Name: Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorami jądrowymi za pomocą analizy LC-MS/MS. Protokół obejmuje immunoprecypitację z komórek HEK 293 i spektrometrię masową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Astellas na rzecz Badań nad Zaburzeniami Metabolicznymi (HT), Fundację Naukową Takeda (HT) oraz przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty Pomocy dla Młodych Naukowców (B) dla HT.

1. Transfekcja
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki HEK293 na 100-milimetrowych płytkach hodowlanych (2 x 106 komórek/naczynie). Hodowla komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 100 μg/ml streptomycyny i 100 jednostek/ml penicyliny. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przetransfekuj komórki 10 μg plazmidu ARIP4 znakowanego FLAG, używając 40 μl odczynnika do transfekcji zgodnie ze wskazówkami producenta11.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Około 36 godzin po transfekcji umyj komórki lodowatym PBS i zbierz komórki za pomocą skrobaka. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować ją w temperaturze 8 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5-krotności objętości osadu 0,4 M buforu KCl (Bufor o wysokiej zawartości soli: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptetanol, 1x koktajl inhibitorów proteazy). Obracać mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 17 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś supernatant (ekstrakt z całych komórek) do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodaj 3x początkową objętość buforu 0 M KCl (bufor rozcieńczający: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy).</li>
	<li>Przeprowadzić kolejne odwirowanie (17 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) i przenieść supernatant (ekstrakt z całych komórek) do nowej probówki o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Podczas wirowania (2.4) przepłukać 50 μl kulek anty-FLAG PBS, 0,1 M chlorowodorkiem glicyny, a następnie 1 M chlorowodorkiem tris, a następnie dwukrotnie przemyć 0,1 M buforem KCl (bufor o niskiej zawartości soli: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy). Wirowanie w tym procesie mycia odbywa się przy 2.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wymieszać 50 μl kulek FLAG z ekstraktami całokomórkowymi i delikatnie obracać mieszaninę przez 4 godziny w temperaturze 2-4 °C (1% ekstraktu z całych komórek z kroku 2.4 należy również przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości jako wejście).</li>
	<li>Przenieść próbkę do mikrokolumny wirowej (spadek grawitacyjny). Utrzymuj przepływ w probówce o pojemności 1,5 ml, zamroź go za pomocą ciekłego azotu i przechowuj w temperaturze -80 °C (sprawdź poziom białka zarówno w wejściu, jak i przepływie za pomocą analizy Western blot).</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,1 M buforu KCl (bufor o niskiej zawartości soli), aby umyć koraliki FLAG (spadek grawitacyjny).</li>
	<li>Powtórz krok 3.4 jeszcze co najmniej cztery razy (w sumie pięć prań).</li>
</ol>
4. Elucja
<ol>
	<li>Umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 2 000 x g przez 1 minutę; kulki wyschną.</li>
	<li>Zakryj dolną część kolumny.</li>
	<li>Dodać 50 μl (równe objętości kulek FLAG) 0,1 M glicyny-HCl (pH 2,5).</li>
	<li>Delikatnie potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 2 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Wymyty roztwór neutralizuje się 10 μl 1 M Tris-HCl (pH 8,0); dobrze wymieszać pipetując lub używając maszyny wirowej.</li>
</ol>
5. Alkilowanie i trypsyna
<ol>
	<li>Do mieszaniny dodać 50 μl 100 mM NH4HCO3, 10 μl CH3CN i 2 μl ditiotreitolu (112 μl objętości całkowitej).</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Umieścić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl 333 mM jodoacetamidu do próbki i inkubować ją w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 10 μl trypsyny (33 ng/μl) do mieszaniny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Analiza LC-MS/MS
<ol>
	<li>Po nocnej trypsynizacji należy przetransportować produkt końcowy do zakładu LC-MS/MS lub do zewnętrznego laboratorium spektrometrii mas w celu analizy12.</li>
</ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wydajna transfekcja jest niezbędna do uzyskania pomyślnego wyniku za pomocą tego protokołu. W związku z tym zalecamy użycie analizy Western blot w celu określenia poziomów białek znakowanych immunoprecypitacją FLAG. Ten krok umożliwia użytkownikom sprawdzenie, czy ich białko będące przedmiotem zainteresowania jest prawidłowo eksprymowane, a ponadto, czy IP zostało przeprowadzone pomyślnie. Poziomy białek oznaczonych flagą powinny być również sprawdzone przed analizą spektrometrii mas.
Próbna p...

Interakcje białko-białko odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach biologicznych. W związku z tym interakcje te są zaangażowane w transdukcję sygnału; transport białek przez błony komórkowe; metabolizm komórkowy; oraz kilka procesów jądrowych, w tym replikacja DNA, naprawa uszkodzeń DNA, rekombinacja i transkrypcja1,2,3,4. Identyfikacja białek biorących udział w tych interakcjach ma zatem kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszego zrozumienia tych procesów komórkowych.
Immunoprecypitacja (IP) to sprawdzona technika używana do analizy interakcji białko-białko. Aby ułatwić identyfikację białek współimmunoprecypitowanych, często stosuje się spektrometrię mas5,6,7,8,9. Poprzez celowanie w znanego członka kompleksu białkowego za pomocą przeciwciała, możliwe jest wyizolowanie kompleksu białkowego, a następnie zidentyfikowanie jego nieznanych składników za pomocą analizy spektrometrii mas. ARIP4 (białko 4 oddziałujące z receptorem androgenowym), koregulator transkrypcji, oddziałuje z białkami receptora jądrowego w celu aktywacji lub stłumienia docelowych promotorów w sposób zależny od kontekstu9,10. Aby lepiej zrozumieć transkrypcyjne mechanizmy regulacyjne rządzące tymi czynnikami jądrowymi, opisujemy kompleksową metodę oczyszczania i identyfikacji białek oddziałujących z ARIP4 za pomocą systemu LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA) (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kolumny Bio-Spin</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy lc-ms/ms

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Koregulatory transkrypcyjne są niezbędne do efektywnej regulacji transkrypcji struktury chromatyny jądrowej. Koregulatory odgrywają różne role w regulacji transkrypcji. Należą do nich bezpośrednia interakcja z czynnikami transkrypcyjnymi, kowalencyjna modyfikacja histonów i innych białek oraz sporadyczna zmiana konformacji chromatyny. W związku z tym ustalenie stosunkowo szybkich metod identyfikacji białek, które oddziałują w tej sieci, ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia podstawowych mechanizmów regulacyjnych. Identyfikacja partnera wiążącego białko za pośrednictwem LC-MS/MS jest zwalidowaną techniką stosowaną do analizy interakcji białko-białko. Poprzez immunoprecypitację wcześniej zidentyfikowanego członka kompleksu białkowego za pomocą przeciwciała (czasami przeciwciała dla znakowanego białka), możliwe jest zidentyfikowanie jego nieznanych interakcji białkowych za pomocą analizy spektrometrii mas. W niniejszej pracy przedstawiono metodę przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji oddziaływań białkowych z udziałem kofaktorów jądrowych i ich partnerów wiążących za pośrednictwem LC-MS/MS. Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie transkrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych docelowych czynników jądrowych.

Zidentyfikowaliśmy silny sygnał ARIP4, około 160 KDa, a także sygnały w kontrolnej próbce mock oraz kilku innych nieznanych białek (Rysunek 1). Analiza LC-MS/MS pozwoliła zidentyfikować zarówno peptydy kompleksu ARIP4, jak i potencjalne peptydowe kofaktory w frakcji kulek FLAG (Tabela 1). W analizie zidentyfikowano p62 (Sequestosome1), znany kofaktor ARIP411 (Tabela 1), co potwierdza skuteczność tego systemu<sup cl...

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym przy użyciu analizy LC-MS/MS. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów transkrypcyjnych w dziedzinie regulacji genów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zidentyfikowania białek wchodzących w interakcje z kofaktorem jądrowym.Ponadto metoda ta pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy regulacji transkrypcyjnej badanych czynników jądrowych. Komórki HEK 293 wykazujące ekspresję ARIP4 z tagiem flag zbiera się 36 godzin po transfekcji, przemywając warstwę komórek lodowatym PBS i zbierając je za pomocą skrobaka do komórek. Komórki przenosi się do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wiruje przy 8000g przez dwie minuty w temperaturze 4°C.Odssać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w pięciokrotnej objętości osadu Buforu Wysokosolnego. Mieszaninę inkubować w rotatorze przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po 20 minutach rotacji odwirować zawartość probówki z prędkością 17 700g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności dwóch mililitrów i dodaj bufor rozcieńczający w ilości trzykrotnie większej niż objętość nadsączu. Przeprowadź kolejną wirowkę, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności dwóch mililitrów. W trakcie 10 minut wirowania przemyj 50 µL kulek anti-flag PBS.Następnie odwiruj próbkę w wirowce z prędkością 2000g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń nadsącz i powtórz etapy płukania, najpierw używając 1 M chlorku glicyny, a następnie 1 M chlorku TRIS. Następnie przemyj dwukrotnie buforem Low salt buffer.Następnie wymieszaj 50 µL wypłukanych kulek z ekstraktami z całych komórek. Delikatnie rotuj mieszaniną przez cztery godziny w temperaturze od 2 do 4 °C. Następnie za pomocą stępionego końcówki przenieś próbkę do mikrokolumny wirowej i pozwól roztworowi spłynąć do probówki o pojemności 1,5 mL.Próbkę przepływową zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Następnie koraliki flag przemyć pięciokrotnie buforem o niskim zasoleniu. W celu elucji umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 2000g przez jedną minutę, aby osuszyć koraliki.Zamknij dół kolumny za pomocą zakrętki, a następnie dodaj 50 µL 1 M chlorku glicyny. Delikatnie mieszaj zawiesinę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach umieść kolumnę w nowej probówce 1,5 mL i wiruj przy 2000g przez jedną minutę.Zneutralizuj eluat 10 µL 1 M Tris-HCl i wymieszaj dokładnie za pomocą pipetowania oraz wortexowania. Dodaj 50 µL 100 mM wodorowęglanu amonu, 10 µL acetonitrylu, 2 µL ditiotreitolu oraz 50 µL zneutralizowanej próbki.Inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 °C. Po inkubacji pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie do próbki dodać 10 µL 333 mM jodooctanu i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Do mieszaniny dodać 10 µL trypsyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.Następnego dnia należy przetransportować produkt końcowy do laboratorium LC-MS/MS lub do zewnętrznego laboratorium spektrometrii mas w celu przeprowadzenia analizy. Na tym obrazie przedstawiono barwienie srebrem białka ARIP4 z tagiem epitopu FLAG wykazanego w komórkach HEK 293 po immunoprecypitacji z użyciem przeciwciała specyficznego dla FLAG i rozdzieleniu metodą elektroforezy. W ramach kontroli przeprowadzono pozorną puryfikację (mock purification) na komórkach HEK 293, które nie wykazywały ekspresji białek egzogennych.Stosując naszą metodę, możliwe jest zidentyfikowanie domniemanych kofaktorów jądrowych za pomocą interesującego nas czynnika transkrypcyjnego, co pozwala na dalsze pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów regulacji transkrypcji.

a-protein-preparation-method-for-high-throughput-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Poznaj metodę identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorami jądrowymi za pomocą analizy LC-MS/MS. Protokół obejmuje immunoprecypitację z komórek HEK 293 i spektrometrię masową.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Przeglądaj więcej filmów