Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie składu kompleksów białkowych, które specyficznie gromadzą się wokół pary oddziałujących białek będących przedmiotem zainteresowania, przy użyciu split-BioID, testu komplementacji fragmentów białka, który indukuje zależną od bliskości biotynylację białek w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak to, w jaki sposób kompleksy białkowe dynamicznie się przebudowują, aby regulować różne funkcje komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia łatwą identyfikację specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnych środowiskach komórkowych i z bardzo wysoką rozdzielczością.

W przypadku końcowej analizy spektrometrii mas następujące kroki należy wykonać w warunkach wolnych od keratyny, a wszystkie materiały i odczynniki powinny być jak najbardziej wolne od keratyny. Po sklonowaniu ORF dwóch interesujących białek do podzielonego plazmidu BioID, przeprowadzeniu transfekcji przejściowej, a następnie dodaniu pożywki uzupełnionej biotyną zgodnie z protokołem tekstowym, użyj PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Dodaj 1,5 mililitra PBS do każdej płytki i użyj skrobaka, aby zebrać komórki, a następnie przenieś komórki dla każdego stanu do oddzielnej 15-mililitrowej probówki i obracaj probówki pod ciśnieniem 1,200 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Usuń supernatanty i zatrzaskowo zamroź granulki w ciekłym azocie. Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Aby przygotować lizaty komórkowe, użyj jednego mililitra buforu do lizy RT do ponownego zawieszenia granulek.

Następnie przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 25 od 10 do 20 razy. Następnie należy poddać próbki działaniu sonifikacyjnym. Następnie dodać 100 mikrolitrów 20% Triton X-100 na 900 mikrolitrów odzyskanego sonikowanego lizatu, aby uzyskać końcowe stężenie 2% Dodaj 2,3 mililitra 50 milimolowego Tris, pH 7,4, na mililitr lizatu, aby dostosować stężenie NaCl do 150 milimolowych w celu wiązania się z kulkami streptawidyny.

Następnie rozprowadź dostosowane lizaty w 1,5-mililitrowych probówkach i odwiruj je przy 16 000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. Przenieść supernatanty do probówki o pojemności 15 mililitrów i zachować od 50 do 100 mikrolitrów jako materiał wejściowy. Aby wykonać ściąganie streptawidyny, dla każdego warunku przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny magnetycznej sprzężonej ze streptawidyną do rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj około minuty przed wyjęciem bufora do przechowywania. Za pomocą jednego mililitra buforu równowagi umyj kulki, delikatnie mieszając. Następnie równomiernie wyślij zrównoważone koraliki w niezbędnej liczbie tub i umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym.

Po usunięciu bufora równowagi, ponownie zawiesić każdy zestaw kulek z równymi ilościami odpowiednich lizatów komórkowych. Następnie inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obracającym się kole przez noc. Następnego dnia umieść probówki na stojaku magnetycznym.

Poczekaj, aż kulki przykleją się do boku probówek i przenieś supernatanty do 15-mililitrowej probówki oznaczonej jako przepływ. Mając 200 mikrolitrów pierwszego buforu do mycia, ponownie zawieś kulki w każdej tubie i połącz każdy zestaw ponownie zawieszonych kulek odpowiadających jednemu warunkowi w 1,5-mililitrowych probówkach. Użyj jednego mililitra bufora do mycia, aby umyć koraliki dwukrotnie na obracającym się kole przez osiem minut.

Następnie wykonaj po dwa płukania dla myjących dwa, trzy i cztery. Aby upewnić się, że bufor płuczący został całkowicie usunięty po ostatnim etapie płukania, po usunięciu większości supernatantu należy odwirować próbki. Następnie umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym i usuń pozostały bufor.

Dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek, a następnie inkubuj próbki w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez piętnaście minut i natychmiast przenieś probówki do stojaka magnetycznego. Przenieść eluowaną próbkę do świeżej probówki i przechowywać probówki w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania. Dla każdej próbki wejściowej należy przygotować próbkę PAGE, mieszając równe ilości białka z odpowiednią objętością bufora ładującego 3X SDS w łącznej objętości 28 mikrolitrów.

Następnie przygotuj próbki PAGE, mieszając pięć mikrolitrów każdej próbki elucyjnej z 2,5 mikrolitrami bufora ładującego 3X SDS. Załaduj próbki na żel poliakrylamidowy SDS. Następnie przystąp do elektroforezy i western blottingu zgodnie z protokołem tekstowym.

Aby przeprowadzić SDS-PAGE do analizy MS, dodaj 6,25 mikrolitra buforu 4X do 18,75 mikrolitrów każdej próbki elucyjnej i uruchom próbki na 4 do 20% wstępnie odlanym żelu SDS, aż przeniosą się na dwa do trzech centymetrów do żelu. Na 15-centymetrowej szalce Petriego wybarwić żel koloidalną barwą Coomassie Brilliant Blue G250. Użyj czystego skalpela, aby wyciąć całe pasy dla każdej próbki, z wyjątkiem pasma streptawidyny, i przenieś wycięte pasma do 1,5 mililitrowych probówek w celu analizy stwardnienia rozsianego.

Oprócz endogennych białek biotynylowanych zidentyfikowanych w eksperymencie BioID, split-BioID, dodatkowe główne prążki obserwowane przez western blot to białka fuzyjne, które uległy samobiotynylacji, co wskazuje, że dwa testowane białka, w tym przykładzie Ago2 i TNRC6C lub Ago2 i Dicer, oddziaływały w komórkach. Ponadto wyniki western blot wskazują, że posiadanie białka fuzyjnego NBirA*Ago2 sparowanego z fuzjami CBirA* do TNRC6C lub Dicer jest bardziej efektywne niż odwrotne kombinacje, w których CBirA*Ago2 jest sparowane z fuzjami NBirA* pozostałych dwóch białek. Co więcej, aktywacja była specyficzna, ponieważ żadna z fuzji CBirA* nie mogła aktywować kontrolnego białka fuzyjnego NBirA*GFP do znacznych poziomów.

Podczas wykonywania izolacji po raz pierwszy wszystkie etapy oczyszczania powinny być analizowane za pomocą western blotingu. Jak pokazano tutaj, wiązanie z koralikami powinno być prawie ilościowe i praktycznie nie należy zaobserwować przeciekania w praniu. Gdy eluowany materiał jest uruchamiany na barwionym żelu Coomassie po ekspresji białka i indukowanej biotynylacji, najsilniejsze obserwowane pasmo przebiega na poziomie około 17 kilodaltonów i odpowiada monomerycznej streptawidynie.

Obszar pasa pobierania próbek powyżej pasma streptawidyny w górę studzienki załadowczej jest zwykle wycinany do analizy MS. Stosując tę procedurę do dwóch podanych białek, ważne jest, aby przetestować różne kombinacje białek fuzyjnych. Rzeczywiście, często zaobserwowaliśmy, że ogólna wydajność biotynylacji może ściśle zależeć od tego, które białko jest przyłączone do końcowych fragmentów BirA N lub C.

Równie ważne jest dodanie co najmniej jednego eksperymentu z kontrolą ujemną rozszczepionego BioID. Na przykład na parze oddziałujących białek, które nie są powiązane z parą białek będących przedmiotem zainteresowania. Zgodnie z tą procedurą i spektrometrią mas należy zastosować analizę obliczeniową w celu oceny zidentyfikowanych peptydów w porównaniu z doświadczeniami kontroli ujemnej.

Korzystamy na przykład z oprogramowania MaxQuant i Perseus, które zostało opracowane przez laboratoria Cox and Mann w Monachium w Niemczech.