Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z mechanizmami transkrypcyjnymi w dziedzinie regulacji genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zidentyfikować białka oddziałujące z kofaktorem jądrowym.

Co więcej, metoda ta pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy regulacji transkrypcji docelowych czynników jądrowych. Zbierz komórki HEK 293 wykazujące ekspresję ARIP4 oznaczoną flagą 36 godzin po transwekcji, myjąc arkusz komórek lodowatym PBS i zbierając komórki za pomocą skrobaka komórkowego. Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki, a następnie odwiruj przy 8000 g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciokrotnie większej objętości osadu niż bufor o wysokiej zawartości soli. Obracaj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 20 minutach obracania odwirować probówkę o nachyleniu 17,700 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś supernatanty do nowej dwumililitrowej probówki i dodaj bufor rozcieńczający do trzykrotnej objętości supernatantu. Wykonaj kolejną cetrifugację, a następnie przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Podczas 10-minutowego wirowania przemyć 50 mikrolitrów kulek antyflagowych PBS.

Następnie odwirować probówkę o masie 2000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć sklarowany osad i powtórzyć czynności przemywania najpierw 1 molowym chlorowodorkiem glicyny, a następnie jednym molowym chlorowodorkiem tris. Następnie umyj dwukrotnie buforem o niskiej zawartości soli.

Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów umytych kulek z ekstraktami z całych komórek. Delikatnie obracaj mieszaninę przez cztery godziny w temperaturze od dwóch do czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj końcówki, aby przenieść próbkę do mikrokolumny wirowej i pozwól, aby roztwór przepłynął do 1,5 mililitrowej probówki.

Zatrzaskowo zamrozić przepływ w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie umyj koraliki flagi pięciokrotnym buforem o niskiej zawartości soli. Aby wymyć, umieść kolumnę w 1,5 mililitrowej probówce i odwiruj przy 2000 g przez jedną minutę, aby wysuszyć kulki.

Zakryj dno kolumny, a następnie dodaj 50 mikrolitrów 1 molowego chlorowodorku glicyny. Delikatnie potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach umieść kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj przy 2000 g przez jedną minutę.

Zneutralizować eluowany roztwór za pomocą 10 mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku tris i dobrze wymieszać przez pipetowanie i wirowanie. Dodaj 50 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu. 10 mikrolitrów acetonitrylu, dwa mikrolitry ditiotreitolu i 50 mikrolitrów zneutralizowanej próbki.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Po inkubacji pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 333-milimolowego jodoacetamidu do próbki i inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 stopni C. Dodaj 10 mikrolitrów trypsyny do mieszaniny i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia produkt końcowy jest transportowany do zakładu LC-MS/MS lub do laboratorium spektrometrii mas innej firmy w celu analizy. Obraz ten pokazuje srebrne zabarwienie epitopu flagi oznaczonego ARIP4 wyrażonego w komórkach HEK 293 po wytrąceniu immunologicznym przeciwciałem specyficznym dla flagi i oddzieleniu przez elektroforezę. Jako kontrolę, próbne oczyszczanie przeprowadzono na komórkach HEK 293, które nie wykazywały ekspresji białek egzogennych.

Korzystając z naszej metody, możliwe jest zidentyfikowanie przypuszczalnych kofaktorów jądrowych na podstawie ich interesującego czynnika transkrypcyjnego i dalsze pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów regulacji transkrypcji.