiem lub 16 dni bez przerw. W tym czasie karaluchy powinny być w przeciwnym razie pozbawione wody. Do karmienia miej pod ręką świeżo przygotowane dwuniciowe lipopleksy RNA i nagie dwuniciowe RNA.

Do bolusa należy użyć z czterema mikrolitrami dwuniciowych lipopleksów RNA lub 250 nanogramami nagiego dwuniciowego RNA. Aby nakarmić karalucha, najpierw chwyć go za skrzydła za pomocą elastycznych kleszczy. Nie chwytaj części ciała karalucha.

Następnie powoli odpipetuj kroplę roztworu blisko aparatu gębowego i obserwuj, jak karaluch połyka kropelkę. Po ostatnim karmieniu zapewnij karaluchom butelki z wodą. Przez cały okres karmienia codziennie oceniaj owady, aby sprawdzić śmiertelność i usunąć wszelkie karaluchy, które już się nie poruszają z eksperymentu.

Ciągłe doustne podawanie dwuniciowych lipopleksów tubowych było w stanie zmniejszyć ekspresję tubuliny w jelicie środkowym z 40% w dziewiątym dniu do 60% w 17 dniu. Dla porównania, nagie dwuniciowe RNA nie miało żadnego wpływu. Jest to najprawdopodobniej spowodowane odkryciem, że ekspozycja nagiego dwuniciowego RNA na sok z jelita środkowego spowodowała degradację w ciągu godziny, podczas gdy dwuniciowy RNA sprzężony z liposomami pozostał stabilny.

Nie tylko poziom RNA spadł, ale ciągłe karmienie dwuniciowych lipopleksów RNA tubuliny również skutkowało znaczną śmiertelnością. Jest mało prawdopodobne, aby było to spowodowane wektorem, ponieważ lipopleksy przenoszące dwuniciowy RNA do EGFP nie powodowały śmiertelności. Podczas próby tego doustnego systemu dostarczania interferencji RNA, ważne jest, aby wykonywać ciągłe karmienie dwuniciowym RNA przez kilka dni.

Po opanowaniu etap karmienia można wykonać w ciągu dwóch minut na owada, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. W razie potrzeby można zastosować różne formuły nanocząstek liposomów, aby poprawić procedurę karmienia i wydajność RNAi. Ostatecznie technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się zwalczaniem szkodników zbadanie nowych strategii zwalczania z wykorzystaniem RNAi.