Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie techniki wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłych ryb danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Wprowadzone mikrocząstki są dalej wizualizowane w układzie naczyniowym za pomocą prostej techniki obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Procedura ta może być stosowana na przykład do przeprowadzania powtarzających się pomiarów pH krwi ryb in vivo poprzez wprowadzenie mikrokapsułkowanych sond fluorescencyjnych do pomiaru pH.

W tym celu w pierwszym etapie wrażliwy na pH barwnik SNARF-1 sprzężony z dekstranem jest zamykany w półprzepuszczalnej powłoce polielektrolitowej przy użyciu podejścia warstwa po warstwie. Barwnik fluorescencyjny jest współwytrącany w porowate mikrordzenie węglanu wapnia, a rdzenie są pokryte wieloma warstwami przeciwnie naładowanych, nieulegających biodegradacji polimerów i pokryte biokompatybilnym polimerem zawierającym glikol polietylenowy. Następnie rdzenie z węglanu wapnia są rozpuszczane w celu uzyskania całych mikrokapsułek otaczających SNARF-1.

W drugim etapie znieczulenia i utrwalenia ryb przygotowane mikrokapsułki są wstrzykiwane bezpośrednio do nerki zwierzęcia w celu dostarczenia kapsułkowanego barwnika do układu krążenia ryb. Następnie potrzebna jest minimalna operacja, aby usunąć pokrywę skrzelową i obnażyć naczynia włosowate skrzeli ryb. Następnie wizualizację mikrokapsułek we krwi i rejestrację widma fluorescencyjnego można wykonać in vivo za pomocą mikroskopii przyżyciowej w celu monitorowania pH krwi.

Gdy iniekcja wykonana prawidłowo, można zaobserwować fluorescencyjne mikrokapsułki w skrzelach ryb bezpośrednio po zabiegu. Widmo kwitnienia zamkniętej sondy można rejestrować za pomocą spektrometru sprzężonego z mikroskopem fluorescencyjnym. SNARF-1 ma dwa piki emisji, a stosunek między dwiema długościami fali odpowiadającymi tym pikom można wykorzystać do pomiaru pH.

Proponowana procedura pozwala na dostarczenie mikrokapsułek fluorescencyjnych do układu krwionośnego ryb oraz zdalne monitorowanie fluorescencji krwi ryb in vivo. W przypadku badań fizjologicznych główną zaletą tej metody są powtarzalne pomiary parametrów krwi u małych zwierząt laboratoryjnych, które zazwyczaj są trudne do wykonania. W przypadku stosowania światłoczułej sondy fluorescencyjnej zaleca się wykonanie całej procedury w pomieszczeniu o ograniczonym oświetleniu.

Wymieszaj dwa mililitry roztworu wybranego barwnika fluorescencyjnego związanego z polimerem, SNARF-1-dextran, z 0,6 mililitra jednego molowego roztworu chlorku wapnia i 0,6 mililitra jednego molowego roztworu węglanu sodu pod szybkim mieszaniem. Na tym etapie syntetyzowane są porowate mikrordzenie węglanu wapnia otaczające barwnik fluorescencyjny. Po pięciu, 10 sekundach mieszania przenieś zawiesinę do dwóch mililitrowych mikroprobówek i wiruj przez 15 sekund, aby osadzać mikrordzenie węglanu wapnia.

Odrzuć supernatant, umyj rdzenie około dwoma mililitrami wody dejonizowanej i wstrząśnij zawiesiną. Powtórz procedurę wirowania i mycia trzy razy. Inkubować zawiesinę przez jedną minutę w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć agregację mikrordzeni.

Zawiesić mikrordzenie węglanu wapnia w około dwóch mililitrach roztworu kationowego polimeru WWA o stężeniu czterech mikrogramów na mililitr, aby osadzić pierwszą warstwę polimeru na matrycach. Trzymaj mikrordzenie w roztworze pH przez około pięć minut, ciągle wstrząsając. Po 15 sekundach wirowania odrzucić supernatant z niezwiązanym WWA i trzykrotnie przemyć mikrordzenie wodą przez wielokrotne odwirowanie i przemycie.

Powtórz tę samą procedurę z roztworem anionowego polimeru PSS w proporcji czterech miligramów na mililitr, aby nałożyć drugą warstwę polimeru na matryce. Tuż przed nałożeniem kolejnej warstwy zaleca się zastosowanie jednominutowej inkubacji w kąpieli ultradźwiękowej. Powtórz sekwencyjnie osadzanie polimerów kationowych i anionowych sześć razy, aby uzyskać 12-warstwową otoczkę mikrokapsułek.

Następnie inkubuj mikrordzenie z otoczkami w poli-L-lizynie szczepionej glikolem polietylenowym przez co najmniej dwie godziny. Następnie przemyj pokryte mikrordzenie raz wodą przez sekwencyjne wirowanie i ponowne zawieszenie. Na koniec rozpuść matryce węglanu wapnia w dwóch mililitrach 0,1-molowego roztworu EDTA, dostosowanego do pH około 7,1, aby uzyskać puste mikrokapsułki.

Odrzucić supernatant po 45-sekundowym odwirowaniu i powtórzyć płukanie EDTA dwukrotnie. Odrzuć supernatant po 45-sekundowym wirowaniu i dodaj dwa mililitry soli fizjologicznej. Powtórz etapy mycia wirowania solą fizjologiczną trzy razy.

Zbadaj rozkład wielkości i stężenie przygotowanych mikrokapsułek w hemocytometrze pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj oprogramowania ImageJ lub równoważnego oprogramowania do analizy wielkości cząstek. Otrzymaną sondę w obudowie należy przechowywać w ciemności.

Aby przygotować układ optyczny, należy umieścić wymagany zestaw filtrów fluorescencyjnych w mikroskopie fluorescencyjnym zgodnie z charakterystyką nałożonego barwnika fluorescencyjnego i włączyć lampę fluorescencyjną. Wyciągnij dźwignię do okularów. Podłącz światłowód z jednego końca do spektrometru, a z drugiego końca do kolimatora.

Za pomocą adapterów włącz kolimator w ogniskową tubusu kamery lub innym dostępnym porcie mikroskopu fluorescencyjnego. W celu kalibracji przygotowanych mikrokapsułek należy umieścić około pięciu mikrolitrów zawiesiny mikrokapsułek na szkiełku mikroskopowym i wysuszyć kroplę w ciemnym miejscu. Włącz spektrometr.

Uruchom program sterujący spektrometrem i przygotuj spektrometr do pomiarów. Aby skalibrować charakterystykę spektralną mikrokapsułkowanego SNARF-1, należy użyć serii o różnym pH. Upuść około 10 mikrolitrów buforu sodowego na wysuszone mikrokapsułki z SNARF-1 i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj mikrokapsułki przy powiększeniu około 400. Przekręć dźwignię mikroskopu do portu aparatu.

Zarejestruj fluorescencję za pomocą spektrometru. Upewnij się, że sygnał widmowy wykracza daleko poza poziom tła i obserwuj, że mikrokapsułki nie znajdują się w pęcherzyku. Unikaj długotrwałego oświetlenia tych samych mikrokapsułek, ponieważ SNARF-1 jest wrażliwy na fotowybielanie.

Przekręć dźwignię z powrotem do okularów. Obliczyć stosunek intensywności fluorescencji kapsułkowanego SNARF-1 przy długości fali odpowiadającej pikom emisji protonowanego i zdetonowanego barwnika. Zbuduj krzywą kalibracyjną zależności stosunku od pH pożywki.

Zbierz około 10 mikrolitrów krwi z ryb poddanych eutanazji. Określ jego pH za pomocą pH-metru za pomocą mikroelektrody. Następnie upuść krew na szkiełko z wysuszonymi mikrokapsułkami i zarejestruj stosunek intensywności fluorescencji zgodnie z opisem dla kalibracyjnych.

Ponieważ należy wziąć pod uwagę wpływ składników krwi na odczyt kapsułkowanego SNARF-1, należy dostosować współczynnik liniowy krzywej kalibracyjnej, aby krzywa odpowiadała pomiarom we krwi ryb. Aby przygotować igłę do wstrzykiwań, należy zwolnić stalową igłę z końcówki strzykawki insulinowej, usuwając plastik ostrym lancetem. Wbić igłę do połowy do szklanej mikrokapilary.

Szybko i delikatnie go za pomocą palnika gazowego. Podłącz szklaną mikrokapilę do mikrowtryskiwacza i przepłucz ją sterylną wodą trzy razy. Upewnij się, że płyn przepływa przez igłę.

Napełnij system wodą. Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. W dniu eksperymentu należy pobrać przygotowaną zawiesinę mikrokapsułek w sterylnym roztworze soli fizjologicznej zawierającą od połowy do sześciu milionów mikrokapsułek na mikrolitr.

Zawiesić go ponownie w kąpieli ultradźwiękowej na jedną minutę. Podczas następnego wstrzyknięcia należy okresowo wstrząsać fiolką, aby ponownie zawiesić mikrokapsułki i zapobiec ich agregacji. Za pomocą łyżki wyjmij rybę ze znieczulenia i delikatnie połóż ją na wilgotnej gąbce w pozycji bocznej z głową skierowaną w lewo, jeśli jesteś praworęczny lub w prawo, jeśli jesteś leworęczny.

Tuż przed iniekcją należy zassać od jednego do dwóch milimetrów powietrza do szklanej kapilary połączonej z mikrowtryskiwaczem. Następnie załaduj go około dwoma mikrolitrami zdyspergowanych mikrokapsułek. Delikatnie ustabilizuj ciało ryby na gąbce ręką niedominującą.

Znajdź linię boczną ryby. Umieść igłę jeden mililitr poniżej punktu środkowego brzusznego odcinka linii bocznej. Następnie, ruchem skrobania, odsuń rybią łuskę na bok i wykonaj nakłucie.

Włóż igłę do korpusu pod kątem 45 stopni do powierzchni stołu. Popchnij igłę w kierunku kręgosłupa, aż ostrożnie oprze się o kręgosłup. Następnie powoli uwolnij około jednego mikrolitra zawiesiny mikrokapsułki do nerki i powoli wyjmij igłę.

Opłukać rybę od głowy do ogona strumieniem wody, aby usunąć rozlane mikrokapsułki w miejscu wstrzyknięcia. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby i usunąć skrzela ryb. Opłucz skrzela wodą.

Za pomocą łyżki przenieś rybę na szkiełko mikroskopowe i umieść ją na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonując poniższe procedury, upewnij się, że skrzela ryb nie wysychają. Aby to zrobić, okresowo zwilżaj je wodą za pomocą pipety Pasteura.

Zaciemnij pomieszczenie i przy małym powiększeniu sprawdź skrzela, aby znaleźć fluorescencyjne mikrokapsułki. Gdy go znajdziesz, przełącz obiektyw na większą wielkość i umieść go w środku pola view. Przekręć dźwignię do portu z podłączonym spektrometrem.

Nagraj sygnał spektralny. Przekręć dźwignię z powrotem do okularów. Powtórz pomiary dla różnych mikrokapsułek kilka razy.

Przenieś rybę do akwarium z odpowiednim napowietrzeniem w celu regeneracji. Procedura pomiaru może być powtarzana dla jednej osoby kilka razy przy użyciu powtórnego znieczulenia lub innej metody utrwalenia. Rysunek przedstawia reprezentatywny przykład pomiarów in vivo krwi danio pręgowanego i hiperkapnii za pomocą kapsułkowanego barwnika fluorescencyjnego SNARF-1.

W warunkach kontrolnych pH krwi pozostaje stabilne przez cztery godziny po wstrzyknięciu mikrokapsułek, podczas gdy pięciominutowa ekspozycja na podwyższony dwutlenek węgla powoduje zakwaszenie krwi ryb. Podczas przeprowadzania zabiegu ważne jest, aby zminimalizować stres zwierząt spowodowany obchodzeniem się z nim i operacją. Przy odrobinie wprawy zarówno wstrzyknięcie, jak i rejestracja sygnału trwają średnio około dwóch, trzech minut, więc ten protokół pozwala na zakończenie manipulacji, zanim ryba obudzi się z łagodnego znieczulenia.

Podczas zabiegu upewnij się, że skrzela ryb są zawsze zwilżone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać prostą i skuteczną implantację mikrocząstek do układu krążenia małych ryb. Jak wykazano, technika ta jest bardzo wygodna w przypadku powtarzających się zapisów pH krwi in vivo u dorosłych danio pręgowanych przy użyciu mikrokapsułek wypełnionych sondą fluorescencyjną.