Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS
January 24th, 2017
Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z mechanizmami transkrypcyjnymi w dziedzinie regulacji genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zidentyfikować białka oddziałujące z kofaktorem jądrowym.
Co więcej, metoda ta pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy regulacji transkrypcji docelowych czynników jądrowych. Zbierz komórki HEK 293 wykazujące ekspresję ARIP4 oznaczoną flagą 36 godzin po transwekcji, myjąc arkusz komórek lodowatym PBS i zbierając komórki za pomocą skrobaka komórkowego. Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki, a następnie odwiruj przy 8000 g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciokrotnie większej objętości osadu niż bufor o wysokiej zawartości soli. Obracaj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 20 minutach obracania odwirować probówkę o nachyleniu 17,700 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przenieś supernatanty do nowej dwumililitrowej probówki i dodaj bufor rozcieńczający do trzykrotnej objętości supernatantu. Wykonaj kolejną cetrifugację, a następnie przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Podczas 10-minutowego wirowania przemyć 50 mikrolitrów kulek antyflagowych PBS.
Następnie odwirować probówkę o masie 2000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć sklarowany osad i powtórzyć czynności przemywania najpierw 1 molowym chlorowodorkiem glicyny, a następnie jednym molowym chlorowodorkiem tris. Następnie umyj dwukrotnie buforem o niskiej zawartości soli.
Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów umytych kulek z ekstraktami z całych komórek. Delikatnie obracaj mieszaninę przez cztery godziny w temperaturze od dwóch do czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj końcówki, aby przenieść próbkę do mikrokolumny wirowej i pozwól, aby roztwór przepłynął do 1,5 mililitrowej probówki.
Zatrzaskowo zamrozić przepływ w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie umyj koraliki flagi pięciokrotnym buforem o niskiej zawartości soli. Aby wymyć, umieść kolumnę w 1,5 mililitrowej probówce i odwiruj przy 2000 g przez jedną minutę, aby wysuszyć kulki.
Zakryj dno kolumny, a następnie dodaj 50 mikrolitrów 1 molowego chlorowodorku glicyny. Delikatnie potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach umieść kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj przy 2000 g przez jedną minutę.
Zneutralizować eluowany roztwór za pomocą 10 mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku tris i dobrze wymieszać przez pipetowanie i wirowanie. Dodaj 50 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu. 10 mikrolitrów acetonitrylu, dwa mikrolitry ditiotreitolu i 50 mikrolitrów zneutralizowanej próbki.
Inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Po inkubacji pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 333-milimolowego jodoacetamidu do próbki i inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 stopni C. Dodaj 10 mikrolitrów trypsyny do mieszaniny i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia produkt końcowy jest transportowany do zakładu LC-MS/MS lub do laboratorium spektrometrii mas innej firmy w celu analizy. Obraz ten pokazuje srebrne zabarwienie epitopu flagi oznaczonego ARIP4 wyrażonego w komórkach HEK 293 po wytrąceniu immunologicznym przeciwciałem specyficznym dla flagi i oddzieleniu przez elektroforezę. Jako kontrolę, próbne oczyszczanie przeprowadzono na komórkach HEK 293, które nie wykazywały ekspresji białek egzogennych.
Korzystając z naszej metody, możliwe jest zidentyfikowanie przypuszczalnych kofaktorów jądrowych na podstawie ich interesującego czynnika transkrypcyjnego i dalsze pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów regulacji transkrypcji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę oczyszczania białek interakcji coregulujących za pomocą analizy LC-MS/MS. Technika ma na celu identyfikację białek wchodzących w interakcje z kofaktorem jądrowym, poprawiając nasze zrozumienie mechanizmów regulacji transkrypcji.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Regulacja genów
Tło
- Zrozumienie mechanizmów transkrypcji jest kluczowe w regulacji genów.
- Identyfikacja interakcji białkowych może ujawniać wgląd w procesy komórkowe.
- LC-MS/MS to potężne narzędzie do analizy interakcji białkowych.
- Ta metoda koncentruje się na kofaktorach jądrowych i ich rolach regulacyjnych.
Cel badania
- Identyfikować białka wchodzące w interakcje z kofaktorem jądrowym.
- Wyjaśniać mechanizmy regulacji transkrypcji.
- Dostarczać niezawodnej metody oczyszczania białek.
Stosowane metody
- Zbióranie komórek HEK 293 ekspresujących flag-tagged ARIP4.
- Płukanie komórek lodowatym PBS.
- Zbieranie komórek za pomocą skrobaczka komórkowego.
- Centryfugowanie komórek przy 8000g przez dwie minuty w 4°C.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja białek wchodzących w interakcje z kofaktorami jądrowymi.
- Poprawione zrozumienie mechanizmów transkrypcji.
- Demonstracja efektywności metody LC-MS/MS.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad regulacją genów.
Wnioski
- Metoda dostarcza cennego narzędzia do badania interakcji białkowych.
- Przyczynia się do szerszej wiedzy na temat regulacji genów.
- Przyszłe badania mogą budować na tej technice dla dalszych wglądów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
