Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Celem tego eksperymentu jest identyfikacja białek, interakcji białkowych i składu podjednostek natywnych kompleksów MultiPro z E. coli. Osiąga się to poprzez amplifikację specyficznych dla sekwencji liniowych produktów PCR, kodowanie znacznika SPA i wybieralnego markera, które są zintegrowane i wyrażane w ramce jako fuzje końcówek karboksylowych w tle ddy 3, 3 0 przy użyciu bakteryjnego systemu rekombinacji lambda Fage jako drugiego etapu dwuetapowe oczyszczanie odbywa się przy użyciu kulek powinowactwa krowiego modlin i Anti-Flag, aby skutecznie odzyskać kompleksy białkowe o niskiej liczebności. Następnie związane białka, do których odnosi się modlin krowia, bufor elucyjny lub CEB, są trawione trypsyną i przetwarzane za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji białek.

Uzyskane wyniki pokazują, że kilka podjednostek enzymu polimerazy rdzenia RNA, w tym zakończenie transkrypcji, czynniki antydeterminacyjne są skutecznie oczyszczane ze znakowanym białkiem podjednostki D polimerazy RNA, co wskazuje, że nowo związane składniki można skutecznie odkryć przy użyciu tego podejścia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą zmagać się z dwoma okrągłymi oczyszczaniami powinowactwa, w których staranne przetwarzanie lizatów komórkowych za pomocą odpowiednich roztworów buforowych jest absolutnie konieczne, aby zapewnić sukces w skutecznym odzyskiwaniu kompleksów obciążenia o niskiej i wysokiej obfitości z kultur na dużą skalę Demonstrując procedury oczyszczania powinowactwa i spektrometrii mas będą Olga Kagan i HBO guo, dwaj technicy w moim laboratorium. Protokół ten rozpoczyna się od ukierunkowania określonych amplifikowanych sekwencji na szczep DDY three 30, w którym maszyneria rekombinacji czerwieni Lambda jest wyrażona zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Następnie, gdzie bakterie farge system rekombinacji Lambda wyrażający szczep przez noc w dwóch mililitrach pożywki Luria bati lub LB w temperaturze 32 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 180 obr./min następnego dnia, zaszczepić jeden mililitr nocnej kultury w 70 mililitrach świeżej pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 500 mililitrów. Hoduj inokulum w temperaturze 32 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 180 obr./min, aż OD 600 osiągnie około 0,8. Indukować komórki przez inkubację kolby w łaźni wodnej w temperaturze 42 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając z prędkością 180 obr./min przez 15 minut.

Natychmiast po indukcji inkubować kolbę w kąpieli zawiesinowej z lodowatą wodą przez co najmniej 30 minut z wytrząsaniem. Po zebraniu i umyciu ogniw zgodnie z opisem w pisemnej procedurze, Reese zawiesza osad ogniwa w 700 mikrolitrach lodu, zimnej, sterylnej wody, w wyniku czego ogniwa są elektrokompetentne poprzez elektroporację. Wprowadzić jeden mikrolitr oczyszczonego amplikonu do 40 mikrolitrów elektrokompetentnych ogniw.

Ogniwa są elektroporowane po rekombinacji homologicznej i integracji. Transformanty, które z powodzeniem połączyły kasetę z ukośnikiem znacznika do chromosomu, są wybierane na podstawie odporności na mycynę może wybrać wiele transformatorów do western blotting w celu sprawdzenia prawidłowego wytwarzania białek fuzyjnych znakowanych SPA z przeciwciałem Anti-Flag M dwa, które jest selektywne wobec epitopów flagowych znacznika SPA Przenieś 10 mililitrów kultury na noc do 990 mililitrów świeżej tb. Uzupełniony 25 mikrogramami na mililitr puszki mycyny w czterolitrowej kolbie.

Uprawiaj kulturę w temperaturze 32 stopni Celsjusza z ciągłym potrząsaniem przy 250 obr./min przez pięć do sześciu godzin, aż OD 600 osiągnie od dwóch do trzech. Przenieś jednolitrową kulturę znaczników SPA e coli do czystych butelek wirujących i wiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 3 993 razy G przez 15 minut. Po resusie zawieszenie komórek zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Przenieść próbki do sterylnego kubka ze stali nierdzewnej umieszczonego na lodzie w celu sonikacji. Zanurz sondę w próbce i poddaj soniku przez trzy minuty. Po sonikacji należy odczekać dodatkowe dwie minuty na schłodzenie próbki przed przegrzaniem po odwirowaniu lizatu sonikatu.

Ostrożnie przenieść supernatant S z probówki wirówkowej do 50-mililitrowej probówki z polipropylenu Falcon. Zawiesić próbkę przy użyciu ciekłego azotu i przechowywać sonikowany ekstrakt z zamrożonych komórek przez maksymalny okres sześciu miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Aby rozpocząć oczyszczanie powinowactwa dla zamrożonego ekstraktu z komórek sonikowanych, umieszczając probówkę w zimnej wodzie, inkubuj ekstrakt z komórek TH z trzema mikrolitrami benzo, nukleazy przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Do tej mieszaniny dodaj niejonowy detergent Triton X 100 i 200 mikrolitrów zawiesiny Anti-Flag M dwóch kulek agro. Delikatnie wymieszaj zawartość, obracając probówkę przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, po trzech godzinach obracania, odwiruj probówkę pod ciśnieniem 1 700 razy G przez sześć minut. Po odwirowaniu ostrożnie usuń jak najwięcej satu, nie naruszając luźnych granulek prędkości.

Ponownie zawiesić osad w pozostałym SNA, a następnie przenieść do polipropylenowej kolumny przygotowawczej. Usunąć dolne korki wylotowe kolumny, aby umożliwić grawitacyjne spłynięcie eluatu. Płynąć. Następnie przemyć kolumnę pięciokrotnie 200 mikrolitrami jednorazowego buforu FC i udać się do Cleve z TEV zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Po szybkim rozszczepieniu zarówno na górze, jak i na dole kolumny. Delikatnie wymieszaj zawartość w kolumnie, obracając przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po nocnym obracaniu. Odcedzić eluat, zdejmując górną nasadkę i dolną zatyczkę do nowej kolumny.

Umyj starą kolumnę 400 mikrolitrami jednego bufora wiążącego kal Modlin i 150 mikrolitrową zawiesiną kulek wiążących Cal Modlin. Eluuj związane białko w czterech frakcjach po 50 mikrolitrów w świeżej probówce eend orph. Za pomocą jednego bufora elucyjnego x cal Modlin.

Rozprowadzić eluowaną frakcję do dwóch czystych probówek orph w równych objętościach. Następnie wysusz zawartość obu probówek za pomocą próżni szybkoobrotowej. Wysuszony eluat z jednej probówki służy do nakładania żelu do barwienia srebra, jak opisano w tekście, podczas gdy drugi jest przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do wykorzystania w przyszłości w spektrometrii mas do wysuszonej próbki, dodać 50 mikrolitrów buforu wytrawiającego i 0,9 mikrolitra 100 milimolowego kwasu solnego trisfosfiny, inkubować mieszaninę przez 45 minut w temperaturze pokojowej dla etapu redukcji Następnie dodać jeden mikrolitr 500-milimolowego acetamidu IDO i inkubować w ciemności przez kolejne 40 minut. Aby umożliwić alkilowanie próbki Po drugiej rundzie inkubacji dodać jeden mikrogram cykli do mieszaniny. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin lub przez noc w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Pamiętaj, aby zatrzymać reakcję, dodając jeden mikrolitr kwasu octowego. Następnie przygotuj końcówkę zamka błyskawicznego Millipore, końcówkę pipety zgodnie z opisem w tekście, aby skutecznie związać peptyd z końcówką rurki. Wymieszaj mieszaninę peptydów 20 razy, zmyj mieszaninę peptydów, którą zrobiła, z końcówką, zasysając i dozując roztwór myjący.

Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby skutecznie związać mieszaninę peptydów z końcówką zawierającą związany peptyd. Odessać 10 mikrolitrów roztworu zwilżającego i równoważącego e i dozować do czystej probówki eend orph. Powtórz ten krok dwukrotnie.

Po wysuszeniu eluowanych próbek w próżni prędkościowej, próbki mogą być natychmiast analizowane za pomocą spektrometrii mas lub przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed użyciem. Mikrokolumny użyte w tej procedurze są wypełnione około 10 centymetrami trzymikronowej księżycowej żywicy C 18 i są połączone z pro Zion nano źródło jonów elektronicznych, które jest umieszczone w jednej linii z instrumentem orbitrap. Binarna pompa HPLC pro Zion nano flow służy do dostarczania stabilnego natężenia przepływu końcówki wynoszącego około 300 nanolitrów na minutę podczas separacji peptydów w celu uzyskania rozcieńczenia peptydów, ustawienia organicznego gradientu buforu zgodnie ze złożonością próbki.

W przypadku tej próbki SPA e. coli rozpuszczalnik A w fazie ruchomej zawiera 95% wody gradientowej HPLC i 5% nitrylu acetonowego z 0,1% kwasem mrówkowym, podczas gdy rozpuszczalnik B ma 5% wody gradientowej HPLC i 95% nitrylu acetonowego z 0,1% kwasem mrówkowym po przeszukaniu widm za pomocą spektrometrii mas za pomocą algorytmu wyszukiwania w bazie danych, takiego jak seaquest, w oparciu o bazę danych sekwencji białek E. coli. Przefiltruj statystycznie wynik za pomocą algorytmu prawdopodobieństwa, takiego jak star quest, aby zapewnić niski wskaźnik fałszywych odkryć, zarówno czynnik sigma polimerazy RNA oznaczony przez SPA, jak i białko LA jaka o nieznanej funkcji, które są oczyszczane specyficznie z enzymem polimerazy rdzeniowej RNA, w tym podjednostkami alfa beta i beta prime, a także czynnikiem recyklingu polimerazy RNA. W przeciwieństwie do znakowanego czynnika sigma polimerazy RNA, jak L wiąże się dodatkowo z niezbędnym czynnikiem antydeterminacyjnym zakończenia transkrypcji, co sugeruje wyspecjalizowaną funkcję w transkrypcji.

Kilka innych mniejszych białek oczyszczających CO zostało również wykrytych przez LCMS, które nie były widoczne w żelu, w tym podjednostka polimerazy RNA Omega i czynniki transkrypcji, terminacji i determinacji oraz USA i NUSD. I odwrotnie, w niezależnym eksperymencie oznaczonym mobilizacją maszyn siarkowych, S-U-F-B-S-U-F-C i SUFD oczyszczały się ze sobą, wskazując na wspólny udział w biosyntezie klastra siarki żelaza jako pojedynczy kompleks rusztowań. Ten reprezentatywny przykład podkreśla fakt, że wcześniej dobrze przebadane, wysoce opisane kompleksy bakteryjne MultiPro uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych często mają nowe powiązane składniki, które można skutecznie zidentyfikować.

Stosując to podejście, niska liczba kopii białka SUFB mogła skutkować słabą intensywnością sygnału w stosunku do silnej intensywności obserwowanej w eksperymentach SUFC i SUFD w celu określenia składu stabilnych wielojednostkowych kompleksów białkowych, wyniki oczyszczania co przypisano interakcjom o wysokim poziomie ufności, biorąc pod uwagę unikalność ofiary przynęty, Przynęta, przynęta, przynęta i ofiara, relacje. Następnie za pomocą procedur grupowania grafów, takich jak algorytm grupowania znaczników. Dyskretne klastry białek są identyfikowane na podstawie partycjonowanej probabilistycznej sieci PPI.

Przypuszczalne sieci interakcji można wizualizować za pomocą cyto scape. Połączenie danych proteomicznych z dodatkowymi dowodami asocjacji funkcjonalnych wywnioskowanymi za pomocą metod genomicznych może być wykorzystane do zbadania nowych ról mechanistycznych wcześniej opisanych białek E. coli. W tym przypadku zdefiniowano podsieci kompleksów białkowych i modułów funkcjonalnych, które uczestniczą jako szersze sąsiedztwa funkcjonalne w E coli.

Główny hierarchiczny klaster Grahama pokazuje wzorce funkcjonalnych przewidywań i istniejących adnotacji dla funkcjonalnie sierocych i scharakteryzowanych genów E. coli, kolory żółty i niebieski reprezentują odpowiednio istniejące i wywnioskowane funkcje, podczas gdy intensywność odcienia odzwierciedla wyniki ufności. Procesy biologiczne związane z różnymi sąsiedztwami są wskazane na odpowiednich wstawkach, pokazują poszczególne składniki reprezentatywnego sąsiedztwa w oparciu o zintegrowane wyniki podobieństwa sieci interakcji fizycznych i funkcjonalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób stabilne kompleksy białkowe z estia coli można wyizolować przy użyciu oczyszczania powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas.

Zasadniczo technika ta może być stosowana do charakteryzowania kompleksów białek błonowych lub kompleksów białkowych z dowolnego innego gatunku w celu ich rekombinacji, jak to możliwe.