Name: Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę analizy dynamicznych kompleksów białkowych z wykorzystaniem interferometrii biowarstwowej, mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie kinetiki złożeń białkowych w różnych warunkach pH.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Madison and Lila Self Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC Biomedical Research Training Program (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU Bridging Funds oraz Grant Centrum Technologii Interakcji Biomolekuł (BITC) (CT i MTF). Autorzy chcieliby podziękować Barbarze Fegley z KUMC Electron Microscopy Core za pomoc w akwizycji obrazu TEM.

1. Montaż zdefiniowanych kompleksów makromolekularnych na powierzchniach biosensorów interferometrycznych (BLI)
<ol>
	<li>Montaż kompleksu preporowej toksyny wąglika na powierzchni biosensora modyfikowanego przez PDEA w postaci aminoreaktywnych
	<ol>
		<li>Uwodnić końcówkę biosensora BLI drugiej generacji reagującą aminą (AR2G) w 250 μl wody przez dziesięć minut.</li>
		<li>Czasy kroku programu, podane w Tabeli 1, w oprogramowaniu sterującym jednostką BLI (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Rozpocznij bieg BLI, zanurzając końcówkę biosensora w wodzie o objętości 250 μl na 30 sekund, aby zmierzyć początkową linię bazową grubości i gęstości bioczujnika.</li>
		<li>Aktywuj bioczujnik, zanurzając końcówkę w 250 μl 50 mM NHS (N-hydroksysukcynimid) i 200 mM EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid) na 7 minut.</li>
		<li>Zanurz aktywowany bioczujnik w 50 mM PDEA (2-(2-pirydynyloditionio)etanoaminie) rozpuszczonym w 0,1 M buforze boranowym (pH 8,5) na 5 minut, aby wytworzyć aktywowaną powierzchnię reagującą z tiolem.</li>
		<li>Zanurzyć aktywowany bioczujnik reagujący z tiolami w 250 μl roztworu zawierającego 100 nM E126C LFN w 10 mM octanie sodu o pH 5,0, 100 mM NaCl, buforować przez 5 minut.</li>
		<li>Zanurz końcówkę LFN w 50 mM L-cysteinie, 1 M NaCl, 0,1 M octanie sodu, pH 5,0 na 4 minuty, aby ugasić wszelkie pozostałe reaktywne wolne grupy tiolowe.</li>
		<li>Zanurz wygaszoną końcówkę LFN w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 2 minuty, aby ustalić linię bazową buforu.</li>
		<li>Zanurz wygaszoną końcówkę LFN w 0,5 μM ochronnym antygenowym preporze (PA prepore), 50 mM Tris, 50mM NaCl na 5 minut, aby utworzyć komplekspreporowy LFN-PA.</li>
		<li>Po skojarzeniupreporu PA wyjmij końcówkę z roztworuwstępnego PA i zanurz końcówkę w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 30 sekund, aby zmyć wszelkie niespecyficznie związaneprepory PA.</li>
		<li>Zanurz komplekswstępny LFN-PA w 0,5 μM receptorze CMG2 (bez domeny transbłonowej), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, na 5 minut.</li>
		<li>Zanurz kompleks LFN-PA prepore-CMG2 w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 30 sekund, aby zmyć niezwiązany CMG2 w celu utworzenia kompleksu preendosomalnego.</li>
		<li>W celu analizy EM uwolnij kompleks LFN-PA prepore-CMG2 z końcówki biosensora, zanurzając końcówkę w 5 μl 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, wewnątrz probówki PCR.</li>
		<li>W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LFN-PA prepore-CMG2 z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w 5 μL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (bez keratyny), 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 w probówce do PCR. Odbywa się to na innym biosensorze niż ten, który jest używany do analizy EM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż kompleksu porowej toksyny wąglika na powierzchni biosensora amino-reaktywnego modyfikowanego PDEA
	<ol>
		<li>Aby wyświetlić kompleks po zmianie pH, wykonaj kroki 1.1.1-1.1.12 w poprzedniej sekcji, aby wygenerować kompleks LFN-PA prepore-CMG2.</li>
		<li>Zanurz końcówkę biosensora w octanie 10 mM o pH 5,0 na 5 minut, aby zainicjować przejściepreporów PA do przejść porów PA. Przejście to jest wskazane przez wzrost amplitudy (około 0,2 nm), po którym następuje większy spadek amplitudy, który przypuszczalnie jest znaczną lub całkowitą dysocjacją receptora z powodu zmniejszonego powinowactwa wiązania.</li>
		<li>Zanurz końcówkęporów LFN-PA w 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, na 30 sekund, aby zmyć kwaśny bufor.</li>
		<li>W przypadku próbki do analizy EM zanurz końcówkę biosensora w roztworze zawierającym 1,25 mM miceli (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholan, 162,5 mM POPC) na 5 minut, aby zapobiec agregacji w roztworze po uwolnieniu dwusiarczku.</li>
		<li>W celu analizy EM uwolnij kompleksporowo-micelowy LFN-PA z końcówki bioczujnika, zanurzając końcówkę w 5 μl 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl w probówce PCR.</li>
		<li>W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LFN-PA poore (bez miceli) z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w 5 μL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (bez keratyny), 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 wewnątrz probówki PCR. Odbywa się to na innym biosensorze niż ten, który jest używany do analizy EM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wizualizacja i walidacja uwolnionych zespołów makromolekularnych z biosensorów BLI za pomocą mikroskopii elektronów z ujemnym zabarwieniem
<ol>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe na siatce Cu 300 pokrytej węglem. Typowe ustawienia wyładowania jarzeniowego to stabilne ciśnienie atmosfery 0,38 mBar, ujemne 15 mAmps, 20 sekund, a następnie wentylacja powietrzem.</li>
	<li>Zabezpiecz siatkę między parą czystych pęset.</li>
	<li>Pobrać pipetą 4 μl uwolnionej złożonej próbki w probówce do PCR na siatkę i pozostawić na adsorpcję przez 60 sekund.</li>
	<li>Odchować pozostały płyn za pomocą klina bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Zabarwić siatkę, pipetując 5 μl 0,75% 0,02 mikronowego przefiltrowanego mrówczanu uranylu i usuwając nadmiar plamy po 5 sekundach. Pozostaw ruszt do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyświetlanie barwionych siatek próbek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.</li>
</ol>
3. Identyfikacja kompletnego kompleksu toksyn wąglika preendosomalnego (LFN-Pa prepore-CMG2) i kompleksu przejściowego (pory LF N-Pa bez CMG2) przy użyciu spektrometrii mas.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć uwolnione próbki do 20 μl i inkubować przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 2 μl 55 mM jodoacetamidu, 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności (przykrytej folią aluminiową).</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę 100 μl 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0, aby zmniejszyć stężenie chlorowodorku guanidyny poniżej 1 M.</li>
	<li>Dodać 5 μl zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania o stężeniu 20 ng/μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać lodowaty kwas octowy do końcowego stężenia 5%, aby obniżyć pH do <3, a następnie zmniejszyć objętość do 10 μl w koncentratorze próżniowym.</li>
	<li>Przenieść roztwór peptydu na płytkę z próbką na automatycznym podajniku próbek uHPLC nLC 1200</li>.
	<li>Załadować 5 μl roztworu peptydu na kolumnę uHPLC z odwróconymi fazami zamontowaną na etapie jonizacji MS.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 15 μl 0,1% kwasu mrówkowego o maksymalnej szybkości 5 μl/min i/lub maksymalnym ciśnieniu 800 psi.</li>
	<li>Eluować peptydy z kolumny C18 z odwróconymi fazami przy natężeniu przepływu 350 nL/min przez okres 90 minut, stosując gradient liniowy od 5% do 40% rozpuszczalnika B w A+B (rozpuszczalnik A: 0,1% kwas mrówkowy; rozpuszczalnik B: 95% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym).</li>
	<li>Analizuj peptydy eluujące on-line przy użyciu tandemowego MS.
	<ol>
		<li>Ustaw źródło jonizacji na 2500 woltów i temperaturę wymiany jonów na 250 °C.</li>
		<li>Uruchom spektrometr mas pod kontrolą automatyczną, aby wykonać w sposób ciągły jeden skan MS, a następnie jak najwięcej tandemowych MSMS w okresie 3 sekund, używając CID i znormalizowanej energii zderzenia 35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj składniki peptydów i białek przy użyciu standardowych metod. W tej pracy przeprowadzono dwa zestawy analiz peptydów i białek.</li>
</ol>

<ol><li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li>
<li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS%3A+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li>
<li>Pall. BLI Technology. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fortebio.com/bli-technology.html">http://www.fortebio.com/bli-technology.html</a> (2018).</li>
<li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+anthrax+toxin+pore%3A+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li>
<li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+%28G-CSF%29+in+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABRF-MIRG+benchmark+study%3A+Molecular+interactions+in+a+three-component+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li>
<li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li>
<li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li>
<li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA%5BTitle%5D)+AND+%22Site-Specific+Protein+Labeling%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li>
<li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li>
<li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH%2C+oxidation%2C+and+small+molecule+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li>
<li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li>
<li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Tomography%3A+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li>
</ol>

W tej chwili nie ujawniamy żadnych informacji.

Demonstracja ta ilustruje, w jaki sposób tworzenie się kompleksów makromolekularnych można łatwo monitorować za pomocą interferometrii biowarstw, wizualizować za pomocą EM i weryfikować za pomocą MS, a wszystko to z mikroobjętościami w krótkim czasie. Montaż strukturalny i obserwowane kompleksy są zgodne z biologicznie istotnymi przewidywaniami, co dodatkowo potwierdza tę połączoną metodologię. Jak wspomniano w sekcji wyników, kluczowy element powodzenia montażu wymaga racjonalnie zaprojektowanej mutagenezy cysteiny, aby zapewnić, że złożone interfejsy białko-białko są prawidłowo zorientowane z dala od powierzchni biosensora.
Poprzednie systemy wykorzystywały techniki BLI i MS do oceny wiązania białek w układach dwu- i trzyskładnikowych, a także integralności wiązania z receptorem eksprymowanego białka, ale w obu przypadkach metody te nie zostały opracowane z myślą o wykorzystaniu podejścia tandemowego EM/MS 8,9. Jedynym innym systemem interferometrycznym, który łączył analizę MS w celu scharakteryzowania oddziaływań, była interferometria o podwójnej polaryzacji10. Niestety, ten system nie jest już dostępny do ogólnego użytku. Jak wspomniano we wstępie, przeprowadzono szereg badań, w których próbki zostały utworzone na powierzchniach biosensorów podobnych do SPR i usunięte z analizy SM. Żaden z tych przykładów nie skutkował powstaniem kompleksów zwizualizowanych za pomocą EM.
Ograniczenia tej metody sekwencyjnej mogą być liczne, ale można je rozwiązać. W przypadku początkowego unieruchomienia, a tym samym etapu fundamentowego montażu, brak wiedzy na temat powierzchni interakcji konstrukcyjnych z pewnością utrudniłby postęp związany z monitorowaniem początkowych faz montażu. Brak informacji o strukturze można rozwiązać, projektując inżynieryjną konstrukcję fundamentową, w której substancje chemiczne przyłączania (np. ugrupowanie sulfhydrylowe dla wiązań dwusiarczkowych / pozycjonowanie oznaczone przez Hisa) mogą być przenoszone do różnych regionów w systemie montażu rdzenia. W przypadku kompleksu toksyny wąglika na szczęście dostępna jest struktura LFN związana zpreporem PA11. Racjonalne umieszczenie zmodyfikowanej cysteiny zlokalizowano w regionach oddalonych odpowierzchni wiążącej PA. W przypadku związków chemicznych wiązań cysteinowych zaleca się, aby na powierzchni białka nie było żadnych innych reaktywnych cystein.
Istnieją różne substancje chemiczne przyłączania, które można wykorzystać do zaprojektowania określonego miejsca przyłączenia na powierzchni białka. Jednym z najpopularniejszych specyficznych przystawek jest umieszczenie ugrupowania biotyny w ściśle określonym miejscu na powierzchni białka12. Niestety, wiązanie biotyny z powierzchniami pokrytymi streptawidyną lub awidyną jest dość ścisłe. Odwrócenie interakcji wiązania nie jest proste. Zastosowanie zaprojektowanego znacznika His na końcu N lub C i wynikająca z tego łatwość mocowania do powierzchni Ni-NTA jest bardziej uniwersalnym zastosowaniem unieruchomienia powinowactwa. Oczywiście, jednym z zastrzeżeń dotyczących miejsc mocowania montażu inżynieryjnego z systemami oznaczonymi przez Hisa jest wymóg, aby końce N i C białka zespołu rdzenia pozostały odsłonięte i oddzielone, aby mocowanie było łatwe. Podobnie jak w przypadku wszystkich procesów składania, interfejs interakcji białka składania rdzenia musi pozostać dostępny w miarę postępu złożonego składania.
Być może najczęstszym problemem związanym ze stosowaniem chemii powierzchni biosensorów jest niespecyficzne wiązanie. Końcówki streptawidyny są często źródłem znaczących, niespecyficznych efektów wiązania. Biotyna związana z dwusiarczkiem może być stosowana do uwalniania bardzo specyficznych kompleksów, pozostawiając zredukowane wiązanie S-biotyny ściśle związane z unieruchomionymi biosensorami streptawidyny13. Dostępne są inne odwracalne substancje chemiczne, takie jak iminoboroniany i w mniejszym stopniu ketoamid14. Dziedzina ta jest obecnie słabo rozwinięta, ale istnieje duże zainteresowanie dalszym opracowywaniem odwracalnych protokołów kowalencyjnych w celu uniknięcia skutków toksyczności leków poza celem, które często towarzyszą stosowaniu kowalencyjnego opracowywania leków celowanych.
Ograniczeniem stosowania EM do wizualizacji kompleksów jest interpretacja, zwłaszcza w przypadkach, gdy struktury złożonych kompleksów nie są początkowo znane. Przestrzenną lokalizację składników w niezdefiniowanym złożonym kompleksie makromolekularnym można zidentyfikować za pomocą przeciwciał monoklonalnych (mAb) jako specyficznych markerów kinetycznych i strukturalnych. Na przykład po utworzeniu kompleksu można dodać przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z określonymi składnikami. Ta metoda jest często stosowana w EM do identyfikacji określonych komponentów w dużych zespołach15. Kolejne ograniczenie jest związane z rozmiarem kompleksu, chociaż zdarzały się przypadki, w których zdefiniowane symetryczne zespoły o wielkości zaledwie 70 kDa (heptamer GroES) można łatwo rozwiązać za pomocą ujemnego barwienia EM. Złożone kompleksy, które są analizowane przez EM, mają zwykle średnicę w zakresie ~100 A lub większą. Ostatnio jednak udało się rozpuścić białka o masie zaledwie 20 kDa i uzyskać struktury o niskiej rozdzielczości przy użyciu lepszych metod barwienia16.
W przypadku analizy stwardnienia rozsianego zwiększona czułość obecnego oprzyrządowania SM aż do poziomu femtomolowego (attomolowego) może w niektórych przypadkach zwiększyć czułość wykrywania BLI. Jest wysoce prawdopodobne, że sygnały białkowe, które wykazują minimalny, ale powtarzalny wzrost amplitudy, spowodują identyfikację danego białka. Ponadto sondowanie interakcji białko-białko z jednym z partnerów podłączonych do biosensora, a drugim w środowisku komórkowym, w efekcie doprowadzi do oczyszczenia, a następnie łatwiejszego wykrycia nowo powstałego kompleksu. Jednym z ograniczeń, które można zaobserwować w obecnych bardzo czułych systemach stwardnienia rozsianego, jest to, że białko będące przedmiotem zainteresowania może nie znajdować się w bazie danych, ale ta obserwacja jest rzadka (np . proteomy rzadkich gatunków). Jeśli sekwencje białek będących przedmiotem zainteresowania są znane, problem ten można łatwo rozwiązać, włączając sekwencję aminokwasów białka (białek) do bazy danych białek tła (jak opisano w tej pracy w sekcji protokołu). Innym potencjalnym ograniczeniem metodyki jest oporność białka na trypsynolizę. Trawienie trypsyny jest zazwyczaj domyślną metodą oddolnej identyfikacji białek. Jednak białka mogą być oporne na trypsynę, jeśli brakuje im reszt Arg i Lys lub dostęp do tych reszt jest ograniczony przez pofałdowaną strukturę. Ograniczenia te są rozwiązywane, odpowiednio, poprzez zastosowanie alternatywy lub kombinacji proteaz lub włączenie odczynnika rozwijającego się (mocznik lub HCl guanidyny, jak wskazano w 1.1.14 i 1.2.6) przed trawieniem enzymatycznym.
Możliwe rozszerzenia tej metodologii obejmują umożliwienie użytkownikowi śledzenia i identyfikowania kompleksów składania komórkowego z surowych lizatów komórkowych. Okazuje się, że testowanie składników montażowych w skoncentrowanych ekstraktach komórkowych jest łatwe do przeprowadzenia przy użyciu procedur interferometrii biowarstw. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metodologii opartych na mikroprzepływach, które są podatne na zapychanie i wrażliwe na agregację, podejście BLI można wykorzystać do bezpośredniego zanurzania końcówek czujników biowarstw w surowych ekstraktach w celu potencjalnego złożenia określonych kompleksów bezpośrednio z tych skoncentrowanych zanieczyszczonych próbek. Po zmontowaniu całkowicie możliwe jest użycie specyficznych sond przeciwciał jako kontynuacji systemu BLI w celu dalszej identyfikacji, a nawet ilościowego określenia podejrzanych składników w ekstraktach komórkowych, które zostały zidentyfikowane za pomocą metody mikroobjętości MS. Ponownie, kluczem jest tutaj użycie zdefiniowanych, odpowiednio zorientowanych białek rdzeniowych jako specyficznych sond powinowactwa.
Możliwość kinetycznego spojrzenia na proces przejścia od pory do porów za pomocą BLI będzie bardzo przydatna w identyfikacji potencjalnych "anty-toksynowych" małocząsteczkowych inhibitorów przemian białkowych, które specyficznie działają w późnych warunkach endosomalnych o niskim pH (5,0). To indukowane pH przejście od prepora do pora jest hamowane w obecności stabilizatora fałdowania (osmolitów), takiego jak glicerol lub sacharoza, a tym samym stanowi silne wsparcie dla opracowania specyficznych ukierunkowanych stabilizatorów fałdowania, które zapobiegają tworzeniusię porów PA. To specyficzne podejście pozwala uniknąć i zastąpić prymitywne testy oparte na agregacji, w których spadki pH prowadzą do wytrącania się białek. Ta ostatnia metoda, choć dobra w przypadku pierwotnych metod wstępnych badań przesiewowych, często prowadzi do wyników fałszywie dodatnich, w których określone związki hamują agregację, a nie rzeczywiste przejścia molekularne.
Dalsze obserwacje struktury i identyfikacja poszczególnych zmontowanych składników w małych próbkach mikroobjętościowych mogą być również przydatne w walidacji potencjalnych związków ołowiu. Można to zastosować w przypadkach, gdy docelowym wynikiem jest albo określona stabilizacja zespołu, albo destabilizacja. To równoległe podejście kinetyczne/struktura/identyfikacja jest przydatne do bezpośredniego potwierdzania ważności podejrzewanych efektorów montażu związków ołowiu i służy jako rozsądny wtórny etap przesiewowy lub podejście o średniej przepustowości.
Cryo-EM jest przydatną techniką do badania szczegółów atomowych kompleksów makromolekuł w różnych stanach składania. Przed przygotowaniem próbek kriogenicznych należy najpierw sprawdzić, czy preparat zawiera w miarę czyste jednorodne kompleksy o ujemnym zabarwieniu EM. Prezentowana praca przedstawia składanie kompleksów białkowych na powierzchniach biosensorów BLI, uwalnianie tych kompleksów do wizualizacji EM oraz identyfikację tych składników za pomocą MS. Ta szczególna metodologia kontrolowanego montażu i uwalniania może być przydatna w generowaniu bardzo specyficznych protokołów, które usprawniają jednorodne sekwencyjne przygotowanie próbki do ujemnego barwienia EM, co jest niezbędnym krokiem, który należy wykazać przed przejściem do krio-EM. Aby uzyskać strukturę 3D o niskiej rozdzielczości, do wykonania serii nachylenia stożkowego (70 różnych widoków obrazu 2D na cząstkę) potrzeba tylko 30-50 cząstek kompleksu, pod warunkiem, że istnieje różnorodność orientacji (wiele różnych widoków).
Jeśli chodzi o ulepszanie metod leczenia stwardnienia rozsianego, postęp w zakresie czułości i zmniejszania objętości próbki jest nadal poprawiany. Nanoprzepływy i ultrawysokociśnieniowa chromatografia cieczowa wraz z opracowaniem spektrometrów masowych o szybkim cyklu pracy, zwiększonej czułości i zdolności rozdzielczej. Niedawne wprowadzenie spektrometru mas orbitrap, a w szczególności jego najnowszej wersji (orbitrap Fusion Lumos i jego oczekiwanego następcy Orbitrap Fusion Lumos 1M), a także algorytmów wyszukiwania znacznie ułatwia ten proces.
Obecna metodologia monitoruje kinetyczny montaż i demontaż składników toksyny wąglika przy użyciu metodologii BLI bez znaczników oraz ocenia strukturę i tożsamość tych składników za pomocą odpowiednio EM i MS. Zastosowanie prostego, jednokanałowego systemu BLI w połączeniu z rutynową analizą EM barwienia ujemnego i podstawowymi technikami MS jest więcej niż wystarczające do scharakteryzowania procesu montażu.

Identyfikacja i zrozumienie specyfiki rządzącej składaniem kompleksów białkowych in vivo jest niezwykle interesujące dla badaczy biochemii. Duże heterogeniczne zespoły białek są raczej normą niż wyjątkiem. Pogląd ten jest wspierany przez spektroskopowe monitorowanie składania in vivo, izolowanie kompleksów przy użyciu łagodniejszych technik rozbijania komórek, ocenę produktów z metod oczyszczania opartych na powinowactwie i wizualizację ich za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości (cryo-EM). Aby zrozumieć kontrolę specyficzności składania w komórce, naukowcy muszą rutynowo izolować, identyfikować i ostatecznie charakteryzować te dynamiczne struktury składania/demontażu. Najintensywniej używanym narzędziem molekularnym do identyfikacji składników tych zespołów często wymaga immunoprecypitacji opartej na przeciwciałach, która opiera się na utrzymaniu złożonej stabilności podczas rozbijania komórek. Niedawno opracowano różne sprzężone techniki analityczne w celu wychwytywania kompleksów z próbek komórkowych przy użyciu podejść opartych na mikroprzepływach, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). Po usunięciu z powierzchni SPR, próbki te analizowano za pomocą matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu przelotu (MALDI-TOF)1,2. Rozwinięcie tej metodologii przy użyciu łatwiejszych protokołów pozwoli naukowcom na wizualizację i walidację przewidywanych kompleksów występujących w środowisku komórkowym. Ponieważ SPR jest systemem opartym na mikrofluidyce, często pojawiają się problemy z tworzeniem agregatów. Obejście tego problemu wymaga rozcieńczenia próbki, co z kolei może zmniejszyć integralność kompleksów biologicznych podatnych na stężenia.
Stosunkowo niedawnym osiągnięciem w technologiach bezetykietowych jest rozwój systemu interferometrii biowarstw (BLI)3. Te szczególne systemy odbicia oparte na świetle replikują lub najlepiej emulują wiązanie SPR i wyniki kinetyczne za ułamek kosztów3,4, szczególnie jeśli używane są jednostki jednokanałowe. BLI mierzy zmiany we wzorcach interferencji światła odbitego między warstwą odniesienia (kontrolną) a powierzchnią biowarstwy (eksperymentalną). Wynikająca z tego zmiana fazy jest mierzona w czasie rzeczywistym jako odczyt kinetyczny i ilościowy5. Powierzchnia biosensora, zawierająca specyficzne substancje chemiczne immobilizacji, jest fizycznie przenoszona między roztworami, w przeciwieństwie do zmian za pomocą podejść mikroprzepływowych w SPR, w celu pomiaru za pomocą odchyleń fazowych długości fali. Efektom przenoszenia masy zapobiega się poprzez mieszanie roztworu. W przeciwieństwie do SPR, systemy te są bardzo przydatne w ocenie kompleksów z surowych próbek biologicznych. Parametr fizyczny mierzony podczas eksperymentów BLI zależy przede wszystkim od zmiany masy lub grubości na powierzchni biosensora, która wynika z montażu lub demontażu kompleksu białkowego.
Te biosensory światłowodowe są łatwe w użyciu i stosunkowo niedrogie. Jednym z pojawiających się użytecznych aspektów BLI jest łatwe usuwanie nowo złożonych kompleksów białkowych z powierzchni. Niedawne zastosowanie tej metody pozwoliło naszemu laboratorium obserwować w czasie rzeczywistym kinetykę indukowanej pH na dużą skalę rearanżacji struktury białka składnika antygenu ochronnego toksyny wąglika (PA), gdy prepor (PAprepore) przechodzi do swojej postaci porowej (PApore). To przejście na końcówce biosensora zostało zweryfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM)6. Usuwanie kompleksów z powierzchni biosensorów pozwala uniknąć efektów rozcieńczenia większej objętości, często występujących podczas uwalniania kompleksów z powierzchni chipów podczas korzystania z systemów mikroprzepływowych.
W obecnej pracy, kompleksy toksyny wąglika są montowane i demontowane na powierzchni biosensora, a następnie uwalniane do objętości mikrolitrów. Otrzymane złożone składniki są weryfikowane ortogonalnie za pomocą EM i spektrometrii mas (MS).

<table><tbody><tr><td>(1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid)) (EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-pirydynylo)etanoamina) (PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml czarne mikroprobówki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 50 &mu; m x 150mm, C18, 2 &mu; m, 100 i Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Aminowe reaktywne końcówki 2. generacji (AR2G)</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Anotop 10, 0,02um</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarne Morfogenne Gen-2</td><td></td><td></td><td>Białko produkowane i oczyszczane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Powlekane węglem Cu 300 siatka</td><td>Nauki o Mikroskopii Elektronowej</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>Kwasy mrówkowe</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>MP-BioMedicals, LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chlorowodorku L-cystienu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik śmiertelny Domena</td><td></td><td></td><td>N-końcowa Białko produkowane i oczyszczane we własnym</td></tr><tr><td>oprogramowaniu MS w wersji 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>System czyszczenia wyładowań jarzeniowych Pelco easiGlow</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Ochronny prepor</td><td></td><td></td> antygenowy <td>Białko produkowane i oczyszczane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Jakościowe kręgi bibuły filtracyjnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT wyszukiwarka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan uranylu (UF)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, białka są często częścią dużych kompleksów makromolekularnych, gdzie specyficzność wiązania i dynamika ostatecznie dyktują funkcjonalne wyniki. W tej pracy przedendosomalna toksyna wąglika jest składana i przekształcana w kompleks endosomalny. Po pierwsze, N-końcowa domena śmiertelnego czynnika mutanta cysteiny (LFN) jest przyłączona do bioczujnika interferometrii biowarstwowej (BLI) poprzez sprzężenie dwusiarczkowe w optymalnej orientacji, umożliwiając wstępne związanie antygenu ochronnego (PA) (Kd 1 nM). Optymalnie zorientowany komplekspreporowy LFN-PA wiąże się następnie z rozpuszczalnym receptorem powierzchniowym komórki kapilarnego morfogennego genu-2 (CMG2) (Kd 170 pM), w wyniku czego powstaje reprezentatywny kompleks preendosomalny wąglika, stabilny przy pH 7,5. Ten złożony kompleks jest następnie poddawany zakwaszeniu (pH 5,0) reprezentatywnemu dla późnego środowiska endosomu w celu przejściapreporu PA w stan porów wstawionych przez membranę. Ten stanporów PA powoduje osłabione wiązanie między receptorem CMG2 aporem LF N-PA oraz znaczną dysocjację CMG2 od porów przejściowych. Tio-przyłączenie LFN do powierzchni biosensora można łatwo odwrócić za pomocą ditiotreitolu. Redukcja na powierzchni biosensora BLI uwalnia trójskładnikowy kompleks LFN-PA prepore-CMG2 lub kompleksyporowe LFN-PA z przemianami kwasowymi do objętości mikrolitrów. Uwolnione kompleksy są następnie wizualizowane i identyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Eksperymenty te pokazują, jak monitorować kinetyczne składanie/rozkładanie określonych kompleksów białkowych przy użyciu bezznacznikowych metodologii BLI oraz oceniać strukturę i tożsamość tych złożonych kompleksów BLI za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, przy użyciu łatwych do odtworzenia procedur sekwencyjnych.

Zdolność do monitorowania i walidacji składania dużych kompleksów makromolekularnych jest kluczowym krokiem w stronę zrozumienia specyficzności i funkcjonalności dużych zgrupowań biomolekularnych. Wyniki przedstawionych tutaj metod demonstrują łatwość, z jaką można składać duże kompleksy białkowe (masa &gt;150 kDa) przy użyciu interferometrii warstwy biologicznej, monitorując jednocześnie kinetykę i amplitudę procesu składania. Unikalna, zwarta natura powierzchni biosensora umożliwia rozszerzenie analizy składania poprzez uwalnianie złożonych kompleksów do małych mikrobioobjętości. Mikrobioobjętości te mogą być wykorzystane do wizualizacji początkowej struktury fizycznej kompleksów za pomocą EM oraz do weryfikacji tożsamości komponentów kompleksu za pomocą MS. Schematyczny przegląd całego tego procesu przedstawiono na Rysunku 1.
Kluczowym elementem dla skutecznego montażu i weryfikacji kompleksu makrocząsteczkowego na powierzchni biosensora jest prawidłowa orientacja białka inicjującego. Zapewnia to dostępność miejsc oddziaływań białko-białko, zapobiega ich blokowaniu sterycznemu i optymalnie pozycjonuje je z dala od powierzchni biosensora. Jak pokazano na Rysunku 2, prawidłowa orientacja kompleksu toksyny wąglika jest osiągana poprzez zastosowanie specjalnie zaprojektowanego fragmentu N-końcowego czynnika letalnego (LFN), dzięki czemu miejsce wiązania LFN-PAprepore jest zawsze zorientowane przeciwnie do miejsca kowalencyjnego przyczepienia do biosensora6,7. Następująca budowa kompleksu poprzez wiązanie PA do biosensora BLI z LFN, a następnie wiązanie rozpuszczalnego CMG2 do PA, prowadzi ostatecznie do powstania kompleksu toksyny wąglika zdolnego do translokacji.
Krzywa sensogramu BLI stanowi odczyt w czasie rzeczywistym zmian amplitudy wynikających ze specyficznego dodawania komponentów toksyny wąglika na biosensor. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywną krzywą wraz z modelem kompleksu, którego powstanie przewidywano na tym etapie procesu. Pierwszy wzrost wynika z obciążenia końcówki LFN. Po wygaszeniu i ustaleniu linii bazowej PAprepore wiąże się z LFN, a następnie po dodaniu rozpuszczalnego receptora CMG2 powstaje zmontowany kompleks przedendosomalny LFN-PAprepore-CMG2. Aby przejść do warunków odpowiadających późnemu endosomowi, cały kompleks poddawany jest impulsowi niskiego pH (pH 5.0), który osłabia wiązanie receptora, umożliwiając preporowi przejście w rozciągniętą konformację poru wbudowanego w błonę.6 Krzywe sensogramu dla etapu zakwaszania przedstawiono na Rysunku 4. Początkowy wzrost lub „skok” amplitudy jest prawdopodobnie wynikiem rozciągania poru6, które musi nastąpić przed spadkiem wiązania receptora CMG2. Większy spadek amplitudy wynika najprawdopodobniej ze znacznej lub całkowitej dysocjacji receptora z powodu zmniejszenia powinowactwa wiązania. Wcześniejsze prace w tym laboratorium wskazały, że wiązanie CMG2 do w pełni rozciągniętego PApore jest pomijalne w porównaniu z oddziaływaniem CMG2-PAprepore6. Ponadto kinetyczna krzywa sensogramu, obserwowana we wszystkich sensogramach przejść z LFN-PAprepore-CMG2 do LFN-PApore przy spadku pH, jest powtarzalna w wielu pomiarach.
Przed i po zakwaszeniu kompleksy przyłączone do biosensora są łatwo uwalniane w celu wizualizacji za pomocą EM z barwieniem negatywowym oraz identyfikacji za pomocą MS (Rysunek 5). Reprezentatywne kompleksy z wyników EM przedstawiono na Rysunku 6). Siatki z próbkami przedendosomalnymi wykazują gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LFN-PAprepore-CMG2. Siatki z kompleksami po zakwaszeniu wykazują przejście PA w formę pory oraz solubilizację poprzez włączenie w micelę, bez wyraźnej gęstości CMG2.
Tożsamość kompleksów przed i po zakwaszeniu zweryfikowano za pomocą MS. Stworzono bazę danych, w której sekwencje PA (P13423), LFN (P15917) oraz CMG2 (P58335) zawarto w tle bazy białek mysich pochodzącej z repozytorium NCBInr. W pierwszym przeszukiwaniu bazy uzyskano jedynie białka będące przedmiotem zainteresowania, przy następującym pokryciu aminokwasowym dla kompleksów trójcząsteczkowych i dwucząsteczkowych: odpowiednio 54% i 22% dla PA, 36% i 6% dla LF oraz 43% dla CMG2 (CMG2 nie wykryto w kompleksie dwucząsteczkowym). Aby zmaksymalizować pokrycie aminokwasowe białek, przeprowadzono drugą identyfikację peptydów/białek przy użyciu bazy białek zawierającej wyłącznie trzy interesujące nas białka. Próbki MS z etapu przedendosomalnego zawierały peptydy wszystkich trzech komponentów toksyny z pokryciem wynoszącym odpowiednio 60,46%, 67,97% i 54,15% dla LFN, PA i CMG2 (Rysunek 7). Wyniki z etapu poendosomalnego, przedstawione na Rysunku 8, zawierały jedynie peptydy LFN i PA (odpowiednio 57,41% i 67,79% pokrycia). Brak CMG2 w próbkach poendosomalnych jest zgodny z obserwowanym spadkiem sygnału BLI nm podczas tworzenia porów.
<img alt="Proces składania kompleksu białkowego; schemat biosensora; spektrometria mas; mikroskopia elektronowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przegląd analizy kompleksów białkowych składanych na biosensorze BLI i izolowanych z niego przy użyciu EM i MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat interfejsu wiązania białek; metoda biokoniugacji, struktura E126LFN, tworzenie wiązania SH-NH." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Aktywacja biosensora: Pierwszy etap montażu specyficznego pod względem orientacji na biosensorze BLI. Domena N-końcowa czynnika letalnego E126C (LFN) jest połączona poprzez wiązanie tioeterowe, co tworzy prawidłowo zorientowany interfejs wiązania PAprepore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu wiązania białek z wykresem profilu wiązania; etapy: ładowanie LFN, wiązanie miceli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Monitorowanie montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą BLI: Sensogram pokazuje zmiany amplitudy w funkcji czasu wynikające ze specyficznego dodawania składników toksyny wąglika do biosensora, rozpoczynając od ładowania LFN (krok 4 w Tabeli 1). Następnie na powierzchnię ładowany jest PAprepore, po czym dodawany jest rozpuszczalny receptor CMG2. Zmontowany kompleks przedendosomalny składa się z LF-PAprepore- CMG2. Aby przejść do warunków odpowiadających późnemu endosomowi, cały zmontowany, funkcjonalny kompleks toksyny wąglika poddawany jest impulsowi niskiego pH (pH 5.0), który osłabia wiązanie receptora, umożliwiając preporowi przejście w rozszerzoną konformację poru wbudowanego w błonę. Ekspozycja poru przebiegającego przez błonę zostaje potwierdzona i solubilizowana poprzez dodanie miceli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres spektroskopii przejściowej absorpcji pokazujący wpływ zakwaszenia na dynamikę białka wraz ze strukturami 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Sensogram BLI uwalniania CMG2: Ślady etapu zakwaszania wykazują początkowy wzrost lub „skok” amplitudy, po którym następuje spadek o większej amplitudzie, co prawdopodobnie odpowiada odpowiednio tworzeniu się porów i dysocjacji receptora. Pionowe czerwone linie przerywane oznaczają początek nowego etapu. Sensogramy są wyrównane do pogrubionej czerwonej linii przerywanej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Uwalnianie kompleksów biosensora; schemat mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas; metoda analizy białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Analiza kompleksów białkowych zmontowanych na biosensorze BLI i wyizolowanych z niego za pomocą EM i MS: Kompleksy przytwierdzone do biosensora są łatwo uwalniane do 5 µL buforu zawierającego DTT w celu wizualizacji za pomocą EM z barwieniem negatywowym oraz identyfikacji za pomocą MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procesy uwalniania białek; schemat; biosensor, etapy zakwaszania; wizualizacja w skali nanometrycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wizualizacja kompleksów białkowych za pomocą EM: siatki z próbkami przedendosomalnymi wykazują gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LFN-PAprepore-CMG2. Siatki z kompleksami poendosomalnymi pokazują przejście PA w por i solubilizację przez micelę, bez wyraźnej gęstości CMG2. Modele przewidywanych kompleksów (po lewej stronie) są w tej samej skali co pokazane pojedyncze cząsteczki. Poniżej każdej cząsteczki przedstawiono cząsteczki pokolorowane zgodnie z przewidywanym białkiem (na podstawie wielkości gęstości EM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat uwalniania biosensora białkowego; dane o pokryciu dla białek LFN, PA, CMG2; analiza eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Weryfikacja kompleksów białkowych za pomocą MS: próbki MS z etapu przedendosomalnego zawierały peptydy wszystkich trzech komponentów toksyny, z pokryciem wynoszącym odpowiednio 60,46%, 67,97% i 54,15% dla LFN, PA i CMG2. Peptydy wykryte przy współczynniku fałszywych odkryć (FDR) równym lub wyższym niż 5% zaznaczono na żółto, a FDR równym lub wyższym niż 1% zaznaczono na zielono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań białek za pomocą biosensora; schematy przedstawiają detekcję LFN, PA i CMG2 wraz z danymi o pokryciu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Weryfikacja kompleksów białkowych za pomocą MS: Próbki poendosomalne zawierały peptydy z LFN i PA (pokrycie odpowiednio 57,41% i 67,79%), ale nie z CMG2. FDR równy lub wyższy niż 5% zaznaczono na żółto, FDR równy lub wyższy niż 1% zaznaczono na zielono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Czas (s)</td>
			<td>Opis </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>Wstępna wartość bazowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>Aktywacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>Aktywacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN ładowanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>Wygaszanie cysteiną</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>Poziom bazowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAPrzygotuj powiązanie </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>Poziom wyjściowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>asocjacja CMG2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>Poziom bazowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>Przejście kwasowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>Poziom wyjściowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Asocjacja micelarna</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Czasy poszczególnych etapów pojedynczego pomiaru BLI w celu montażu kompleksu toksyny wąglika. Należy pamiętać, że linie bazowe są wykorzystywane do wypłukania niezwiązanego białka z poprzedniego etapu i/lub do ustanowienia nowej linii bazowej buforu.

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja dynamicznego składania kompleksów białkowych w różnych środowiskach pH przy użyciu interferometrii biowarstw i potwierdzenie składników za pomocą mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Identyfikacja i zrozumienie specyfiki rządzącej powstawaniem i składaniem kompleksów białkowych jest niezwykle interesujące dla badaczy biochemicznych. Metodologia, o której dzisiaj mówimy, pozwala naukowcom gromadzić, wizualizować i walidować przewidywane kompleksy makromolekularne.Złożona natura powierzchni biosensora pozwala naukowcom na łatwe uwalnianie złożonych kompleksów do małych mikroobjętości w celu analizy mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. W tej demonstracji śledziliśmy kinetykę indukowanych przez pH rearanżacji strukturalnych kompleksu toksyny wąglika i zweryfikowaliśmy te przegrupowania za pomocą metod mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, a wszystko to przy unikaniu agregacji. Alexandra Machen i Pierce O'Neil, doktoranci z mojego laboratorium, zademonstrują montaż toksyny wąglika na powierzchni biosensora BLI, uwalnianie próbki w skali makro i procedury barwienia EM-ujemnego.Dr Antonio Artigues odgrywa kluczową rolę w analizie i identyfikacji mikropróbek uwolnionych przez BLI za pomocą spektrometru masowego Orbitrap Fusion Lumos. Na początek uwodnij końcówkę biosensora BLI drugiej generacji, zanurzając ją w 250 mikrolitrach wody i inkubuj przez 10 minut. W oprogramowaniu Blitz zaprogramuj czasy kroków zgodnie z podaną w tej tabeli.Rozpocznij bieg BLI, zanurzając końcówkę biosensora w 250 mikrolitrach wody na 30 sekund, aby zmierzyć początkową linię bazową grubości i gęstości bioczujnika. Następnie aktywuj bioczujnik, zanurzając końcówkę w 250 mililitrach 50-milimolowego NHS i 200-milimolowego EDC na siedem minut. Następnie zanurz aktywowany bioczujnik w 50-milimolowym PDEA rozpuszczonym w 0,1 molowym buforze boranowym o pH 8,5 na pięć minut, aby wytworzyć aktywowaną powierzchnię bioreaktywną.Teraz zanurz aktywowany bioreaktywny bioczujnik w 250 mikrolitrach roztworu zawierającego 100 nanomolowych E126C LFn w 10 milimolowym octanie sodu pH pięć, 100 milimolowych buforu chlorku sodu na pięć minut. Zanurz końcówkę LFn w 50-milimolowej L-cysteinie, 1 molowym chlorku sodu, 0,1 molowym octanie sodu o pH pięć na cztery minuty, aby schłodzić wszelkie pozostałe wolne grupy reagujące z tiolami. Po zanurzeniu wygaszonej końcówki LFn w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu w celu ustalenia linii podstawowej buforu, zanurz końcówkę w 0,5 mikromolowym antygenie ochronnym, 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na pięć minut, aby utworzyć kompleks LFn PA-prepore.Po skojarzeniu PA-prepore wyjmij końcówkę z roztworu PA-prepore i zanurz końcówkę w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na 30 sekund, aby zmyć wszelkie niespecyficznie związane PA-prepore. Zanurz kompleks LFn PA-prepore w 0,5 mikromolowym CMG2 w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na pięć minut. Zanurz kompleks LFn PA-prepore CMG2 w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na 30 sekund, aby zmyć niezwiązany CMG2 w celu utworzenia kompleksu preendosomalnego.W celu analizy EM uwolnij kompleks LFn PA-prepore CMG2 z końcówki biosensora, zanurzając końcówkę w probówce PCR zawierającej pięć mikrolitrów 50-milimolowego DTT, 50-milimolowego Tris i 50-milimolowego chlorku sodu. W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LFn PA-prepore CMG2 z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w probówce PCR zawierającej pięć mikrolitrów 50-milimolowego DTT, sześciokrotnego chlorowodorku guanidyny bez keratyny i 25-milimolowego wodorowęglanu amonu, pH osiem. Aby wyświetlić kompleks po zmianie pH, zmontuj kompleks LFn PA-prepore CMG2 na bioczujniku, jak właśnie pokazano.Zanurz końcówkę biosensora w 10-milimolowym octanie o pH pięć na pięć minut, aby zainicjować przejście z PA-preporu do PA-porów. To przejście jest wskazane przez wzrost amplitudy, po którym następuje większy spadek amplitudy, który przypuszczalnie jest istotny dla całkowitej dysocjacji receptora z powodu zmniejszonego powinowactwa wiązania. W przypadku analizy EM zanurz końcówkę biosensora w roztworze zawierającym 1,25 milimolowego micelu na pięć minut, aby zapobiec agregacji w roztworze po uwolnieniu dwusiarczku.Aby przeprowadzić mikroskopię elektronową z ujemnym zabarwieniem, zacznij od rozładowania żarzenia siatki 300 z miedzi pokrytej węglem przy stabilnym ciśnieniu atmosfery 0,38 milibara i minus 15 miliamperów przez 20 sekund, a następnie odpowietrz urządzenie powietrzem. Zabezpiecz siatkę między parą czystych pęset. Następnie odpipetować cztery mikrolitry uwolnionej złożonej próbki na siatkę i pozostawić na adsorpcję przez 60 sekund.Za pomocą klina bibuły filtracyjnej odchować pozostały płyn. Następnie zabarwić siatkę, pipetując na nią pięć mikrolitrów przefiltrowanego mrówczanu uranylu o wartości 0,75% punktu zerowego o dwóch mikronach, a po pięciu sekundach usunąć nadmiar plamy. Pozostaw kratkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej pod przykryciem.Następnie użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby obejrzeć próbkę. Na koniec, po przygotowaniu próbek do spektrometrii mas zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom spektrometr masowy za pomocą CID i znormalizowanej energii zderzenia 35 pod automatyczną kontrolą, aby w sposób ciągły wykonywać jeden skan MS, a następnie jak najwięcej skanów MS-MS w tandemie w okresie trzech sekund. Ślad sensogramu BLI to odczyt w czasie rzeczywistym zmian amplitudy spowodowanych specyficznym dodatkiem składników toksyny wąglika.Pierwszym wzniesieniem jest załadowanie LFn na końcówkę. Po wygaszeniu i linii bazowej, PA-prepor wiąże się z LFn, a następnie dodaje rozpuszczalny CMG2, w wyniku czego powstaje złożony kompleks preendosomalny. Kompleks jest następnie poddawany działaniu niskiego pH, które osłabia wiązanie receptorów i powoduje przejście preporu do jego rozszerzonego poru, potwierdzenia, które jest potwierdzone przez dodanie miceli.Pokazano tutaj ujemne obrazy EM kompleksów po uwolnieniu z biosensora. Siatki próbek preendosomalnych wykazały gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LFn PA-prepore CMG2. Siatki kompleksów po zakwaszeniu pokazują, że PA przeszedł do porów i rozpuścił się przez inkluzję miceli bez oczywistej gęstości CMG2.Jak zaobserwowano w przypadku stwardnienia rozsianego, które potwierdziło kompleksy białkowe, próbki przedendosomalne SM zawierały peptydy ze wszystkich trzech składników toksyn o pokryciu odpowiednio 60,46, 67,97 i 54,15% dla LFn, PA i CMG2. Próbki postendosomalne zawierały tylko peptydy z LFn i PA. Brak CMG2 jest zgodny z obserwowanym spadkiem nanometrów BLI podczas tworzenia porów. Możliwość monitorowania i walidacji składania dużych kompleksów makromolekularnych jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia specyfiki i funkcjonalności dużych zespołów biomolekularnych.Nasza zdolność do uwalniania wstępnie zmontowanych kompleksów makromolekularnych z biosensorów do mikroobjętości w celu wizualizacji mikroskopii elektronowej będzie niezwykle przydatna do analizy struktury. W naszej analizie składu kompleksów składania biosensorów wykorzystaliśmy tylko 0,04 femtomoli kompleksu uwalniającego do identyfikacji jego składników przed i po asymilowanym zakwaszeniu endosomalnym. Protokół uwalniania zespołu biosensorów można dostosować tak, aby śledził naturalne, ale nieuchwytne endosomalne przejścia innych toksyn bakteryjnych w strukturach białek wirusowych wywołane przez pH, z dodatkową korzyścią w postaci uniknięcia agregacji białek.

analyzing-dynamic-protein-complexes-assembled-on-released-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Poznaj metodę analizy dynamicznych kompleksów białkowych z wykorzystaniem interferometrii biowarstwowej, mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie kinetiki złożeń białkowych w różnych warunkach pH.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów