Name: Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj metodę sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji kompleksów białkowych w Escherichia coli. Technika ta umożliwia efektywne izolowanie białek o niskiej zawartości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Canadian Foundation for Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ministerstwa Innowacji Ontario oraz grantu Canadian Institutes of Health Research dla J.G. i A.E. Szczep E. coli DY330 z ekspresją czerwieni był miłym prezentem od Donalda L. Courta (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Budowa specyficznego dla genu znakowania SPA w szczepie E. coli DY330
<ol>
 <li>Plazmid pJL148 obejmujący sekwencję DNA znacznika SPA i kasetę markera oporności na antybiotyki kanamycyny (KanR) są używane jako matryca w amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)7. Specyficzny dla genu starter do przodu 45 nt, umieszczony bezpośrednio przed kodonem stop genu docelowego w ramce ze starterem do przodu specyficznym dla znacznika 27 bp (5'- AGCTGGAGGATGGAAAAAGAGAAG -3') i specyficznym dla genu starterem odwrotnym 45 nt, umieszczonym bezpośrednio za kodonem stop genu docelowego w ramce ze starterem odwrotnym specyficznym dla znacznika 27 bp (5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'), stosuje się do amplifikacji znacznika SPA i kasety KanR z pJL148 przy użyciu następujących warunków cyklicznych PCR: 94 °C przez 5 min; 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 min, 68 °C przez 2 minuty i 10 sekund, a następnie 68 °C przez 10 minut. Te amplifikowane sekwencje służą jako substraty dla ektopowo wprowadzonej maszynerii rekombinacji homologicznej λ-Red (patrz poniżej).</li>
 <li>Produkt PCR jest oczyszczany za pomocą zestawu do oczyszczania Qiaquick PCR w celu usunięcia soli, które mogą zakłócać elektroporację. Oczyszczony produkt PCR jest następnie ukierunkowany na integrację na końcu 3' (bezpośrednio przed natywnym kodonem stop) określonego genu w szczepie DY330, w którym ulega ekspresji maszynerii rekombinacji λ-Red10.</li>
 <li>Szczep DY330 λ-Red jest hodowany przez noc w 2 ml pożywki Luria-Bertani (LB) w temperaturze 32 °C przez wytrząsanie z prędkością 180 obr./min. 1 ml kultury przez noc zaszczepia się następnie w 70 ml świeżej pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml. Inokulum hoduje się w temperaturze 32 °C przez wytrząsanie z prędkością 180 obr./min, aż OD600 osiągnie ~0,8.</li>
 <li>Hodowlę przenosi się do świeżej kolby stożkowej o pojemności 250 ml, gdzie komórki indukuje się poprzez inkubację kolby w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C poprzez delikatne wytrząsanie z prędkością 180 obr./min przez 15 minut. Bezpośrednio po indukcji kolbę inkubuje się w kąpieli zawiesinowej w lodowatej wodzie przez co najmniej 30 minut z wytrząsaniem.</li>
 <li>Lodowatą kulturę natychmiast przenosi się do wstępnie schłodzonej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i poddaje odwirowaniu przy 3,993 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Osad komórkowy zawiesza się ponownie w 50 ml lodowatej sterylnej wody i ponownie odwirowuje w temperaturze 3,993 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Osad komórkowy jest następnie ponownie zawieszany w 1 ml zimnej wody i przenoszony do probówki Effendorfa o pojemności 1,5 ml i odwirowywany z maksymalną prędkością przez 20 sekund w temperaturze 4 °C. Po dwóch lub trzech etapach mycia lodowatą wodą, osad ogniw jest ostatecznie zawieszany w 700 μl lodowatej sterylnej wody, w wyniku czego powstają elektrokompetentne ogniwa.</li>
 <li>Poprzez elektroporację jeden μl oczyszczonego amplikonu jest wprowadzany do 40 μl elektrokompetentnych ogniw. Ogniwa są elektroporowane w Bio-Rad GenePulser II o następujących ustawieniach: 2,5 kV, 25 μF z regulatorem impulsów 200 Ω. Po rekombinacji homologicznej i integracji, transformanty, które z powodzeniem połączyły znacznik/kasetę z chromosomem, są wybierane na podstawie oporności na Kan (ryc. 1A). Do Western blotting wybiera się wiele transformantów w celu sprawdzenia prawidłowego wytwarzania (tj. pozytywnego sygnału) białek fuzyjnych znakowanych SPA z przeciwciałem anty-FLAG M2, które jest selektywne w stosunku do epitopów FLAG znacznika SPA.</li>
 <li>Potwierdzony karboksylowy końcowy szczep fuzyjny SPA-tag jest hodowany na dużą skalę w celu wyizolowania rozpuszczalnych kompleksów białkowych z pobranych komórek przy użyciu protokołu oczyszczania SPA. Zarys etapów związanych z procedurą oczyszczania znacznika powinowactwa przedstawiono na rysunku 1B.</li>
</ol>
2. Hodowla i sonikacja
<ol>
 <li>Zaszczepić 100 μl wywaru z glicerolem E. coli znakowanego SPA w 50 ml płynnego podłoża z bulionu (TB) uzupełnionego 50 μl 25 μg/ml roztworu Kan w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml. Kulturę uprawiać przez noc w temperaturze 32 °C. 
 Uwaga: Ponieważ indukowana temperaturą kaseta λ Red w szczepie DY330 znajduje się pod kontrolą represora wrażliwegona temperaturę 10, szczep E. coli znakowany SPA jest uprawiany w temperaturze 32 °C.</li>
 <li>Przenieść 10 ml nocnej kultury do 990 ml świeżej gruźlicy uzupełnionej 25 μg/ml Kan w kolbie o pojemności 4 litrów. Kulturę uprawia się w temperaturze 32 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 250 obr./min, przez 5 do 6 godzin, aż OD600 osiągnie ~ 2 do 3.</li>
 <li>Przenieść 1-litrową kulturę E. coli SPA-tag do czystych butelek wirówkowych i wirować komórki w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman J6-HC @ 3993 x g przez 15 minut.</li>
 <li>Supernatant usuwa się z butelek wirujących. Zawiesić osady komórek E. coli w 25 ml buforu sonikacyjnego. Upewnij się, że butelki wirówkowe są zawsze na lodzie.</li>
 <li>Zawieszony osad przenosi się do 50 ml polipropylenowej probówki Falcon i zamraża przy użyciu ciekłego azotu. Zamrożone komórki są przechowywane w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytkowania.</li>
 <li>Przed sonikacją całkowicie rozmrozić zamrożone komórki, trzymając granulki na lodzie. Rozmrożone próbki przenosi się do sterylnego kubka ze stali nierdzewnej umieszczonego na lodzie w celu sonikacji. Sonda jest zanurzana w próbce i poddawana sonikacji przez 3 minuty. Pozostawia się dodatkowe 2 minuty na schłodzenie próbki przed przegrzaniem.</li>
 <li>Sonikowany lizat komórkowy przenosi się do wstępnie schłodzonej, sterylnej probówki wirówkowej i poddaje wirowaniu w temperaturze 4 °C w wirówce Beckmana za pomocą wirnika JA-17 @ 35 267 x g (16 000 obr./min) przez 15 minut dwa razy. 
 Uwaga: W przypadku oczyszczania białek błonowych, sonikowany lizat komórkowy jest odwirowywany tylko raz przez 15 minut, ponieważ nie wiemy, w jakiej frakcji znajdują się białka błonowe, to znaczy albo w osadzie, albo we frakcji supernatantu. Tak więc, aby uniknąć nadmiernej utraty białek błonowych, wirujemy komórki przez 15 minut w wirowaniu z dużą prędkością, a supernatant jest następnie przetwarzany w celu oczyszczenia (patrz kroki poniżej), gdzie do rozpuszczania białek błonowych stosuje się 1% detergent</li>.
 <li>Supernatant z probówki wirówkowej jest ostrożnie przenoszony do 50 ml polipropylenowej probówki Falcon i zamrażany przy użyciu ciekłego azotu. Sonikowany ekstrakt z zamrożonych komórek jest przechowywany maksymalnie przez okres 6 miesięcy w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie powinowactwa
<ol>
 <li>Przed użyciem 100 μl kulek przeciwflagowych M2 przemywa się 10 objętościami buforu AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% detergentu i 0,1-0,5 mM TCEP [kwas solny tris (2-karboksyetylo)fosfinowy]) bez detergentu i środka redukującego TCEP (tris(2-karboksyetylo)fosfiny).</li>
 <li>Zamrożony, sonikowany ekstrakt komórkowy rozmraża się poprzez umieszczenie probówki w zimnej wodzie. Ekstrakt z rozmrożonych komórek inkubuje się z 3 μl nukleazy benzonazowej przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Do tej mieszaniny dodać niejonowy detergent Triton X-100 (końcowe stężenie detergentu powinno wynosić 0,1%) oraz 200 μl zawiesin kulek agarozowych przeciwflagowych M2. 
 Uwaga: Do wszystkich oczyszczań białek rozpuszczalnych stosuje się 0,1% Triton X-100 w celu zminimalizowania adsorpcji niespecyficznej, podczas gdy jeśli chodzi o oczyszczanie białka błonowego, różne łagodne detergenty niejonowe, takie jak C12E8 (eter dodecylowy glikolu oktaetylenowego), DDM (n-dodecyl β-D-maltozyd) i glikol maltozo-neopentylowy (MNG) mogą być stosowane w stężeniu detergentu 1% w celu zwiększenia rozpuszczania. Ponieważ różne detergenty mają różną skuteczność rozpuszczania białek błonowych, zaleca się przeprowadzanie niezależnych oczyszczań białek przy użyciu więcej niż jednego detergentu.</li>
 <li>Zawartość delikatnie miesza się, obracając probówkę przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą wytrząsarki LabQuake. Po 3 godzinach obrotu probówkę odwirowuje się przy 1 700 x g przez 6 minut. Supernatant jest następnie usuwany ostrożnie, w miarę możliwości, bez naruszania luźnej granulki kulki.</li>
 <li>Osad jest ponownie zawieszany w pozostałym supernatancie, a następnie przenoszony do kolumny przygotowawczej z polipropylenu Bio-Rad o wymiarach 0,8 x 4 cm. Upewnij się, że wyjęto dolne korki wylotowe kolumny, aby umożliwić odpływ eluatów przez przepływ grawitacyjny. Umyj kolumnę 5 razy za pomocą kroku rozszczepienia TEV.</li>
 <li>Po odsączeniu przemytych eluatów, dolny wylot kolumny zostaje zamknięty. Do tej samej kolumny rozszczepienie przeprowadza się poprzez dodanie ~5 do 10 μl (50 jednostek) proteazy TEV i 400 μl buforu 1X AFC na kolumnę. Upewnij się, że górna część kolumny jest zamknięta zaślepką. Kolumnę zawierającą kulki obraca się delikatnie przez noc w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą wytrząsarki LabQuake.</li>
 <li>Zdjąć nasadkę na górze i korek wylotowy na dole kolumny i odsączyć eluaty odzyskane po rozszczepieniu TEV do nowej kolumny zawierającej 200 μl zawiesin kulek kalmoduliny-sefarozy, którą przemywa się 10 objętościami buforu wiążącego kalmodulinę.</li>
 <li>Zarówno górna, jak i dolna część kolumny są mocno przymocowane, a zawartość kolumny jest delikatnie mieszana, obracając przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą wytrząsarki LabQuake.</li>
 <li>Po 3 godzinach obrotu eluat jest spuszczany, zdejmując górną nasadkę i dolny korek kolumny. Kolumnę przemuje się czterokrotnie 200 μl 1X buforu wiążącego kalmodulinę, a następnie jednokrotnie rygorystycznie przemywania 400 μl buforu do przemywania kalmoduliną.</li>
 <li>Związane białko jest eluowane w czterech frakcjach po 50 μl w świeżej probówce Eppendorfa przy użyciu 1X buforu elucji kalmoduliny. Wymyta frakcja jest rozprowadzana w dwóch czystych probówkach Eppendorfa w równych objętościach. Obie rurki są następnie suszone za pomocą próżni o dużej prędkości.</li>
 <li>Wysuszony eluat z jednej probówki jest używany do prowadzenia żelu barwiącego srebro, podczas gdy drugi jest przechowywany w temperaturze -80 °C, przed zastosowaniem spektrometrii mas.</li>
</ol>
4. Barwienie srebra
<ol>
 <li>W przypadku barwienia srebrem do 50 μl wysuszonego eluatu dodaje się połowę objętości buforu próbki 3X SDS (dodecylosiarczan sodu). Po gotowaniu mieszaniny przez 5 minut, próbki umieszcza się w żelu poliakrylamidowym SDS.</li>
 <li>Po zakończeniu pracy żelu ostrożnie umieszcza się go w roztworze utrwalającym (50% metanolu i 10% kwasu octowego) i delikatnie miesza na wytrząsarce obrotowej przez 20 minut. Żel jest następnie płukany w 20% etanolu przez 10 minut.</li>
 <li>Utrwalony żel myje się dwukrotnie dokładnie 500 ml podwójnie destylowanej wody przez 10 minut, aby zapewnić niskie jednolite tło.</li>
 <li>Żel jest następnie delikatnie mieszany w 500 ml tiosiarczanu sodu przez 1 minutę, a następnie następuje dwa etapy płukania wodą destylowaną przez 20 sekund.</li>
 <li>Wodę wylewa się, a żel inkubuje się w 200 ml 0,1% azotanu srebra przez 30 minut. Po tym czasie azotan srebra jest usuwany, a żel przemywa się wodą destylowaną przez 20 sekund w celu usunięcia nadmiaru azotanu srebra.</li>
 <li>Żel jest na koniec ręcznie mieszany w 75 ml roztworu rozwijającego. Po osiągnięciu pożądanej intensywności roztwór rozwijający się odrzuca się i dodaje 80 ml kwasu octowego w celu zatrzymania reakcji. Upewnij się, że inkubujesz żel w kwasie octowym przez co najmniej 20 minut, aby zapewnić prawidłową wizualizację opasek żelowych.</li>
</ol>
5. Proteoliza i przygotowanie próbek do spektrometrii mas
<ol>
 <li>Do wysuszonej próbki dodać 50 μl buforu wytrawiającego i 0,9 μl 100 mM TCEP-HCl (kwas solny tris(2-karboksyetylo)fosfinowy) i inkubować mieszaninę przez 45 minut w temperaturze pokojowej na etapie redukcji. Następnie dodaje się 1 μl 500 mM jodoacetamidu i inkubuje się w ciemności przez kolejne 40 minut, aby umożliwić alkilację próbki.</li>
 <li>Po drugiej rundzie inkubacji dodać do mieszaniny 1 μg unieruchomionej trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 godzin lub przez noc w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że reakcja została zatrzymana, dodając 1 μl kwasu octowego.</li>
 <li>Wstępnie zwilż końcówkę pipety Millipore Zip-Tip, zasysając 10 μl roztworu zwilżającego i równoważącego. Dozuj roztwór do odpadów. Następnie odessać 10 μl roztworu myjącego i dozować roztwór do odpadów. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
 <li>Aby skutecznie związać mieszaninę peptydów z końcówką, należy wymieszać mieszaninę peptydów pipetą 20 razy. Mieszanina peptydów, która przylgnęła do końcówki, jest zmywana przez zasysanie i dozowanie roztworu myjącego. Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby skutecznie związać mieszaninę peptydów z końcówką.</li>
 <li>Za pomocą końcówki zawierającej związany peptyd odessać 10 μl roztworu zwilżającego i równoważącego i dozować do czystej probówki eppendorfa. Powtórz ten krok dwa razy. Po wysuszeniu eluowanych próbek w próżni z dużą prędkością, próbki mogą być natychmiast analizowane za pomocą spektrometrii mas lub przechowywane w temperaturze -80 °C przed użyciem.</li>
</ol>
6. Identyfikacja białek za pomocą spektrometru masowego LTQ Orbitrap Velos
Składniki polipeptydowe izolowanych kompleksów są identyfikowane za pomocą hybrydowego tandemowego spektrometru masowego LTQ Orbitrap Velos. Orbitrap ma wyjątkową zdolność rozdzielczą (>60 000 Full Width Half Maximum, czyli FWHM) i dokładność masy (<2 ppm), co minimalizuje próbkowanie MS/MS nieistotnych niespecyficznych zanieczyszczeń tła wykrytych podczas oczyszczania kontrolnego, podczas gdy komponent pułapki jonowej Velos o dużej prędkości może wykrywać i fragmentować peptydy o niskiej obfitości przy użyciu zarówno dysocjacji transferu elektronów, jak i dysocjacji wywołanej zderzeniem. Dopasowania o wysokim poziomie ufności między wynikowymi widmami MS/MS są mapowane w celu odniesienia do sekwencji białka E. coli przy użyciu algorytmu przeszukiwania bazy danych, takiego jak SEQUEST, a każda pasująca sekwencja jest oceniana za pomocą algorytmu prawdopodobieństwa, takiego jak STATQUEST11. Uważa się, że całkowita liczba widm, unikalność sekwencji peptydów i powszechne zanieczyszczenia tła wykryte w oczyszczaniu z kontrolą ujemną (tj. pozorowanym) zapewniają niski empiryczny wskaźnik fałszywych odkryć. W celu identyfikacji białka wykonuje się następujące kroki:
 
<ol>
 <li>Mikrokolumny są wypełnione ~10 cm żywicą Luna-C18 o grubości 3 μm i są połączone ze źródłem jonów nanoelektrorozpylania Proxeon, które jest umieszczone w jednej linii z instrumentem Orbitrap.</li>
 <li>Binarna pompa HPLC Proxeon nano flow służy do zapewnienia stabilnego natężenia przepływu końcówki ~300 nl min-1 podczas separacji peptydów.</li>
 <li>Aby osiągnąć elucję peptydów, ustawia się gradient buforu organicznego zgodnie ze złożonością próbki. Na przykład dla próbek SPA E. coli zwykle ustawia się następujący gradient: rozpuszczalnik B zwiększa się z 2% do 6% w ciągu 1 minuty, do 24% w ciągu 38 minut, do 100% w ciągu następnych 4 minut, utrzymuje się na poziomie 100% przez 1 minutę, następnie zmniejsza się do 2% w ciągu 1 minuty i końcowe zatrzymanie na poziomie 2% przez 15 minut. Rozpuszczalnik A w fazie ruchomej zawiera 95% wody gradientowej HPLC i 5% ACN z 0,1% kwasem mrówkowym, podczas gdy rozpuszczalnik B zawiera 5% wody gradientowej HPLC i 95% ACN z 0,1% kwasem mrówkowym. Natężenie przepływu na końcówce igły jest ustawione na 300 nl min-1 przez 60 min.</li>
 <li>Podczas gdy cykle spektrometru mas przechodzą przez jeden pełny skan masy w rozdzielczości 60 000, zbieranych jest 10 jednoczesnych skanów masy fragmentacji tandemowej dla najbardziej intensywnych jonów prekursorowych. Włączone jest dynamiczne wykluczanie, monoizotopowy wybór masy i funkcje przyrządu do akwizycji w czasie rzeczywistym.</li>
 <li>Widma są przeszukiwane przy użyciu algorytmu przeszukiwania bazy danych, takiego jak SEQUEST, w oparciu o bazę danych sekwencji białek E. coli, a wynik jest filtrowany statystycznie przy użyciu algorytmu prawdopodobieństwa, takiego jak STAQUEST11, aby zapewnić niski wskaźnik fałszywych odkryć. Wybierani są tylko kandydaci o wysokim poziomie ufności (99% prawdopodobieństwa), podczas gdy dopasowania wykazujące błąd masy większy niż 10 ppm w porównaniu z teoretyczną masą peptydu są eliminowane z dalszych rozważań.</li>
</ol>

<ol><li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Mak, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+functional+proteomics+approach+identifies+chromatin+remodeling+complexes+important+for+the+induction+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency.</a> Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).</li>
<li>Polanowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+immunoaffinity+purification+of+protein+complexes+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 36, 778-782 (2004).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%2C+a+generic+large+scale+proteomic+investigation+strategy+for+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals.</a> Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).</li>
<li>Vlasblom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenePro%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+advanced+visualization+and+analysis+of+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks.</a> Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).</li>
<li>de Berardinis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Kluczowym aspektem opisanego tutaj podejścia APMS opartego na SPA jest to, że znakowanie odbywa się w naturalnym kontekście chromosomalnym, zapewniając w ten sposób utrzymanie normalnej regulacji genów (tj. zachowanie natywnego promotora przynęty, a zatem poziom ekspresji nie jest zaburzony), a natywne, stabilnie związane kompleksy białkowe są odzyskiwane na poziomach bliskich endogenności. Problemów z polaryzacją operonów można również uniknąć, umieszczając promotor zorientowany na zewnątrz w wybieralnym marker...

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>I. Antybiotyki</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td> Ampicillin Bioshop#AMP201<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>2. Terrific-Broth medium</td></tr><tr><td>Bio-Tryptone</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Szczep bakteryjny i plazmid</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Odczynniki do PCR i elektroforezy</td></tr><tr><td>Taq Polimeraza DNA</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X bufor PCR</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie barwnik</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X Bufor TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Zestawy do izolacji i czyszczenia plazmidu</td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification</td> kit <td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Sprzęt do PCR i transformacji</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm Kuweta do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C Wytrząsarka do kąpieli wodnej</td><td>Innova 3100</td><td></td>Beckman Coulter TJ-25 Wirówka Beckman Coulter TS-5.1-500 32 &deg;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C duży shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; Inkubator płytkowy C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7. Elektroforeza i Western blotting</monomer</td></tr> <tr><td>akrylamidu strong>acrylamide, N,N'-metylenobis-akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman nr 1</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini protean 3 cell</td><td>Bio-Rad#</td><td>165-3301</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do przenoszenia żelu iBlot</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Membrany nitrocelulozowe</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało Anti-Flag M2</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie barwione wzorce masy cząsteczkowej białka</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiluminescencyjny</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Film autoradiograficzny</td> Bibuła do szybkiego rysowania <td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr> Quick Draw <tr><td>Wytrząsarka do huśtania na platformie</td> Sigma#P7796 <td></td> C2 New Brunswick Scientific, USA<td></td><td></td></tr><<tr><td></td><td></td><td></td>td colspan="4"><td></td></tr><tr><silny>8. Sprzęt i odczynniki do sonikacji</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9. Odczynniki i sprzęt do oczyszczania powinowactwa</td></tr><tr><td>0,8 x 4 cm Kolumna polipropylenowa Bio-Rad</td><td>#</td> <td>732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Novagen</td> <td># 70746</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki agarozowe Anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kalmodulinowo-sefarozowe</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza TEV</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10. Odczynniki do barwienia srebra</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Węglan</td> <td>soduBioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Odczynniki i sprzęt do identyfikacji białek </td></tr><tr><td>Trypsin Gold, spektrometria mas klasy</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic kwas</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Sigma</td> <td># 95304</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td> <td># 16125</td><td></td></tr><tr><td>Milipore Zip-Tip</td><td>Millipore #</td> <td>ZTC18M960</td><td></td></tr> <tr><td>~ 10 cm 3 &mu; m Pompa HPLC z żywicy Luna-C18</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos spektrometr</td><td></td> masowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. Sprzęt laboratoryjny</mocny></td></tr><tr><td>4 litrowe kolby stożkowe</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe probówki sokoła</td><td>Dowolny Sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płatki stożkowe 250 ml</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylne probówki hodowlane</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Szybki system próżniowy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> i roztwory 1. 1 litr Terrific Bulth (TB) media 11 g Bio-Trypton 22 g Ekstrakt drożdżowy 2% Glicerol 50 ml bulionu soli potasowej rozwiązanie 2. Roztwór podstawowy soli potasowej 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Bufor dźwiękowy 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% Glycerol Przed użyciem dodaj inhibitor proteazy (PI) i 0,1-0,5 mM TCEP 4. Bufor AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 5. Bufor rozszczepienia TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 6. Bufor wiążący kalmodulinę 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 7. Bufor płuczący kalmodulinę 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Bufor elucji kalmoduliny 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Roztwór rozwijający (1L) 37% Formaldehyd 30 g węglanu sodu 1000 ml wody destylowanej 10. Bufor trawienny 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Roztwór zwilżający i równoważący 70% acetonitrylu (ACN) w 0,1% kwasie mrówkowym 12. Roztwór myjący 100% H2O w 0,1% kwasie mrówkowym</td></tr></tbody></table>

identyfikacja kompleksów białkowych w escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Ponieważ większość procesów komórkowych jest zapośredniczona przez zespoły makromolekularne, systematyczna identyfikacja interakcji białko-białko (PPI) i identyfikacja składu podjednostek kompleksów wielobiałkowych może dostarczyć wglądu w funkcję genów i zwiększyć zrozumienie systemów biologicznych1, 2. Interakcje fizyczne można mapować z dużą pewnością dzięki izolacji na dużą skalę i charakterystyce endogennych kompleksów białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych w oparciu o oczyszczanie powinowactwa białek znakowanych chromosomowo w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS). Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane w organizmach zróżnicowanych ewolucyjnie, w tym drożdżach, muchach, robakach, komórkach ssaków i bakteriach1-6. W szczególności wygenerowaliśmy karboksylowo-końcowy system podwójnego znakowania sekwencyjnego powinowactwa do peptydów (SPA) do oczyszczania natywnych kompleksów białkowych z hodowanych Gram-ujemnych Escherichia coli, przy użyciu genetycznie podatnych szczepów laboratoryjnych gospodarza, które dobrze nadają się do badań całego genomu podstawowej biologii i konserwatywnych procesów prokariontów1, 2, 7. Nasz system znakowania SPA jest analogiczny do tandemowej metody oczyszczania powinowactwa opracowanej pierwotnie dla drożdży8, 9 i składa się z peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP), po którym następuje miejsce rozszczepienia wysoce specyficznej proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) i trzech kopii epitopu FLAG (3X FLAG), co pozwala na dwie kolejne rundy wzbogacania powinowactwa. Po amplifikacji kasety, specyficzne dla sekwencji liniowe produkty PCR kodujące znacznik SPA i wybieralny marker są integrowane i wyrażane w ramce jako fuzje karboksylowo-końcowe na tle DY330, które jest indukowane w celu przejściowej ekspresji wysoce wydajnego heterologicznego systemu rekombinacji lambda bakteriofagów10. Późniejsze dwuetapowe oczyszczanie za pomocą kalmoduliny i kulek powinowactwa anty-FLAG umożliwia wysoce selektywne i wydajne odzyskiwanie nawet kompleksów białkowych o niskiej liczebności z kultur na dużą skalę. Tandemowa spektrometria mas jest następnie stosowana do identyfikacji stabilnie współoczyszczających się białek o wysokiej czułości (niskie granice wykrywalności nanogramów).
Tutaj opisujemy szczegółowe procedury krok po kroku, które powszechnie stosujemy do systematycznego znakowania białek, oczyszczania i analizy opartej na spektrometrii mas rozpuszczalnych kompleksów białkowych z E. coli, które mogą być skalowane i potencjalnie dostosowane do innych gatunków bakterii, w tym niektórych oportunistycznych patogenów, które są podatne na rekombinację. Wynikające z tego interakcje fizyczne mogą często ujawnić interesujące, nieoczekiwane składniki i połączenia, sugerując nowe powiązania mechanistyczne. Integracja danych PPI z alternatywnymi danymi asocjacyjnymi molekularnymi, takimi jak interakcje genetyczne (gen-gen) i przewidywania kontekstu genomowego (GC), może ułatwić wyjaśnienie globalnej organizacji molekularnej kompleksów wielobiałkowych w obrębie szlaków biologicznych. Sieci wygenerowane dla E. coli można wykorzystać do uzyskania wglądu w funkcjonalną architekturę ortologicznych produktów genowych u innych drobnoustrojów, dla których obecnie brakuje adnotacji funkcjonalnych.

Po oczyszczeniu metodą powinowactwa białek przynęty z etykietą, które były ekspresowane na poziomach endogennych z kultur w fazie logarytmicznej, próbki naniesiono na żel barwiony srebrem w celu wizualizacji poszczególnych komponentów polipeptydowych wyizolowanych stabilnych kompleksów. Drugą część oczyszczonych metodą powinowactwa próbek białek poddano beżelowej tandemowej spektrometrii mas (LCMS) w celu identyfikacji odpowiadających im sekwencji polipeptydowych. Skuteczność tej procedury APMS pokazano na reprezentatywn...

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet zaczynając od niskiej liczby kopii na komórkę.

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja białek, oddziaływań białkowych oraz składu podjednostek natywnych kompleksów MultiPro z E. coli. Osiąga się to poprzez amplifikację specyficznych dla sekwencji liniowych produktów PCR, kodujących znacznik SPA oraz marker selekcyjny, które są integrowane i ekspresowane w ramce odczytu jako fuzje karboksyterminalne w szczepie ddy 3, 3 0 przy użyciu bakteryjnego systemu rekombinacji faga lambda; w drugim kroku przeprowadzana jest dwustopniowa puryfikacja z wykorzystaniem cow modlin i kulek powinowactwa Anti-Flag w celu efektywnego odzyskania niskobiełkowych kompleksów białkowych. Następnie białka związane, eluowane za pomocą cow modlin, buforu elucyjnego lub CEB, poddawane są trawieniu trypsyną i analizie metodą spektrometrii mas w celu identyfikacji białek.Uzyskane wyniki pokazują, że kilka podjednostek rdzeniowego enzymu polimerazy RNA, w tym czynniki terminacji transkrypcji i antydeterminacji, zostało efektywnie kopuryfikowanych z oznakowaną białkiem podjednostki D polimerazy RNA, co wskazuje, że nowo powiązane komponenty mogą być skutecznie wykrywane przy użyciu tego podejścia. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z dwuetapową puryfikacją powinowactwa, w której staranne przetwarzanie lizatów komórkowych z odpowiednimi roztworami buforowymi jest absolutnie niezbędne, aby zapewnić sukces w efektywnym odzyskiwaniu kompleksów o niskiej i wysokiej zawartości z kultur wielkoskalowych. Procedury puryfikacji powinowactwa i spektrometrii mas zaprezentują Olga Kagan i HBO guo, dwaj technicy w moim laboratorium. Niniejszy protokół rozpoczyna się od celowania w specyficzne sekwencje amplifikowane w szczepie DDY three 30, w którym ekspresjonowany jest mechanizm rekombinacji Lambda red, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Następnie szczep bakterii wykazujący system rekombinacji faga Lambda inkubuje się przez noc w 2 ml pożywki Luria-Bertani lub LB w temperaturze 32 °C, przy wstrząsaniu z prędkością 180 RPM. Następnego dnia 1 ml kultury nocnej szczepia się do 70 ml świeżej pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml. Inokulum hoduje się w temperaturze 32 °C, wstrząsając z prędkością 180 RPM, aż OD 600 osiągnie wartość około 0,8. Indukcję komórek przeprowadza się poprzez inkubację kolby w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C, delikatnie wstrząsając z prędkością 180 RPM przez 15 minut.Bezpośrednio po indukcji inkubować kolbę w kąpieli z mieszaniny lodu i wody przez co najmniej 30 minut przy potrząsaniu. Po zebraniu i wypłukaniu komórek zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, ponownie zawiesić osad komórkowy w 700 µL lodowatej, sterylnej wody, aby uzyskać komórki elektrokompetentne do elektroporacji. Wprowadzić 1 µL oczyszczonego amplikonu do 40 µL komórek elektrokompetentnych.Komórki poddaje się elektroporacji po rekombinacji homologicznej i integracji. Transformanty, w których tag lub kaseta zostały pomyślnie włączone do chromosomu, są selekcjonowane na podstawie oporności na kanamycynę. Wybierany jest zestaw transformantów do analizy western blotting w celu weryfikacji prawidłowego wytworzenia białek fuzyjnych z tagiem SPA przy użyciu przeciwciała Anti-Flag M2, które jest specyficzne dla epitopów flag tagu SPA. Przenosi się 10 ml kultury nocnej do 990 ml świeżej pożywki TB, uzupełnionej o 25 µg/ml kanamycyny, w kolbie o pojemności 4 litrów.Hodowlę inkubowano w temperaturze 32 °C przy stałym wstrząsaniu z prędkością 250 RPM przez pięć do sześciu godzin, aż OD 600 osiągnie wartość od dwóch do trzech. Jeden litr hodowli e coli SPA tag przeniesiono do czystych butelek do wirowania i odwirowano komórki w temperaturze 4 °C przy 3 993 ×g przez 15 minut. Następnie zawiesino komórki zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Przenieś próbki do sterylnego kubka ze stali nierdzewnej umieszczonego w lodzie w celu przeprowadzenia sonikacji. Zanurz sondę w próbce i sonikuj przez trzy minuty. Po sonikacji odczekaj dodatkowe dwie minuty, aby próbka ostygła po przegrzaniu, a następnie odwiruj lizat po sonikacji.Ostrożnie przenieś supernatant S z probówki do wirowania do 50 mililitrowej polipropylenowej probówki typu Falcon. Zamroź próbkę w ciekłym azocie i przechowuj zamrożony, sonikowany ekstrakt komórkowy przez maksymalnie sześć miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Aby rozpocząć oczyszczanie powinowactwa zamrożonego, sonikowanego ekstraktu komórkowego, umieść probówkę w zimnej wodzie, a następnie inkubuj ekstrakt komórkowy TH z trzema mikrolitrami benzo, nukleazy, przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać niejonowy detergent Triton X 100 oraz 200 µL zawiesiny kulek agro beads z przeciwciałem Anti-Flag M2. Zawartość delikatnie wymieszać, rotując probówką przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Po trzech godzinach rotacji probówkę odwirować z prędkością 1 700 ×g przez sześć minut. Po centrifugacji ostrożnie usunąć jak największą ilość nadsądu, uważając, aby nie naruszyć luźnego osadu.Resuspenduj osad w pozostałym roztworze SNA, a następnie przenieś go do polipropylenowej kolumny do preparatyki. Wyjmij dolne korki odpływowe kolumny, aby umożliwić spływanie eluatu siłą grawitacji. Następnie przemyj kolumnę pięciokrotnie 200 µL jednokrotnym buforem FC i przystąp do etapu cięcia TEV zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Po odszczepieniu szybko i szczelnie zamknij kolumnę zarówno od góry, jak i od dołu. Delikatnie wymieszaj zawartość kolumny poprzez rotację przez noc w temperaturze 4°C. Zlej eluat, zdejmując górną nasadkę i dolny korek, do nowej kolumny.Przemyj starą kolumnę 400 µL 1x buforu wiążącego Cal Modlin oraz 150 µL zawiesiny kulek wiążących Cal Modlin. Eluuj związane białko w czterech frakcjach po 50 µL do nowej probówki eend orph, używając 1x buforu elucyjnego Cal Modlin.Rozdziel eluat na dwie czyste probówki typu eend orph w równych objętościach. Następnie odparuj zawartość obu probówek za pomocą wirówki próżniowej. Wysuszony eluat z jednej probówki służy do przeprowadzenia elektroforezy z barwieniem srebrem, zgodnie z opisem w tekście, natomiast pozostały jest przechowywany w temperaturze -80 °C.W celu późniejszego zastosowania w spektrometrii mas, do wysuszonej próbki należy dodać 50 µL buforu trawiennego oraz 0,9 µL 100 mM chlorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny; mieszaninę inkubuje się przez 45 minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia etapu redukcji. Następnie, aby umożliżlić alkilację próbki, dodaje się 1 µL 500 mM iodoacetamidu i inkubuje w ciemności przez kolejne 40 minut. Po drugiej serii inkubacji do mieszaniny dodaje się 1 µg trypsyny. Próbkę inkubuje się przez pięć godzin w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej.Należy pamiętać o zatrzymaniu reakcji poprzez dodanie jednego mikrolitra kwasu octowego. Następnie należy przygotować końcówkę Millipore zip tip zgodnie z opisem w tekście, aby zapewnić efektywne wiązanie peptydu z końcówką. Mieszaninę peptydową należy wymieszać 20 razy, a następnie wypłukać zmieszaną z końcówką próbkę poprzez aspirację i dyspensowanie roztworu płuczącego.Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby zapewnić efektywne wiązanie mieszaniny peptydów z końcówką, używając końcówki z przywiązanym peptydem. Pobierz 10 µL roztworu zwilżającego i ekwilibrującego, a następnie przeniesienie go do czystej probówki typu Eppendorf. Powtórz ten krok dwukrotnie.Po wysuszeniu eluatów w wirówce próżniowej (speed vacuum), próbki można poddać natychmiastowej analizie metodą spektrometrii mas lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Mikrokolumny zastosowane w tej procedurze są wypełnione warstwą około 10 cm żywicy Lunar C 18 o rozmiarze cząstek 3 µm i są połączone z nano-źródłem jonizacji przez rozpylanie elektrostatyczne Pro Zion, które znajduje się w linii z instrumentem Orbitrap. Do zapewnienia stabilnego przepływu z końcówki na poziomie około 300 nL/min podczas rozdzielania peptydów wykorzystywana jest binarna pompa HPLC Pro Zion nano flow; w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia peptydów należy ustawić gradient buforu organicznego zgodnie ze stopniem złożoności próbki.W przypadku tej próbki SPA z E. coli, mobilna faza rozpuszczalnika A składa się z 95% wody gradientowej do HPLC i 5% acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego, natomiast rozpuszczalnik B zawiera 5% wody gradientowej do HPLC i 95% acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego. Po przeprowadzeniu spektrometrii mas należy przeszukać widma, wykorzystując algorytm wyszukiwania w bazie danych, taki jak SEQUEST, w odniesieniu do bazy sekwencji białek E. coli. Wyniki należy przefiltrować statystycznie za pomocą algorytmu probabilistycznego, takiego jak STARQUEST, aby zapewnić niski wskaźnik fałszywych odkryć. Zarówno znakowany w systemie SPA czynnik sigma polimerazy RNA, jak i białko YakL o nieznanej funkcji, współoczyszczały się specyficznie z enzymem rdzeniowym polimerazy RNA, w tym z podjednostkami alfa, beta i beta pierwsza, a także z czynnikiem recyklingowym polimerazy RNA. W przeciwieństwie do znakowanego czynnika sigma polimerazy RNA, YakL wiązał się dodatkowo z niezbędnym antyterminacyjnym czynnikiem terminacji transkrypcji, co sugeruje wyspecjalizowaną funkcję w transkrypcji.Za pomocą LCMS wykryto również kilka innych mniejszych białek współoczyszczających, które nie były widoczne na żelu, w tym podjednostkę Omega polimerazy RNA oraz czynniki terminacji i determinacji transkrypcji, a także USA i NUSD. Z kolei w niezależnym eksperymencie białka aparatury mobilizacji siarki, SUFB, SUFC i SUFD, współoczyszczały się nawzajem, co wskazuje na ich wspólny udział w biosyntezie klastrów żelazo-siarkowych jako pojedynczego kompleksu rusztowującego. Ten reprezentatywny przykład podkreśla fakt, że wcześniej dobrze zbadane i szczegółowo opisane bakteryjne kompleksy MultiPro uczestniczące w istotnych procesach biologicznych często posiadają nowe powiązane komponenty, które mogą zostać wydajnie zidentyfikowane.Stosując to podejście, niska liczba kopii białka SUFB mogła skutkować słabą intensywnością sygnału w porównaniu z silną intensywnością zaobserwowaną w eksperymentach pull down dla SUFC i SUFD. Aby zdefiniować skład stabilnych wielojednostkowych kompleksów białkowych, przypisano wyniki współoczyszczania do interakcji o wysokim stopniu ufności, biorąc pod uwagę unikalność relacji przynęta-ofiara, przynęta-przynęta oraz ofiara-ofiara. Następnie, wykorzystując procedury klastrowania grafów, takie jak algorytm klastrowania Markoffa, z partycjonowanej probabilistycznej sieci PPI zidentyfikowano dyskretne klastry białek.Domniemane sieci oddziaływań można zwizualizować przy użyciu programu Cytoscape. Połączenie danych proteomicznych z dodatkowymi dowodami na powiązania funkcjonalne, wywnioskowanymi za pomocą metod genomicznych, może służyć do badania nowych ról mechanistycznych wcześniej adnotowanych białek e coli. W niniejszej pracy w e coli zdefiniowano podsieci kompleksów białkowych oraz moduły funkcjonalne, które uczestniczą w szerszych sąsiedztwach funkcjonalnych.Główny hierarchiczny klaster Graham przedstawia wzorce przewidywań funkcjonalnych oraz istniejące adnotacje dla genów funkcjonalnie osieroconych i zcharakteryzowanych u e coli; kolory żółty i niebieski reprezentują odpowiednio funkcje istniejące i wnioskowane, natomiast intensywność odcieni odzwierciedla wyniki ufności. Procesy biologiczne powiązane z różnymi sąsiedztwami są wskazane po prawej stronie; wstawki pokazują poszczególne komponenty reprezentatywnego sąsiedztwa w oparciu o zintegrowane wyniki podobieństwa sieci interakcji fizycznych i funkcjonalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób można izolować stabilne kompleksy białkowe z estia Coli, stosując metodę oczyszczania powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas.Zasadniczo technikę tę można zastosować do charakterystyki kompleksów białek błonowych lub kompleksów białkowych z dowolnego innego gatunku, o ile możliwe jest ich rekombinowanie.

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja Kompleksów Białkowych w Escherichia coli przy użyciu Sekwencyjnej Afinicznej Puryfikacji Peptydów w Połączeniu ze Spekometrią Mas Tandemową

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Poznaj metodę sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji kompleksów białkowych w Escherichia coli. Technika ta umożliwia efektywne izolowanie białek o niskiej zawartości.

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów