Name: Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę split-BioID do analizy kompleksów białkowych w natywnym środowisku komórkowym. Ta technika umożliwia identyfikację specyficznych interakcji białkowych z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) poprzez niemiecką inicjatywę doskonałości (CellNetworks DFG-EXC 81) oraz częściowe finansowanie przez wspólne centrum badawcze SFB638.

<ol><li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules%2C+big+targets%3A+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li>
<li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li>
<li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li>
<li>Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50(2009).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
<li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Asc1p%2FReceptor+for+Activated+C+Kinase+1+%28RACK1%29+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li>
<li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962(2017).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSITe%3A+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID%3A+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039(2017).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/10/02/196980">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona procedura opisuje, w jaki sposób klonować interesujące geny do plazmidów z rozszczepionym BioID, jak testować biotynylację indukowaną interakcją oraz jak izolować biotynylowane białka do analizy spektrometrii mas. Opisujemy tutaj procedurę opartą na transfekcji przejściowej. Podczas gdy ekspresję białek fuzyjnych można dostroić za pomocą ilości dox dodanego do pożywki, transfekcja przejściowa może prowadzić do niejednorodnej ekspresji białek z niektórymi komórkami, które rażąco nadekspresjonują białka fuzyjne w porównaniu z endogennymi odpowiednikami. Może to prowadzić do zniekształceń odpowiednich interaktomów i IPP, które nie odzwierciedlają wiernie oddziaływań obejmujących białka endogenne. W związku z tym ogólnie zaleca się konstruowanie stabilnych linii komórkowych po ustaleniu rozszczepienia BioID z układem przejściowym. Plazmidy są kompatybilne z systemem rekombinacji za pośrednictwem Flp i umieszczają oba interesujące geny pod regulacją tego samego elementu reagującego na tet. W razie potrzeby i w połączeniu z kompatybilnymi komórkami ssaków umożliwiają łatwe tworzenie stabilnych indukowalnych linii komórkowych. Na przykład używamy linii HeLa-EM2-11, która wyraża aktywator transkrypcji aktywowany tetracykliną rtTA i unikalny, celowalny locus genomowy, z którego ekspresja genów za pośrednictwem tetracykliny może być ściśle regulowana12. Korzystając z tej linii komórkowej i rekombinacji za pośrednictwem Flp, stabilne linie komórkowe, które zawierają tylko jedną kopię transgenu, można uzyskać w ciągu dwóch-trzech tygodni. Alternatywnie, można również wykorzystać obecne techniki edycji genomu do wprowadzenia fragmentów BirA* do natywnych loci genomowych genów będących przedmiotem zainteresowania.
Podobnie jak w każdym teście, który opiera się na znakowaniu białka, należy rozważyć, czy powstałe białka fuzyjne są funkcjonalne. Dostępne dane, w których białka będące przedmiotem zainteresowania zostały znakowane (na przykład za pomocą GFP w badaniach obrazowych) i przetestowane funkcjonalnie, są przydatne do podjęcia decyzji, czy fragmenty BirA* powinny być klonowane przed czy za genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Jeśli takie dane nie są dostępne, należy przetestować białka znakowane N-końcowo lub C-końcowo w teście funkcjonalnym. Na przykład, aktywność białek fuzyjnych może być testowana w linii komórkowej, w której endogenne białko zostało znokautowane i porównana z sytuacją typu dzikiego. Jeśli interesujące białka tolerują zarówno znaczniki N-, jak i C-końcowe, należy je przetestować. Rzeczywiście, w eksperymentach BioID orientacja białka fuzyjnego może wpływać na skuteczność znakowania22. Ponadto zaobserwowaliśmy, że podczas stosowania split-BioID do pary białek, które z dwóch białek jest dołączone do fragmentu NBirA* lub CBirA*, również wpływa na skuteczność znakowania9. W plazmidach z podziałem BioID, 16 długich aminokwasów bogatych w glicynę / serynę łączników sprzężających interesujące białka z fragmentami BirA* zostało pobranych z innego PCA23 i działało dla nas dla wszystkich oddziałujących białek, które testowaliśmy do tej pory. Należy jednak wziąć pod uwagę, że niektóre pary białek mogą działać lepiej z krótszymi lub dłuższymi łącznikami. Na koniec warto wspomnieć, że inny test został opisany przez grupęBollena 24. W tym teście BirA* jest rozszczepiony w innym miejscu (E140/Q141) niż nasze (E256/G257). Przetestowaliśmy oba smaki rozszczepionego BioID obok siebie i stwierdziliśmy, że E256/G257, opisany w tym protokole, prowadzi do silniejszej reaktywacji po sprzężeniu z dwoma oddziałującymi białkami9.
Jedną z ogólnych wad tej metody jest niska szybkość etykietowania. Zazwyczaj czas inkubacji z biotyną wynosi od 6 do 24 godzin, aby uzyskać znaczną biotynylację6, co wyklucza zastosowanie tej techniki do badania dynamicznej przebudowy kompleksów białkowych. Chociaż ten test częściowo rozwiązuje to zastrzeżenie, ponieważ jest aktywowany tylko wtedy, gdy dwa białka wchodzą w interakcję, powolna prędkość znakowania wyklucza jego użycie do badania odpowiedzi na bardzo dynamiczne procesy lub do analizy krótkotrwałych białek. Zmodyfikowana peroksydaza APEX2 jest znana z tego, że wspomaga skuteczne znakowanie białek proksymalnych w ciągu 1 minuty3 . PCA oparte na APEX2 może zatem rozwiązać problemy związane z powolnym tempem znakowania testów pochodzących z BioID. W badaniu potwierdzającym zasadę opisano taki test split-APEX225. Jednakże, mimo że białko homodimeryzujące udało się poddać biotynylacji, nie wiadomo jeszcze, czy test można również wykorzystać do znakowania i identyfikacji białek, które gromadzą się wokół pary oddziałujących białek. Całkiem niedawno, ukierunkowana ewolucja została wykorzystana do stworzenia TurboID i miniTurbo, dwóch wariantów BirA* o zwiększonej aktywności, które pozwalają na znacznie krótsze okna czasowe etykietowania, do 10 minut26. Dostosowanie split-BioID do tych nowych wariantów jeszcze bardziej rozszerzy zastosowanie tej techniki na szerszy zakres zastosowań.

Ponieważ większość funkcji komórkowych jest wykonywana przez białka, które dynamicznie łączą kompleksy makromolekularne, identyfikacja interakcji białko-białko (PPI) jest głównym przedsięwzięciem w badaniach biomedycznych. Rzeczywiście, IPP są często rozregulowane w chorobie i stanowią potencjalne cele terapeutyczne1. Najpowszechniej stosowaną metodą identyfikacji IPP jest metoda oczyszczania powinowactwa (AP), w której po lizie komórek białko będące przedmiotem zainteresowania jest specyficznie oczyszczane na matrycy, a powiązane białka są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż AP-MS jest potężnym podejściem, zazwyczaj nie działa dobrze w przypadku słabo rozpuszczalnych kompleksów białkowych, bardzo przejściowych interakcji lub IPP, które wymagają nienaruszonej struktury subkomórkowej. Co więcej, interpretacja danych może być skomplikowana ze względu na dynamiczną naturę sieci PPI, ponieważ pojedyncze białko jest często częścią kilku odrębnych kompleksów białkowych.
Techniki oznaczania bliskości, takie jak BioID2 lub APEX23,4 zostały niedawno opracowane w celu rozwiązania niektórych ograniczeń podejść AP-MS. W BioID enzym BirA* (odpowiadający wariantowi G115R dzikiego enzymu E. coli) katalizuje tworzenie labilnego biotynyl-AMP (bio-AMP), który może reagować z aminami pierwszorzędowymi. W przeciwieństwie do enzymu typu dzikiego, który zatrzymuje bio-AMP w swoim aktywnym centrum, BirA* uwalnia bio-AMP, umożliwiając jego dyfuzję do sąsiedniego środowiska. W związku z tym, po fuzji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i ekspresji w komórkach, białka proksymalne mogą być biotynylowane w szacowanym zakresie 10 nm5. Te oznaczone białka proksymalne są następnie izolowane przez ściąganie streptawidyny i identyfikowane przez stwardnienie rozsiane. W przeciwieństwie do AP-MS, BioID wymaga ekspresji białka fuzyjnego. W związku z tym można go stosować tylko do białek, których funkcja nie jest zakłócona przez znakowanie. Co więcej, szybkość etykietowania jest niska, zwykle 6–24 h2,6, co sprawia, że wykrywanie krótkożyciowych białek jest trudne. Jednak w porównaniu z AP-MS, BioID-MS oferuje kilka kluczowych zalet: po pierwsze, wychwytuje interakcje w ich natywnym środowisku komórkowym; po drugie, znakowane białka, a nie złożone kompleksy, są izolowane po lizie komórek; Po trzecie, ściąganie streptawidyny pozwala na stosowanie denaturujących i trudnych warunków mycia. W związku z tym metoda jest bardziej czuła na wykrywanie przejściowych lub słabych interakcji7 lub interakcji zachodzących na określonej i trudnej do wyizolowania strukturze subkomórkowej8.
Jednak większość białek jest zazwyczaj częścią większych kompleksów, które mogą się przebudować zgodnie ze wskazówkami komórkowymi lub funkcją, która musi być wykonana. W związku z tym pojedyncze białko jest zazwyczaj częścią kilku kompleksów, odpowiadających odrębnym jednostkom funkcjonalnym, obejmującym różne i/lub nakładające się na siebie PPI. Oba podejścia dają przegląd wszystkich powiązań, jakie może mieć dane białko, ale nie odnoszą się do kontekstu poszczególnych IPP. Aby zwiększyć rozdzielczość tego ostatniego, zaprojektowaliśmy test komplementacji fragmentów białka (PCA), w którym dwa nieaktywne fragmenty BirA* (NBirA*, który zawiera domenę katalityczną, i CBirA*, który może być postrzegany jako domena reaktywacji) mogą ponownie złożyć się w aktywny enzym, gdy zostaną zbliżone do dwóch oddziałujących białek9. Uzyskany w ten sposób test split-BioID koncentruje biotynylację zależną od bliskości na białkach, które gromadzą się wokół pary oddziałujących białek, a tym samym umożliwia identyfikację zależnych od kontekstu zespołów białek. Niedawno zademonstrowaliśmy wyjątkową moc rozdzielczą split-BioID poprzez rozdzielenie dwóch odrębnych kompleksów białkowych zaangażowanych w szlak wyciszania genów za pośrednictwem miRNA9.
Łącznie, w jednym i prostym teście, split-BioID pozwala na odkrycie i specyficzne przypisanie PPI do zdefiniowanych jednostek funkcjonalnych, w których dane białko jest zaangażowane, pod warunkiem, że znane jest dodatkowe białko oddziałujące z odpowiedniego kompleksu białkowego.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy (lodowaty)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>Aby zrobić bufor TAE</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Weź żele agarozowe TAE do analizy DNA i ekstrakcji</td></tr><tr><td>Roztwór amoniaku 25% NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>Aby rozpuścić biotynę</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>Aby wybrać przekształcone bakterie</td></tr><tr><td>Bioruptor plus urządzenie do sonifikacji</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Inne urządzenia do sonifikacji są również w porządku</td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Do dodania do podłoża wzrostowego w celu stymulacji wydajnej biotynylacji</td></tr><tr><td>Frakcja albuminy surowicy bydlęcej V</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>Stosowany w Western blot i wzorzec białka w testach Bradford</td></tr><tr><td>Ultra odczynnik Bradford</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>Każda inna metoda/zestaw do oznaczania białek jest w porządku, ten konkretny odczynnik jest bardziej tolerancyjny na detergent niż inne odczynniki Bradford</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>Każdy inny model jest również w porządku</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów z podziałem BioID (fuzja NBirA*)</td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>Jeśli używasz innej linii komórkowej, użyj odpowiedniego optymalnego zestawu</td></tr> do <tr><td>minipreppingu DNA</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>Każdy inny zestaw jest również w porządku</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Dox jest światłoczuły</td></tr><tr><td>Aplikacja DTT</td><td></td><td>A2948</td><td>Przygotuj 1M roztwór podstawowy, przechowuj w temperaturze -20 stopni; C i zawsze używaj świeżej</td></tr><tr><td>streptawidyny sprzężonej z DyLight 680</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td><td>do użytku z urządzeniem do skanowania LiCor Western blot</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>Kulki C1 nie są pokryte BSA, co jest preferowane do dalszych zastosowań MS (brak wycieku BSA w końcowej elucji)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>Zrób zapas 500 mM, dostosuj pH do 8, rozpuszczając proszek EDTA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>Przygotować 70% roztwór podstawowy, w którym Doksycyklina może być rozpuszczona w 10 mg.mL-1</td></tr><tr><td>Fastgene Gel/PCR Zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>Nippon</td><td>Genetics FG-91302</td><td>Każdy inny zestaw jest również w porządku</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>Aby dostosować pH roztworu podstawowego biotyny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 500 mM, dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-FL, 0,45&nbsp; &mikro; m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Ta membrana wykazuje minimalną autofluorescencję, gdy jest używana z urządzeniem do skanowania LiCor Western blot</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12083</td><td>Zrób roztwór podstawowy 5M</td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>Aby zeskanować błonę Western blot ozdobioną przeciwciałem znakowanym fluoroforem</td></tr><tr><td>Liniowa polietyleninomina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>Każdy inny odczynnik do transfekcji jest również w porządku</td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>Do blokowania błon Western blot</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów podzielonych BioID (fuzja NBirA*)</td></tr><tr><td>Na-deoksycholan</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Wykonaj 10% (w/v) roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>Przygotuj roztwór podstawowy 5M</td></tr><tr><td>NP-40 (substytut Nonidet P40)</td> <td>Sigma</td><td>74385</td><td>Przygotuj 20% (v/v) roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>Enzym restrykcyjny do klonowania plazmidów rozszczepionych BioID (fuzja CBirA*)</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>Do mycia komórek przed złomowaniem</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów podzielonych BioID (fuzja CBirA*)</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Dodawany do buforu do lizy w celu zapobiegania białku degradacja</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Plazmid Split-BioID, pośredniczy w koekspresji NBirA*-FKBP i CBirA*-FRB, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Split-BioID plazmid, pośredniczy w koekspresji FKBP-NBirA* i CBirA*-FRB, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Plazmid Split-BioID, pośredniczy w koekspresji NBirA*-FKBP i FRB-CBirA*, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Split-BioID, pośredniczy w koekspresji FKBP-NBirA* i FRB-CBirA*, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami</td></tr><tr><td>Zestaw Q5 High-Fidelity PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>Wzmocnienie kodowania ORF dla białek, które mają być badane. Każda inna termostabilna polimeraza DNA jest w porządku.</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Aby podwiązać fragmenty DNA do plazmidów podzielonego BioID, każdy inny system ligacji DNA jest w porządku.</td></tr><tr><td>Żele prefabrykowane RunBlue 4-20% SDS</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>Do użycia podczas uruchamiania próbek do analizy MS</td></tr><tr><td>Bufor do próbek RunBlue LDS</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>Bufor do prefabrykatów żelowych RunBlue</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Występuje w postaci 20% roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Surowicy wolnej od tet</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>Używamy surowicy wolnej od tet, aby zminimalizować podstawową ekspresję białek fuzyjnych</td></tr><tr><td>System Trans-Blot Turbo Transfer</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>Szybki zachodni system transferu blottingu, każdy inny system transferowy jest również w porządku</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>Przygotuj 1M roztwory podstawowe o odpowiednim pH (7,4 i 8)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>Przygotuj 20% (v/v) roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>Stosowany w Western blot, Tween 20 prowadzi do wysokiej fluorescencji tła i powinien być pominięty na etapie blokowania i ostatniego mycia</td></tr></tbody></table>

split-bioid — analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Aby uzupełnić istniejące podejścia do oczyszczania powinowactwa (AP) do identyfikacji interakcji białko-białko (PPI), wprowadzono enzymy, które umożliwiają zależne od bliskości znakowanie białek w żywych komórkach. Jeden z takich enzymów, BirA* (stosowany w podejściu BioID), pośredniczy w biotynylacji białek w zakresie około 10 nm. W związku z tym, po połączeniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i uleganiu ekspresji w komórkach, umożliwia znakowanie białek proksymalnych w ich naturalnym środowisku. W przeciwieństwie do AP, która opiera się na oczyszczaniu złożonych kompleksów białkowych, BioID wykrywa białka, które zostały oznaczone w komórkach, bez względu na to, czy nadal wchodzą w interakcję z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, gdy są izolowane. Ponieważ biotynyluje białka proksymalne, można ponadto wykorzystać wyjątkowe powinowactwo streptawidyny do biotyny, aby bardzo skutecznie je wyizolować. Podczas gdy BioID działa lepiej niż AP w identyfikacji przejściowych lub słabych interakcji, zarówno podejścia AP, jak i spektrometrii mas BioID zapewniają przegląd wszystkich możliwych interakcji, jakie może mieć dane białko. Nie zawierają one jednak informacji na temat kontekstu każdego zidentyfikowanego IPP. Rzeczywiście, większość białek jest zazwyczaj częścią kilku kompleksów, odpowiadających różnym etapom dojrzewania lub różnym jednostkom funkcjonalnym. Aby rozwiązać to powszechne ograniczenie obu metod, opracowaliśmy test komplementacji fragmentów białek oparty na enzymie BirA*. W tym teście dwa nieaktywne fragmenty BirA* mogą ponownie złożyć się w aktywny enzym, gdy znajdą się w bliskiej odległości od dwóch oddziałujących białek, z którymi są połączone. Uzyskany w ten sposób test split-BioID umożliwia znakowanie białek, które gromadzą się wokół pary oddziałujących ze sobą białek. Pod warunkiem, że te dwa elementy oddziałują na siebie tylko w danym kontekście, split-BioID umożliwia analizę określonych zależnych od kontekstu jednostek funkcjonalnych w ich natywnym środowisku komórkowym. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku do testowania i stosowania split-BioID do pary oddziałujących białek.

Aby zilustrować działanie tej metody, otwarte ramki odczytu (ORF) białek Ago2, TNRC6C oraz Dicer (wszystkie zaangażowane w ścieżkę wyciszania genów zależną od miRNA) sklonowano w plazmidach split-BioID. Znane jest, że Ago2 oddziałuje z TNRC6C w obrębie kompleksu wyciszającego indukowanego przez miRNA (miRISC), który hamuje translację i stymuluje degradację docelowych mRNA14. Przed złożeniem miRISC, Ago2 oddziałuje z Dicerem, enzymem wytwarzającym dojrzałe miRNA, w obrębie kompleksu, w którym może dojść do załadowania miRNA15. W związku z tym metodę split-BioID zastosowano do pary Ago2/Dicer lub pary Ago2/TNRC6C. Dla każdej pary badanych białek, Ago2 połączono fuzją albo z NBirA*, albo z CBirA* przy użyciu naszych plazmidów split-BioID (Rycina 2), a Dicer i TNRC6C z odpowiednim, komplementarnym fragmentem BirA*. Dodatkowo każde białko połączono fuzją z CBirA* i sparowano z fuzją NBirA*-GFP jako kontrolę negatywną. W rezultacie dla każdej pary badanych białek przetestowano cztery warianty (Tabela 1).
Aby sprawdzić, czy split-BioID ulega aktywacji w wyniku oddziaływania badanej pary białek, zastosowano schemat przedstawiony na Rysunku 1. Plasmidy wprowadzono metodą przejściowej transfekcji do linii komórkowej HeLa kompatybilnej z systemem tet. Ekspresję białek fuzyjnych indukowano doksycykliną (dox), a biotinylację stymulowano poprzez dodanie nadmiaru biotyny do pożywki hodowlanej. Po 20 h inkubacji z dox i biotyną komórki poddano lizie, a następnie analizowano za pomocą techniki Western blotting, wykorzystując koniugowaną streptawidynę do wykrywania białek biotinylowanych. W komórkach ssaków w próbce nietransfekowanej koniugowana streptawidyna zazwyczaj wykrywa dwa główne prążki (Rysunek 3, gwiazdki), które odpowiadają endogennie biotinylowanym białkom (najprawdopodobniej karboksylazom mitochondrialnym). Te dwa prążki są obecne we wszystkich próbkach i mogą służyć jako wewnętrzne kontrole ładowania, dzięki czemu wykrywanie białka konstytutywnego w celu kontroli ilości naniesionego białka jest zbędne. Typowo dla eksperymentów BioID/split-BioID, dodatkowe główne prążki, które można zaobserwować, to białka fuzyjne, które uległy samobiotynylacji. Nawet jeśli nie widać żadnego innego biotinylowanego białka, wykrycie biotinylacji białek fuzyjnych na tym etapie już wskazuje, że dwa badane białka weszły w interakcję w komórkach. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 3 widać wyraźnie, że zastosowanie białka fuzyjnego NBirA*-Ago2 w parze z fuzjami CBirA* do TNRC6C lub Dicer jest bardziej efektywne niż przeciwstawne kombinacje, w których CBirA*-Ago2 jest sparowany z fuzjami NBirA* pozostałych dwóch białek (Rysunek 3, górny panel, porównać intensywność ścieżek 2-3 ze ścieżkami 6-7). Ponadto aktywacja była specyficzna, ponieważ żadna z fuzji CBirA* nie była w stanie aktywować kontrolnego białka fuzyjnego NBirA*-GFP do istotnego poziomu (Rysunek 3, porównać ścieżki 1, 4-5 ze ścieżką 8, która odpowiada komórkom nietransfekowanym). Ponieważ w naszych plazmidach NBirA* posiada znacznik myc, a CBirA* znacznik FLAG (Rysunek 2), poziomy ekspresji każdego białka fuzyjnego można analizować za pomocą przeciwciał przeciwko tym dwóm znacznikom (Rysunek 3, dolny panel).
W przypadku zaobserwowania biotynylacji indukowanej interakcją, eksperyment można przeskalować, a biotynilowane białka wyizolować na kuleczkach sprzężonych ze streptawidyną, zgodnie z opisem w punkcie 4 protokołu (Rysunek 4). Podczas pierwszej izolacji wszystkie etapy oczyszczania można analizować za pomocą Western blottingu (Rysunek 5). Zazwyczaj wiązanie do kuleczek powinno być niemal ilościowe, a w przemyciach praktycznie nie powinno być obserwowane żadnych przecieków. Przed przygotowaniem próbek do spektrometrii mas zalecamy wykonanie Western blottingu, aby upewnić się, że indukowana biotynylacja przebiegła zgodnie z oczekiwaniami i że białka fuzyjne zostały wyekspresowane. Brak ekspresji białek fuzyjnych wynika albo z niskiej wydajności transfekcji, albo z wadliwej indukcji doksycykliną. Jeśli białka fuzyjne zostały wyekspresowane, ale nie zaobserwowano biotynylacji, należy sprawdzić, czy do medium faktycznie dodano nadmiar biotyny (50 μM) i czy roztwór zapasowy biotyny jest nadal aktywny. Gdy materiał eluowany jest analizowany na żelu białkowym barwionym Coomassie (Rysunek 6), zazwyczaj najsilniejszy prążek pojawia się na wysokości około 17 kDa i odpowiada monomerycznej streptawidynie. Można również zaobserwować prążki odpowiadające endogennym białkom biotynylowanym oraz białkom fuzyjnym. Zazwyczaj wycinamy obszar ścieżki próbki powyżej prążka streptawidyny aż do dołka startowego (Rysunek 6). Wycięty fragment można przechowywać w probówce 1,5 mL i wysłać do pracowni spektrometrii mas. Alternatywnie, białka związane można poddać trawieniu trypsyną bezpośrednio na kuleczkach sprzężonych ze streptawidyną, a następnie eluować strawione peptydy z kolumny. Do analizy surowych danych MS rutynowo wykorzystujemy oprogramowanie MaxQuant16 (stosując głównie parametry domyślne i dodając biotynylację lizyny jako możliwą modyfikację potranslacyjną; szczegóły oraz typowe wyniki MS znajdują się w referencji 9) oraz zestaw narzędzi Perseus17 do późniejszej analizy statystycznej; oba programy są darmowe. Próbki są zazwyczaj analizowane w trzech powtórzeniach biologicznych. Dzięki zastosowaniu kwantyfikacji bezznacznika (label-free quantification) można zidentyfikować białka specyficznie wzbogacone w stosunku do warunków kontrolnych. Aby odsiać endogennie biotynylowane białka oraz białka niespecyficznie znakowane przez enzym BirA*, bierzemy pod uwagę tylko te białka, które są znacząco wzbogacone w porównaniu do wyników z sześciu zbiorów danych wygenerowanych z sześcioma niepowiązanymi białkami. Dodatkowo uwzględniamy tylko te wyniki, które są wzbogacone w porównaniu do zbioru danych split-BioID, w którym białka fuzyjne NBirA* zastąpiono NBirA*-GFP. Zaproponowano inne strategie analizy danych, w szczególności zastosowanie znakowania stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowlach komórkowych (SILAC) dla proteomiki ilościowej18. Ponadto opisano różne strategie bezpośredniej izolacji biotynilowanych peptydów przy użyciu wariantu streptawidyny o obniżonym powinowactwie do biotyny18, specjalnych warunków elucji z użyciem rozpuszczalników organicznych19 lub przeciwciał specyficznych dla biotyny20,21. Choć niekoniecznie prowadzi to do odkrycia większej liczby białek, identyfikacja miejsc biotynylacji zwiększa pewność co do specyficzności wyników i jest przydatna przy określaniu topologii interakcji.
<img alt="Schemat przepływu pracy proteomicznej przedstawiający analizę proteomiczną Kompleksu A za pomocą split-BioID i analizy MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd procedury split-BioID. Białko 1 oddziałuje z białkiem 2 jako część Kompleksu A lub z białkiem 3 jako część Kompleksu B. Aby specyficznie zbadać skład Kompleksu A, metodę split-BioID można zastosować do białek 1 i 2. Fotografia spektrometru mas znajduje się na licencji Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported i została pobrana ze strony https://commons.wikimedia.org pod nazwą pliku ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapy plazmidów do edycji genów: sekwencje NBirA, FKBP, CBirA, FRB na schemacie wektora z miejscami restrykcyjnymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kasety ekspresyjne plazmidów split-BioID. Udostępniamy cztery plazmidy, aby umożliwić przetestowanie wszystkich kombinacji białek fuzyjnych NBirA* i CBirA*. Plazmidy oraz pełne mapy są dostępne na stronie addgene.org pod wskazanymi numerami. Plazmidy posiadają element odpowiedzi na tetracyklinę (7x tetO) i muszą być stosowane w linii komórkowej kompatybilnej z systemem ekspresji tet. Należy również zauważyć, że we wszystkich plazmidach ORF dla FKBP i FRB są odpowiednio połączone z fragmentami NBirA* i CBirA*. Te dwa białka oddziałują ze sobą tylko w obecności rapamycyny, zatem plazmidy te można wykorzystać do szybkiego przetestowania systemu w obecności lub braku tego związku chemicznego9. Wskazane miejsca restrykcyjne są unikalne. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań białkowych przy użyciu SDS-PAGE; prążki oznaczone jako Dicer, TNRC6C, Ago2; detekcja streptawidyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Typowy Western blot dla eksperymentu split-BioID. Panel górny: detekcja biotynylowanych białek za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny. Panel dolny: detekcja białek fuzyjnych z użyciem przeciwciał anty-Myc i anty-FLAG. Przebadano dwie pary białek: Ago2/TNRC6C oraz Ago2/Dicer. W ścieżkach 2 i 3 Ago2 zostało dołączone do fragmentu CBirA*. W ścieżkach 6 i 7 Ago2 zostało dołączone do fragmentu NBirA*. Nie zaobserwowano istotnego sygnału, gdy którakolwiek z trzech białek została połączona z NBirA*-GFP (ścieżki 1, 4-5). Gwiazdki wskazują prążki odpowiadające endogennie biotynylowanym białkom, które mogą służyć jako wewnętrzne kontrole załadunku. Rycina ta jest opracowaniem Ryciny 5B z pracy Schopp et al.9 na podstawie licencji Creative Commons Attribution 4.0 International. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat oczyszczania biotyny: zbieranie komórek, lizowanie, wiązanie do kulek magnetycznych, płukanie, analiza SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przegląd procedury immunoprecypitacji ze streptawidyną (pulldown). Przedstawiono główne etapy izolacji białek biotynylowanych do analizy spektrometrią mas. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza Western blot z użyciem koniugatu streptawidyny, oczyszczanie białek, wyniki elektroforezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Typowy Western blot dla eksperymentu streptawidynowego pulldown. Na żel SDS-poliakrylamidowy naniesiono równe objętości każdej z wskazanych próbek. Po przeprowadzeniu Western blottingu białka biotynilowane wykryto za pomocą streptawidyny sprzężonej z HRP. Wskazano prążki odpowiadające NBirA*-TNRC6C oraz CBirA*-Ago2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej SDS-PAGE; rozdzielanie białek; Split-BioID, NBirA*-TNRC6C, biotyna-streptawidyna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Typowy żel białkowy barwiony Coomassie do analizy spektrometrią mas.** Próbka elowana z kulek sprzężonych ze streptawidyną została naniesiona na gotowy żel białkowy i poddana elektroforezie do momentu, aż próbka przemieściła się o 2-3 cm. Główny prążek widoczny przy około 17 kDa to streptawidyna. Obszar bezpośrednio nad tym prążkiem zostaje wycięty i przesłany do laboratorium spektrometrii mas. Wskazano prążki odpowiadające NBirA*-TNRC6C oraz CBirA*-Ago2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka do transfekcji</td>
			<td colspan="3">Badany warunek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA*-białko1/CBirA*-białko2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA*-białko1/NBirA*-białko2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA*-GFP/CBirA*-białko1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA*-GFP/CBirA*-białko2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">brak transfekcji</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Typowe warunki testowane podczas stosowania metody split-BioID dla dwóch białek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter do sekwencjonowania</td>
			<td>sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter odwrotny do kasety 1 (fuzja CBirA*)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter odwrotny do kasety 2 (fuzja NBirA*)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Primery sekwencyjne dla plazmidów split-BioID.

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie składu kompleksów białkowych, które specyficznie gromadzą się wokół pary oddziałujących białek będących przedmiotem zainteresowania, przy użyciu split-BioID, testu komplementacji fragmentów białka, który indukuje zależną od bliskości biotynylację białek w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak to, w jaki sposób kompleksy białkowe dynamicznie się przebudowują, aby regulować różne funkcje komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia łatwą identyfikację specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnych środowiskach komórkowych i z bardzo wysoką rozdzielczością.W przypadku końcowej analizy spektrometrii mas następujące kroki należy wykonać w warunkach wolnych od keratyny, a wszystkie materiały i odczynniki powinny być jak najbardziej wolne od keratyny. Po sklonowaniu ORF dwóch interesujących białek do podzielonego plazmidu BioID, przeprowadzeniu transfekcji przejściowej, a następnie dodaniu pożywki uzupełnionej biotyną zgodnie z protokołem tekstowym, użyj PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Dodaj 1,5 mililitra PBS do każdej płytki i użyj skrobaka, aby zebrać komórki, a następnie przenieś komórki dla każdego stanu do oddzielnej 15-mililitrowej probówki i obracaj probówki pod ciśnieniem 1,200 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Usuń supernatanty i zatrzaskowo zamroź granulki w ciekłym azocie. Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Aby przygotować lizaty komórkowe, użyj jednego mililitra buforu do lizy RT do ponownego zawieszenia granulek.Następnie przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 25 od 10 do 20 razy. Następnie należy poddać próbki działaniu sonifikacyjnym. Następnie dodać 100 mikrolitrów 20% Triton X-100 na 900 mikrolitrów odzyskanego sonikowanego lizatu, aby uzyskać końcowe stężenie 2% Dodaj 2,3 mililitra 50 milimolowego Tris, pH 7,4, na mililitr lizatu, aby dostosować stężenie NaCl do 150 milimolowych w celu wiązania się z kulkami streptawidyny.Następnie rozprowadź dostosowane lizaty w 1,5-mililitrowych probówkach i odwiruj je przy 16 000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. Przenieść supernatanty do probówki o pojemności 15 mililitrów i zachować od 50 do 100 mikrolitrów jako materiał wejściowy. Aby wykonać ściąganie streptawidyny, dla każdego warunku przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny magnetycznej sprzężonej ze streptawidyną do rurki o pojemności 1,5 mililitra.Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj około minuty przed wyjęciem bufora do przechowywania. Za pomocą jednego mililitra buforu równowagi umyj kulki, delikatnie mieszając. Następnie równomiernie wyślij zrównoważone koraliki w niezbędnej liczbie tub i umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym.Po usunięciu bufora równowagi, ponownie zawiesić każdy zestaw kulek z równymi ilościami odpowiednich lizatów komórkowych. Następnie inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obracającym się kole przez noc. Następnego dnia umieść probówki na stojaku magnetycznym.Poczekaj, aż kulki przykleją się do boku probówek i przenieś supernatanty do 15-mililitrowej probówki oznaczonej jako przepływ. Mając 200 mikrolitrów pierwszego buforu do mycia, ponownie zawieś kulki w każdej tubie i połącz każdy zestaw ponownie zawieszonych kulek odpowiadających jednemu warunkowi w 1,5-mililitrowych probówkach. Użyj jednego mililitra bufora do mycia, aby umyć koraliki dwukrotnie na obracającym się kole przez osiem minut.Następnie wykonaj po dwa płukania dla myjących dwa, trzy i cztery. Aby upewnić się, że bufor płuczący został całkowicie usunięty po ostatnim etapie płukania, po usunięciu większości supernatantu należy odwirować próbki. Następnie umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym i usuń pozostały bufor.Dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek, a następnie inkubuj próbki w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez piętnaście minut i natychmiast przenieś probówki do stojaka magnetycznego. Przenieść eluowaną próbkę do świeżej probówki i przechowywać probówki w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania. Dla każdej próbki wejściowej należy przygotować próbkę PAGE, mieszając równe ilości białka z odpowiednią objętością bufora ładującego 3X SDS w łącznej objętości 28 mikrolitrów.Następnie przygotuj próbki PAGE, mieszając pięć mikrolitrów każdej próbki elucyjnej z 2,5 mikrolitrami bufora ładującego 3X SDS. Załaduj próbki na żel poliakrylamidowy SDS. Następnie przystąp do elektroforezy i western blottingu zgodnie z protokołem tekstowym.Aby przeprowadzić SDS-PAGE do analizy MS, dodaj 6,25 mikrolitra buforu 4X do 18,75 mikrolitrów każdej próbki elucyjnej i uruchom próbki na 4 do 20% wstępnie odlanym żelu SDS, aż przeniosą się na dwa do trzech centymetrów do żelu. Na 15-centymetrowej szalce Petriego wybarwić żel koloidalną barwą Coomassie Brilliant Blue G250. Użyj czystego skalpela, aby wyciąć całe pasy dla każdej próbki, z wyjątkiem pasma streptawidyny, i przenieś wycięte pasma do 1,5 mililitrowych probówek w celu analizy stwardnienia rozsianego.Oprócz endogennych białek biotynylowanych zidentyfikowanych w eksperymencie BioID, split-BioID, dodatkowe główne prążki obserwowane przez western blot to białka fuzyjne, które uległy samobiotynylacji, co wskazuje, że dwa testowane białka, w tym przykładzie Ago2 i TNRC6C lub Ago2 i Dicer, oddziaływały w komórkach. Ponadto wyniki western blot wskazują, że posiadanie białka fuzyjnego NBirA*Ago2 sparowanego z fuzjami CBirA* do TNRC6C lub Dicer jest bardziej efektywne niż odwrotne kombinacje, w których CBirA*Ago2 jest sparowane z fuzjami NBirA* pozostałych dwóch białek. Co więcej, aktywacja była specyficzna, ponieważ żadna z fuzji CBirA* nie mogła aktywować kontrolnego białka fuzyjnego NBirA*GFP do znacznych poziomów.Podczas wykonywania izolacji po raz pierwszy wszystkie etapy oczyszczania powinny być analizowane za pomocą western blotingu. Jak pokazano tutaj, wiązanie z koralikami powinno być prawie ilościowe i praktycznie nie należy zaobserwować przeciekania w praniu. Gdy eluowany materiał jest uruchamiany na barwionym żelu Coomassie po ekspresji białka i indukowanej biotynylacji, najsilniejsze obserwowane pasmo przebiega na poziomie około 17 kilodaltonów i odpowiada monomerycznej streptawidynie.Obszar pasa pobierania próbek powyżej pasma streptawidyny w górę studzienki załadowczej jest zwykle wycinany do analizy MS. Stosując tę procedurę do dwóch podanych białek, ważne jest, aby przetestować różne kombinacje białek fuzyjnych. Rzeczywiście, często zaobserwowaliśmy, że ogólna wydajność biotynylacji może ściśle zależeć od tego, które białko jest przyłączone do końcowych fragmentów BirA N lub C.Równie ważne jest dodanie co najmniej jednego eksperymentu z kontrolą ujemną rozszczepionego BioID. Na przykład na parze oddziałujących białek, które nie są powiązane z parą białek będących przedmiotem zainteresowania. Zgodnie z tą procedurą i spektrometrią mas należy zastosować analizę obliczeniową w celu oceny zidentyfikowanych peptydów w porównaniu z doświadczeniami kontroli ujemnej.Korzystamy na przykład z oprogramowania MaxQuant i Perseus, które zostało opracowane przez laboratoria Cox and Mann w Monachium w Niemczech.

split-bioid-proteomic-analysis-context-specific-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę split-BioID do analizy kompleksów białkowych w natywnym środowisku komórkowym. Ta technika umożliwia identyfikację specyficznych interakcji białkowych z wysoką rozdzielczością.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Przeglądaj więcej filmów