Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja dynamicznego składania kompleksów białkowych w różnych środowiskach pH przy użyciu interferometrii biowarstw i potwierdzenie składników za pomocą mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Identyfikacja i zrozumienie specyfiki rządzącej powstawaniem i składaniem kompleksów białkowych jest niezwykle interesujące dla badaczy biochemicznych. Metodologia, o której dzisiaj mówimy, pozwala naukowcom gromadzić, wizualizować i walidować przewidywane kompleksy makromolekularne.

Złożona natura powierzchni biosensora pozwala naukowcom na łatwe uwalnianie złożonych kompleksów do małych mikroobjętości w celu analizy mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. W tej demonstracji śledziliśmy kinetykę indukowanych przez pH rearanżacji strukturalnych kompleksu toksyny wąglika i zweryfikowaliśmy te przegrupowania za pomocą metod mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, a wszystko to przy unikaniu agregacji. Alexandra Machen i Pierce O'Neil, doktoranci z mojego laboratorium, zademonstrują montaż toksyny wąglika na powierzchni biosensora BLI, uwalnianie próbki w skali makro i procedury barwienia EM-ujemnego.

Dr Antonio Artigues odgrywa kluczową rolę w analizie i identyfikacji mikropróbek uwolnionych przez BLI za pomocą spektrometru masowego Orbitrap Fusion Lumos. Na początek uwodnij końcówkę biosensora BLI drugiej generacji, zanurzając ją w 250 mikrolitrach wody i inkubuj przez 10 minut. W oprogramowaniu Blitz zaprogramuj czasy kroków zgodnie z podaną w tej tabeli.

Rozpocznij bieg BLI, zanurzając końcówkę biosensora w 250 mikrolitrach wody na 30 sekund, aby zmierzyć początkową linię bazową grubości i gęstości bioczujnika. Następnie aktywuj bioczujnik, zanurzając końcówkę w 250 mililitrach 50-milimolowego NHS i 200-milimolowego EDC na siedem minut. Następnie zanurz aktywowany bioczujnik w 50-milimolowym PDEA rozpuszczonym w 0,1 molowym buforze boranowym o pH 8,5 na pięć minut, aby wytworzyć aktywowaną powierzchnię bioreaktywną.

Teraz zanurz aktywowany bioreaktywny bioczujnik w 250 mikrolitrach roztworu zawierającego 100 nanomolowych E126C LFn w 10 milimolowym octanie sodu pH pięć, 100 milimolowych buforu chlorku sodu na pięć minut. Zanurz końcówkę LFn w 50-milimolowej L-cysteinie, 1 molowym chlorku sodu, 0,1 molowym octanie sodu o pH pięć na cztery minuty, aby schłodzić wszelkie pozostałe wolne grupy reagujące z tiolami. Po zanurzeniu wygaszonej końcówki LFn w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu w celu ustalenia linii podstawowej buforu, zanurz końcówkę w 0,5 mikromolowym antygenie ochronnym, 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na pięć minut, aby utworzyć kompleks LFn PA-prepore.

Po skojarzeniu PA-prepore wyjmij końcówkę z roztworu PA-prepore i zanurz końcówkę w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na 30 sekund, aby zmyć wszelkie niespecyficznie związane PA-prepore. Zanurz kompleks LFn PA-prepore w 0,5 mikromolowym CMG2 w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na pięć minut. Zanurz kompleks LFn PA-prepore CMG2 w 50-milimolowym Tris, 50-milimolowym chlorku sodu na 30 sekund, aby zmyć niezwiązany CMG2 w celu utworzenia kompleksu preendosomalnego.

W celu analizy EM uwolnij kompleks LFn PA-prepore CMG2 z końcówki biosensora, zanurzając końcówkę w probówce PCR zawierającej pięć mikrolitrów 50-milimolowego DTT, 50-milimolowego Tris i 50-milimolowego chlorku sodu. W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LFn PA-prepore CMG2 z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w probówce PCR zawierającej pięć mikrolitrów 50-milimolowego DTT, sześciokrotnego chlorowodorku guanidyny bez keratyny i 25-milimolowego wodorowęglanu amonu, pH osiem. Aby wyświetlić kompleks po zmianie pH, zmontuj kompleks LFn PA-prepore CMG2 na bioczujniku, jak właśnie pokazano.

Zanurz końcówkę biosensora w 10-milimolowym octanie o pH pięć na pięć minut, aby zainicjować przejście z PA-preporu do PA-porów. To przejście jest wskazane przez wzrost amplitudy, po którym następuje większy spadek amplitudy, który przypuszczalnie jest istotny dla całkowitej dysocjacji receptora z powodu zmniejszonego powinowactwa wiązania. W przypadku analizy EM zanurz końcówkę biosensora w roztworze zawierającym 1,25 milimolowego micelu na pięć minut, aby zapobiec agregacji w roztworze po uwolnieniu dwusiarczku.

Aby przeprowadzić mikroskopię elektronową z ujemnym zabarwieniem, zacznij od rozładowania żarzenia siatki 300 z miedzi pokrytej węglem przy stabilnym ciśnieniu atmosfery 0,38 milibara i minus 15 miliamperów przez 20 sekund, a następnie odpowietrz urządzenie powietrzem. Zabezpiecz siatkę między parą czystych pęset. Następnie odpipetować cztery mikrolitry uwolnionej złożonej próbki na siatkę i pozostawić na adsorpcję przez 60 sekund.

Za pomocą klina bibuły filtracyjnej odchować pozostały płyn. Następnie zabarwić siatkę, pipetując na nią pięć mikrolitrów przefiltrowanego mrówczanu uranylu o wartości 0,75% punktu zerowego o dwóch mikronach, a po pięciu sekundach usunąć nadmiar plamy. Pozostaw kratkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej pod przykryciem.

Następnie użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby obejrzeć próbkę. Na koniec, po przygotowaniu próbek do spektrometrii mas zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom spektrometr masowy za pomocą CID i znormalizowanej energii zderzenia 35 pod automatyczną kontrolą, aby w sposób ciągły wykonywać jeden skan MS, a następnie jak najwięcej skanów MS-MS w tandemie w okresie trzech sekund. Ślad sensogramu BLI to odczyt w czasie rzeczywistym zmian amplitudy spowodowanych specyficznym dodatkiem składników toksyny wąglika.

Pierwszym wzniesieniem jest załadowanie LFn na końcówkę. Po wygaszeniu i linii bazowej, PA-prepor wiąże się z LFn, a następnie dodaje rozpuszczalny CMG2, w wyniku czego powstaje złożony kompleks preendosomalny. Kompleks jest następnie poddawany działaniu niskiego pH, które osłabia wiązanie receptorów i powoduje przejście preporu do jego rozszerzonego poru, potwierdzenia, które jest potwierdzone przez dodanie miceli.

Pokazano tutaj ujemne obrazy EM kompleksów po uwolnieniu z biosensora. Siatki próbek preendosomalnych wykazały gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LFn PA-prepore CMG2. Siatki kompleksów po zakwaszeniu pokazują, że PA przeszedł do porów i rozpuścił się przez inkluzję miceli bez oczywistej gęstości CMG2.

Jak zaobserwowano w przypadku stwardnienia rozsianego, które potwierdziło kompleksy białkowe, próbki przedendosomalne SM zawierały peptydy ze wszystkich trzech składników toksyn o pokryciu odpowiednio 60,46, 67,97 i 54,15% dla LFn, PA i CMG2. Próbki postendosomalne zawierały tylko peptydy z LFn i PA. Brak CMG2 jest zgodny z obserwowanym spadkiem nanometrów BLI podczas tworzenia porów. Możliwość monitorowania i walidacji składania dużych kompleksów makromolekularnych jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia specyfiki i funkcjonalności dużych zespołów biomolekularnych.

Nasza zdolność do uwalniania wstępnie zmontowanych kompleksów makromolekularnych z biosensorów do mikroobjętości w celu wizualizacji mikroskopii elektronowej będzie niezwykle przydatna do analizy struktury. W naszej analizie składu kompleksów składania biosensorów wykorzystaliśmy tylko 0,04 femtomoli kompleksu uwalniającego do identyfikacji jego składników przed i po asymilowanym zakwaszeniu endosomalnym. Protokół uwalniania zespołu biosensorów można dostosować tak, aby śledził naturalne, ale nieuchwytne endosomalne przejścia innych toksyn bakteryjnych w strukturach białek wirusowych wywołane przez pH, z dodatkową korzyścią w postaci uniknięcia agregacji białek.