Name: Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę interferencji RNA doustnie dostarczaną w liposomach do jelita karalucha niemieckiego. Technika ta umożliwia skuteczne wyciszenie genów i otwiera nowe możliwości w zrównoważonej ochronie przed szkodnikami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez granty z Tajwanu (Ministerstwo Nauki i Technologii, MOST 100-2923-B-002-002-MY3 i 106-2313-B-002-011-MY3 dla H.J.L.), Republiki Czeskiej (agencja grantowa Uniwersytetu Południowobohemijskiego, grant GAJU 065/2017/P dla Y.H.L) i Hiszpanii (hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności, granty CGL2012-36251 i CGL2015-64727-P dla X.B. oraz rządu Katalonii, dotacja z 2014 r. SGR 619 na rzecz X.B.); otrzymała również wsparcie finansowe z Europejskiego Funduszu Rozwoju Gospodarczego i Regionalnego (fundusze FEDER dla X.B.).

1. Synteza i przygotowanie dsRNA
<ol>
	<li>Zidentyfikuj miejsca docelowe dsRNA w nieulegającym translacji regionie 3' docelowych genów. dsTub służy do celowania w gen α-tubuliny (tuby) (numer dostępu do GenBank: KX228233), a dsEGFP jako ujemna kontrola dsRNA jest projektowana z sekwencji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP; Numer dostępu do GenBanku: LC311024).</li>
	<li>Wykonaj standardową amplifikację PCR, aby zsyntetyzować matryce dsRNA ze starterami specyficznymi dla genu zawierającymi sekwencję promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Zastosowane warunki amplifikacji PCR i informacje o starterze są takie, jak podane przez Lina i wsp. (2017)12 (zobacz Tabelę materiałów).</li>
	<li>Kontynuuj przygotowanie dsRNA za pomocą zestawu do transkrypcji T7 (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	nuta: Aby uzyskać dużą ilość dsRNA, należy wymieszać dwie reakcje w jednej probówce (w sumie 40 μl) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać 2 μl DNazy (patrz tabela materiałów) do próbek dsRNA przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu trawienia matryc DNA.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika ekstrakcyjnego (patrz tabela materiałów) i 40 μl chloroformu, a następnie odwirować.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie zebrać supernatant (150 μl) w nowej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Wytrącić dsRNA, dodając 150 μl izopropanolu i inkubując przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć sklarowany osad.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 70% etanolu do przemycia granulek dsRNA. Wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń etanol i powtórz etapy mycia etanolem.</li>
	<li>Usunąć etanol i suche osady dsRNA za pomocą odśrodkowych koncentratorów próżniowych na 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić dsRNA wodą wolną od RNaz.</li>
	<li>Oznaczyć ilość oczyszczonego dsRNA za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i dostosować do żądanego stężenia (np. 0,25 μg/μL do przygotowania lipopleksów dsRNA).</li>
	<li>Próbki dsRNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lipopleksów dsRNA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 4 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) dodając 4 μl 5% roztworu glukozy. Rozcieńczyć 4 μl dsRNA (1 μg), dodając 4 μl 5% roztworu glukozy.</li>
	<li>Natychmiast dodać rozcieńczony roztwór odczynnika liposomowego do rozcieńczonego roztworu dsRNA. Krótko wymieszać, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C. 
	nuta: Nie mieszaj roztworów w odwrotnej kolejności.</li>
	<li>Lipopleksy dsRNA są gotowe do użycia. Zużyć w ciągu 1 godziny od przygotowania i wyrzucić po 1 godzinie. 
	nuta: Zgodnie z zaleceniami producenta lipopleksy należy zastosować jak najszybciej.</li>
</ol>
3. Zbiór enzymów zewnątrzkomórkowych z hemolimfy i soku z jelita środkowego
<ol>
	<li>Bufor soli fizjologicznej na owady (10x zapas)
	<ol>
		<li>Zmieszaj 900 ml podwójnie destylowanej wody ze 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2 i 8,3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Dostosuj pH do 6,8 i napełnij do 1,000 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja Hemolimfa
	<ol>
		<li>Znieczulaj karaluchy na lodzie, aż przestaną się ruszać przez 3 minuty.</li>
		<li>Przytrzymaj karalucha dwoma palcami (kciukiem i palcem wskazującym) i odwróć brzuszną stronę karalucha do góry.</li>
		<li>Użyj nożyczek preparujących, aby odciąć czubek koksy tylnej nogi. 
		nuta: Przetnij połączone skrzyżowanie między koksą a krętarzem. Wycięcie drugiej części coxa było mniej efektywne w celu zebrania hemolimfy.</li>
		<li>Delikatnie ściśnij brzuch środkowym palcem i zbierz krwawienie z hemolimfy z nacięcia za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Zbierz hemolimfę z kilku karaluchów (5 osobników) w probówce do mikrowirówki. 
		nuta: Trzymaj probówki mikrowirówkowe na lodzie, aby zapobiec melanizacji. Średnia objętość hemolimfy uzyskana z samca karalucha wynosi 2 - 3 μL.</li>
		<li>Krótko zakręć hemolimfą za pomocą wirówki stołowej przez 10 sekund.</li>
		<li>Przenieś żądaną objętość hemolimfy (tj. 10 μl) i wymieszaj ją z 50 μl 1x buforu soli fizjologicznej dla owadów.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C w celu odwirowania hemocytów. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Określić ilościowo całkowite stężenie białka za pomocą spektrofotometru UV-Vis do mikroobjętości, mierząc A28015.</li>
		<li>Dostosuj każdą próbkę tak, aby miała takie samo stężenie białka (6 mg/μl białka całkowitego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja soków z jelita środkowego
	<ol>
		<li>Znieczul karaluchy na lodzie. Zamocuj karaluchy brzuszną stroną do góry na płycie preparacyjnej za pomocą zimnego 1x bufora soli fizjologicznej dla owadów za pomocą szpilek do owadów.</li>
		<li>Wytnij brzuch delikatną pęsetą. Usuń całe jelito (w tym przednie, środkowe i tylne jelito) do świeżego naczynia z 1x buforem soli fizjologicznej dla owadów.</li>
		<li>Usuń przednie i tylne jelito i szybko przenieś jelito środkowe do probówki mikrowirówkowej, która zawiera 100 μl buforu soli fizjologicznej dla owadów.</li>
		<li>Zbierz jelita środkowe sześciu karaluchów w tej samej probówce i wiruj przez 10 sekund.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C w celu odwirowania hemocytów i tkanek jelitowych. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Określić ilościowo całkowite stężenie białka za pomocą spektrofotometru UV-Vis do mikroobjętości, mierząc A28015.</li>
		<li>Dostosuj każdą próbkę tak, aby miała takie samo stężenie białka (6 mg/μl białka całkowitego).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test degradacji dsRNA
<ol>
	<li>Świeżo przygotować 4 μl nagich lipopleksów dsRNA lub dlRNA (1 μg).</li>
	<li>Wymieszaj roztwory dsRNA z 10 μl buforu soli fizjologicznej (kontrola), wyekstrahowanymi enzymami z hemolimfy lub sokiem z jelita środkowego.</li>
	<li>Dodać 2 μl wody wolnej od EGTA (20 mM) lub RNaz do oddzielnych próbek jako kontroli hamowania aktywności enzymów.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę lub dłużej (6, 12 lub 24 godziny) w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika ekstrakcyjnego i 40 μl chloroformu, a następnie odwirować.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie zebrać supernatant (150 μl) w nowej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Wytrącić dsRNA, dodając 150 μl izopropanolu i inkubując przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć sklarowany osad.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 70% etanolu do przemycia granulek dsRNA. Wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń etanol i powtórz etapy mycia etanolem.</li>
	<li>Usunąć etanol i suche osady dsRNA za pomocą odśrodkowych koncentratorów próżniowych na 3 minuty. Ponownie zawiesić dsRNA w 10 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Sprawdź integralność traktowanego dsRNA za pomocą elektroforezy żelowej na 1,5% żelu agarozowym.</li>
</ol>
5. Doustne podawanie dsRNA
<ol>
	<li>Utrzymuj karaluchy na diecie ad libitum składającej się z suchej karmy (karma dla psów). Pozbawić karaluchy dopływu wody na dzień przed eksperymentami ze spożyciem dsRNA.</li>
	<li>Przytrzymaj karalucha, chwytając go za skrzydła elastycznymi kleszczami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 5). 
	nuta: Nie chwytaj części ciała karaluchów.</li>
	<li>Przygotować lipopleksy dsRNA, jak również nagie dsRNA, do karmienia, zgodnie z opisem w sekcji 2. 
	nuta: Lipopleksy dsRNA powinny być przygotowane świeżo przed karmieniem.</li>
	<li>Podawać 4 μl lipopleksów dsRNA lub nagiego dsRNA (250 ng) za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Powoli pipetuj kropelkę roztworu dsRNA blisko aparatu gębowego karaluchów i pozwól karaluchom całkowicie połknąć kropelkę.</li>
	<li>Wykonuj eksperymenty po spożyciu dwa razy dziennie (1 godzinę po włączeniu światła i 1 godzinę po wyłączeniu światła) przez 8 dni lub 16 dni bez przerwy. 
	nuta: Wszystkie karaluchy zdobywały wodę tylko poprzez ręczne karmienie roztworem dsRNA lub odczynnikami kontrolnymi (np. wodą wolną od nukleaz, roztworem glukozy i odczynnikiem liposomowym) podczas eksperymentów po spożyciu.</li>
	<li>Zapewnij karaluchom butelki z wodą po 16 dniach od spożycia eksperymentów z dsRNA.</li>
</ol>
6. Oceń nokdaun
<ol>
	<li>W wybranych punktach czasowych (2, 9 i 17 dni po spożyciu dsRNA) zbierz owady poddane działaniu dsEGFP i dsTub i wypreparuj wybrane tkanki (np. jelito środkowe).</li>
	<li>Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Warunki amplifikacji qRT-PCR i informacje o starterze zgłoszone przez Lina i wsp. (2017)12.</li>
	<li>Codziennie oceniaj owady kontrolne i leczone dsRNA, aby sprawdzić śmiertelność i usunąć karaluchy, które już się nie poruszają.</li>
</ol>

<ol><li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+and+slicing%3A+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/journal/19376448/312">International Review of Cell and Molecular Biology</a>. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).</li>
<li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+insecticides%3A+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li>
<li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+efficiency%2C+systemic+properties%2C+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li>
<li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li>
<li>Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).</li>
<li>Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+%28BgGSTD1%29+in+the+German+cockroach+%28Blattella+germanica%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li>
<li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769(2014).</li>
<li>Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li>
<li>Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li>
<li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li>
<li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li>
<li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4(2017).</li>
<li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10340-016-0736-9">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li>
<li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia metodę skutecznego RNAi poprzez doustne dostarczanie lipopleksów dsRNA, w tym ochronę przed trawieniem rybonukleazy w soku z jelita środkowego karalucha niemieckiego. Jak wykazano w innych badaniach na różnych gatunkach owadów, słaby efekt RNAi poprzez doustne dostarczanie dsRNA jest głównie spowodowany degradacją dsRNA 8,9,10. Protokół ten wytwarza liposomy, które służą jako nośniki ochronne w doustnym ...

RNAi zostało wykazane jako skuteczna metoda hamowania ekspresji genów poprzez mechanizm potranskrypcyjnego szlaku wyciszania wyzwalanego przez cząsteczki dsRNA u wielu eukariontów1. W ciągu ostatniej dekady badań RNAi stał się użytecznym narzędziem do badania funkcji genów od rozwoju do zachowania poprzez zubożenie ekspresji określonych genów poprzez wstrzykiwanie i/lub karmienie dsRNA w różnych taksonach owadów2,3. Ze względu na specyfikę i odporność efektu zubożającego, zastosowanie RNAi jest obecnie rozważane jako potencjalna strategia zarządzania zwalczaniem szkodników4,5. Jednak wydajność RNAi różni się znacznie w zależności od gatunku owadów, w zależności od różnych genów, które są celem ataku, i metod dostarczania. Coraz więcej dowodów sugeruje, że niestabilność dsRNA, które jest degradowane przez rybonukleazy, jest krytycznym czynnikiem ograniczonej skuteczności RNAi5,6. Na przykład, niska czułość RNAi w Manduca sexta została wyjaśniona przez fakt, że dsRNA zmieszane z hemolimfą zostało szybko zdegradowane w ciągu 1 godziny7. Podobnie, obecność alkalicznych nukleaz w jelicie środkowym, które skutecznie rozkładają spożyte dsRNA, jest silnie skorelowana z niską wydajnością RNAi w różnych rzędach owadów8,9,10.
Doustne dostarczanie dsRNA jest szczególnie interesujące dla zastosowania RNAi w strategii zwalczania szkodników, ale metoda opóźniająca degradację dsRNA przez nukleazy w jelicie środkowym nie została jeszcze opracowana, co mogłoby zapewnić efektywne RNAi poprzez karmienie. Jednak brak reakcji RNAi na doustne dostarczanie dsRNA odnotowano poprzez karmienie dużą ilością dsRNA, np. 50 μg w Bombyx mori, lub ciągłe karmienie przez 8 dni (łącznie 8 μg dsRNA) u gatunków szarańczy. Karaluch niemiecki, Blattella germinica, jest bardzo wrażliwy na RNAi poprzez wstrzyknięcie dsRNA11,12,13,14, ale nie reaguje na dsRNA poprzez karmienie. Ostatnio Lin i in. (2017) wykazali, że dsRNA otoczony nośnikami liposomów skutkuje udanym RNAi, które obniża ekspresję genu α-tubuliny w jelicie środkowym i powoduje znaczną śmiertelność karalucha niemieckiego15. Ponieważ degradacja dsRNA w jelicie środkowym jest czynnikiem ograniczającym dla doustnego RNAi, nośniki liposomów służą jako nośnik do ochrony dsRNA przed degradacją, co jest łatwo stosowane u innych owadów o silnej aktywności nukleazy w jelitach. Warto zauważyć, że powodem wyboru konkretnego odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów), którego użyliśmy jako nośnika liposomów w obecnym protokole, jest to, że został on przetestowany pod kątem transfekcji linii komórkowej owadów z mniejszą toksycznością, zgodnie z instrukcjami producenta. Zgodnie z porównaniem różnych systemów transfekcji liposomów w Gharavi et al. (2013)16, skuteczność transfekcji małych interferujących RNA (siRNA) jest w przybliżeniu taka sama między tym a innymi dostępnymi na rynku systemami, które zostały wykorzystane do systemów dostarczania dsRNA u innych owadów17,18. Co więcej, nasza metoda karmienia jest wystarczająco ostrożna, aby zapewnić, że każda karaluch spożywa odpowiednią ilość dsRNA, a wyniki są solidne i potwierdzone. Podsumowując, obecny protokół i wyniki pokazują, że stosowanie lipopleksów dsRNA poprawia stabilność dsRNA i otwiera drzwi do zaprojektowania strategii doustnego dostarczania RNAi, co jest obiecującym podejściem do zwalczania szkodników w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Odczynnik do transfekcji</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>do przygotowania lipopleksów</td></tr><tr><td>Mieszanka Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>do PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>dla qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>do identyfikacji 3' UTR&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw transkrypcyjny MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>do syntezy dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>usuń matrycę DNA z dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>do ekstrakcji dsRNA lub całkowitego RNA</td></tr><tr><td>RQ1 Dnazy bez RNaz</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>usuń matrycę DNA z całkowitego RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>do ekstrakcji dsRNA lub całkowitego RNA</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>do ekstrakcji dsRNA lub całkowitego RNA</td></tr> etanol <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>do ekstrakcji dsRNA lub całkowitego RNA</td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>do przygotowania wody wolnej od RNaz</td></tr><tr><td>roztwór glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>do przygotowania lipopleksów</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>formuła buforowa soli fizjologicznej dla owadów</td></tr><tr><td>Chlorek potasu, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>formuła buforowa soli fizjologicznej dla owadów</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>formuła</td></tr> <tr><td>buforu soli fizjologicznej dla owadówChlorek magnezu sześciowodny, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>formuła buforowa soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>dla owadów EGTA&nbsp;</td>Inhibitor enzymu <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>nożyczki preparacyjne</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>cienkie pęsety do wycinania karaluchów</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td></td><td>preparowanie karaluchów</td></tr><tr><td>elastyczna pęseta</td><td>FST</td><td></td><td>Hodowla karaluchów&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td></td></tr><tr><td>probówka do przygotowywania próbek mikrowirówka</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>końcówka pipety do przygotowywania próbek</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Przygotowanie próbek</td> <td>Axygen</td><td></td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>przygotowanie próbek</td></tr><tr><td>Wirówka Minispin</td><td>Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>do wirowania cieczy&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>pH-metr&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>do</td></tr><tr><td>spektrofotometru mikroobjętościowego</td> z regulacją pH <td>Quawell</td><td>Q3000</td> ilościowy PCR z <td>kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>do matrycy PCR lub&nbsp; inkubacji syntezy dsRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>ilościowy ABI PCR w czasie rzeczywistym</td><td>&nbsp;</td><td>Ekspresja genów StepOne plus</td><td>ilościowe</td></tr><tr><td>odśrodkowe koncentratory próżniowe</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>do ekstrakcji dsRNA lub całkowitego RNA</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>do ładowania próbek PCR w czasie rzeczywistym&nbsp;</td></tr><tr><td>Agaroza I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>do elektroforezy kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>tuba gen specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gene specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub template reverse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>szablon dsEGFP forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AGC GGC GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP szablon reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA</td></tr> TCT TCA <tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT</td></tr><tr><td>GGC tub qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG AC AC GCC TCT TCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG</td></tr><tr><td>A ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAA GAA G</td></tr></tbody></table>

praktyczne zastosowanie interferencji rna: doustne dostarczanie dwuniciowego rna w nośnikach liposomów dla karaluchów

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Interferencja RNA (RNAi) była szeroko stosowana do odkrywania biologicznych funkcji wielu genów i była przewidziana jako narzędzie do zwalczania szkodników, działające poprzez zakłócanie ekspresji genów. Chociaż różne metody, takie jak wstrzykiwanie, karmienie i moczenie, zostały zgłoszone w celu skutecznego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA), skuteczność RNAi poprzez doustne dostarczanie dsRNA jest bardzo zmienna wśród różnych grup owadów. Karaluch niemiecki, Blattella germanica, jest bardzo wrażliwy na wstrzykiwanie dsRNA, jak wykazano w wielu opublikowanych wcześniej badaniach. W niniejszym badaniu opisano metodę wykazania, że dsRNA otoczone nośnikami liposomów jest wystarczające do opóźnienia degradacji dsRNA przez sok z jelita środkowego. Warto zauważyć, że ciągłe karmienie dsRNA otoczonego liposomami znacznie zmniejsza ekspresję tubuliny w jelicie środkowym i prowadzi do śmierci karaluchów. Podsumowując, opracowanie i wykorzystanie lipopleksów dsRNA, które chronią dsRNA przed nukleazami, może być praktycznym zastosowaniem RNAi do zwalczania szkodników owadzich w przyszłości.

Uproszczony schemat protokołu podawania dsRNA drogą doustną przedstawiono na Rysunku 1, gdzie ukazano kluczowe etapy przygotowania lipopleksów dsRNA.
Aby zbadać ochronę zapewnianą przez nośniki liposomalne przed degradacją dsRNA w soku z jelita środkowego B. germanica, przeprowadzono test ex vivo, w którym lipopleksy dsTub inkubowano z soku z jelita środkowego, a następnie przeanal...

Ten manuskrypt demonstruje wyczerpanie ekspresji genów w jelicie środkowym karalucha niemieckiego poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w liposomach.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wyczerpanie ekspresji genów w jelitach karaluchów za pomocą interferencji RNA poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w nośnikach liposomów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące opracowywania nowych metod zwalczania szkodników, takich jak to, czy powalenie niezbędnych genów na otwartym polu może zabić szkodniki? Główną zaletą tej techniki jest to, że liposom chroni dwuniciowy RNA specyficzny dla genu, aby zapewnić jego dostarczenie do komórki docelowej.Procedurę zademonstrują Jia-Hsin Huang, doktor habilitowany, i Yun Liu, technik z mojego laboratorium. Na początek znieczul karaluchy na lodzie, aż przestaną się ruszać przez trzy minuty. Następnie podnieś owada za pomocą kciuka i palca wskazującego, aby uzyskać dostęp do jego brzusznej strony.Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć końcówkę koksy tylnej nogi między koksy a krętarzem. Cięcie w innym miejscu na koksie jest mniej wydajne w przypadku kolekcji hemolimf. Teraz umieść mikropipetę o pojemności 10 mikrolitrów w miejscu nacięcia i delikatnie ściśnij brzuch, jednocześnie wciągając krwawiącą hemolimfę.Powtarzaj ten proces, aż hemolimfa z pięci

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku wytyczne dotyczące technik działania RNAi w P. americana.

Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Poznaj metodę interferencji RNA doustnie dostarczaną w liposomach do jelita karalucha niemieckiego. Technika ta umożliwia skuteczne wyciszenie genów i otwiera nowe możliwości w zrównoważonej ochronie przed szkodnikami.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Przeglądaj więcej filmów