Name: Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj technikę iniekcji mikrocząstek do układu krążenia dorosłych ryb Danio rerio poprzez wstrzyknięcie do nerki. Metoda umożliwia wizualizację in vivo i powtarzalne pomiary pH krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy bardzo dziękują Bogdanowi Osadchiyowi i Evgenii Protasovowi (Irkucki Uniwersytet Państwowy, Rosja) w przygotowaniu protokołu wideo. Badania te były wspierane przez Rosyjską Fundację Naukową (#15-14-10008) i Rosyjską Fundację Badań Podstawowych (#15-29-01003).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/EU dotyczącą eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami Instytutu Biologii Uniwersytetu Państwowego w Irkucku.
1. Wytwarzanie mikrokapsułek
UWAGA: Mikrokapsułki zawierające barwnik fluorescencyjny są przygotowywane z wykorzystaniem montażu warstwa po warstwie przeciwstawnie naładowanych polielektrolitów7,8. Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Aby zsyntetyzować porowate mikroot rdzenie CaCO3 zamykające barwnik fluorescencyjny, wymieszać 2 mL roztworu SNARF-1-dekstranu (można użyć większości barwników fluorescencyjnych związanych z polimerem, np. FITC-BSA) o stężeniu ~2 mg/mL z 0,6 mL roztworów 1 mol/L CaCl2 oraz Na2CO3 przy szybkim mieszaniu. 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę na różną wrażliwość barwników fluorescencyjnych na fotowyblakanie; w przypadku użycia światłoczułej sondy fluorescencyjnej (takiej jak SNARF-1), manipulacje i przechowywanie mikrocząstek muszą być wykonywane przy jak najmniejszym oświetleniu.</li>
	<li>Po 5-10 s mieszania przenieść zawiesinę do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL i wirować przez 15 s przy 10 000-12 000 g, aby osadzić mikroot rdzenie CaCO3.</li>
	<li>Odlać nadsącz, przemyć rdzenie ~2 mL wody dejonizowanej i ponownie zawiesić osad poprzez wstrząsanie.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę wirowania i płukania łącznie trzy razy. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.</li>
	<li>Inkubować mikroot rdzenie przez 1 min w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację. 
	OSTROŻNIE: Nie zapomnieć o ochronie uszu za pomocą słuchawek.</li>
	<li>Aby nanieść pierwszą warstwę polimerową na matryce, ponownie zawiesić rdzenie w ~2 mL roztworu poli(chlorowodorku allyloaminy) (PAH) o stężeniu 4 mg/mL w 1 mol/L NaCl.
	<ol>
		<li>Pozostawić mikroot rdzenie w roztworze przez ~5 min przy stałym wstrząsaniu.</li>
		<li>Po 15 s wirowania odlać nadsącz z niezwiązanym PAH. Przemyć pokryte mikroot rdzenie wodą dejonizowaną co najmniej 3 razy poprzez wielokrotne etapy wirowania i płukania. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.</li>
		<li>Inkubować mikroot rdzenie przez 1 min w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację. 
		UWAGA: Jeśli zastosowany barwnik fluorescencyjny jest kationowy, należy zacząć od poli(4-styrenosulfonianu sodu) (PSS) w 1 mol/L NaCl (patrz krok 1.7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.6 z ~2 mL roztworu PSS o stężeniu 4 mg/mL (zawierającego również 1 mol/L NaCl), aby nanieść drugą warstwę polimerową na matryce.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 sześć razy, aby nanieść 12 warstw polimerowych. 
	UWAGA: Nie zaleca się robienia długich przerw (~12 h lub więcej) w procedurze, dopóki nie zostanie naniesionych ~3-5 warstw, ponieważ niepokryte mikroot rdzenie CaCO3 mogą mieć tendencję do rekrystalizacji. Należy zauważyć, że pokrycie PSS powoduje większą agregację mikroot rdzeni, a długa przerwa jest zalecana tylko wtedy, gdy zewnętrzną warstwą jest PAH lub poli-L-lizyna szczepiona glikolem polietylenowym (PLL-g-PEG).</li>
	<li>Inkubować pokryte mikroot rdzenie w 2 mg/mL PLL-g-PEG (~1 mL na mikroprobówkę) przez co najmniej 2 h.
	<ol>
		<li>Przemyć mikroot rdzenie wodą poprzez sekwencyjne etapy wirowania i ponownego zawieszania. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać puste mikrokapsułki, rozpuścić matryce CaCO3, dodając 2 mL roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu 0,1 mol/L (dostosowanego do pH 7,1 za pomocą NaOH) do pokrytych mikroot rdzeni.
	<ol>
		<li>Po ~5 min inkubacji wirować mikrokapsułki przez 45 s i odlać nadsącz z EDTA.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.10-1.10.1 dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć mikrokapsułki 0,9% NaCl trzy razy poprzez wielokrotne etapy wirowania (przez 45 s), a następnie etapy płukania. Po ostatnim etapie wirowania odlać nadsącz. 
	UWAGA: Końcowy roztwór mikrokapsułek do iniekcji musi być sterylny (np. poprzez dodanie ampicyliny, 0,1 mg/mL), a medium powinno być biokompatybilne z obiektem badania (medium izotoniczne o neutralnym pH).</li>
	<li>Oszacować stężenie przygotowanych mikrokapsułek w komorze licznikowej pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wykonać serię zdjęć mikrokapsułek, zmierzyć średnicę około stu mikrokapsułek przy użyciu programu ImageJ9 lub równoważnego oprogramowania i zbadać rozkład wielkości za pomocą histogramu.</li>
	<li>Przechowywać otrzymaną enkapsulowaną sondę w ciemności. 
	UWAGA: Po kilkukrotnym przemyciu w sterylny 0,9% NaCl mikrokapsułki można przechowywać przez miesiące w 4 °C. Nie zaleca się całkowitego wysuszenia mikrokapsułek podczas przechowywania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie układu optycznego i kalibracja mikrokapsułkowanego SNARF-1
Uwaga: Przybliżone pomiary pH z wykorzystaniem mikrokapsułkowanego SNARF-1 można przeprowadzić, używając obrazów z dwóch kanałów mikroskopu fluorescencyjnego7, jednak w niniejszym protokole zastosowano jednokanałowy mikroskop fluorescencyjny połączony ze spektrometrem światłowodowym.
<ol>
	<li>Zamontuj w mikroskopie fluorescencyjnym odpowiedni zestaw filtrów fluorescencyjnych, zgodnie z charakterystyką zastosowanego barwnika fluorescencyjnego, a następnie włącz lampę fluorescencyjną.
	<ol>
		<li>Odciągnij dźwignię w kierunku okularów. 
		UWAGA: Nadmierne światło może uszkodzić matrycę spektrometru. Należy zatem upewnić się, że dźwignia znajduje się w trybie „okular”, gdy spektrometr nie jest używany.</li>
		<li>Podłącz jeden koniec światłowodu do spektrometru, a drugi do kolimatora. Za pomocą adapterów umieść kolimator w ognisku tubusu kamery lub innym dostępnym porcie mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Włącz spektrometr. Uruchom program sterujący spektrometrem i przygotuj urządzenie do pomiarów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu kalibracji partii mikrokapsułek nanieś ~5 µL zawiesiny mikrokapsułek (~10 000 mikrokapsułek na µL w wodzie dejonizowanej) na szkiełko przedmiotowe i wysusz kroplę w ciemnym miejscu (np. w termostacie w temperaturze 35 °C).
	<ol>
		<li>Aby skalibrować charakterystykę spektralną zmikrokapsułkowanego SNARF-1, użyj serii buforów o różnych wartościach pH z zakresu ~6-9. Nanieś kroplę ~10 µL buforu na wysuszone mikrokapsułki z SNARF-1-dekstranem i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj mikrokapsułki, korzystając z obiektywu ×40.</li>
		<li>Przełącz dźwignię mikroskopu na port kamery. Zarejestruj ich fluorescencję za pomocą spektrometru. Przełącz dźwignię z powrotem na okulary. 
		UWAGA: Upewnij się, że sygnał spektralny znacznie przekracza poziom tła oraz że mikrokapsułki w polu widzenia nie znajdują się w pęcherzyku powietrza (w razie potrzeby przełączając na mniejsze powiększenie). Unikaj długotrwałego naświetlania tych samych mikrokapsułek. SNARF-1 jest podatny na fotoblaknięcie.</li>
		<li>Powtórz krok 2.2.3 dla różnych mikrokapsułek 10-15 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz stosunki maksimów fluorescencji (np. przy użyciu programu R lub Scilab) dla wszystkich zarejestrowanych widm i wyznacz linię regresji między stosunkiem mediany (dla każdego buforu) a pH ośrodka, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na obliczanie pH, równanie do wyznaczania pH przy użyciu stosunków absorbancji, do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: SNARF-1 posiada widmo z dwoma maksimami odpowiadającymi emisji barwnika w formie protonowanej i deprotonowanej, a stosunek między tymi maksimami zależy od pH ośrodka. W niniejszym badaniu zastosowano stosunek intensywności fluorescencji dla 605 i 660 nm. Długości fal te są dobierane w zależności od użytego zestawu filtrów. a i b to współczynniki wyznaczane metodą regresji nieliniowej (np. przy użyciu programu R). Wartości 0,15 i 1,1 to odpowiednio minimalna i maksymalna wartość I605/I660 zaobserwowana podczas kalibracji.</li>
	<li>Pobierz około 10 µL krwi ryb od ok. 5 dorosłych osobników. Umieść ryby w czarce Petriego z zawiesiną olejku goździkowego w wodzie o stężeniu 1 µL/mL w celu znieczulenia i poczekaj, aż zwierzę położy się na boku i przestanie reagować na uciśnięcia płetwy (zazwyczaj ~2-3 min). Przenieś rybę na szkiełko przedmiotowe. Odetnij ogon ryby lancetem i pobierz około 2 µL krwi z żyły ogonowej. 
	UWAGA: Aby zapobiec krzepnięciu krwi, potraktuj miejsce nacięcia heparyną (5000 U/mL) i używaj heparynowanych kapilar szklanych oraz probówek do mikrowirówek do pobierania krwi.
	<ol>
		<li>Nanieś pipetą około 10 µL krwi na końcówkę mikroelektrody i wyznacz pH za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Nanieś krew na szkiełko z wysuszonymi mikrokapsułkami i zarejestruj stosunek intensywności fluorescencji zgodnie z opisem dla buforów kalibracyjnych (kroki 2.2 - 2.3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj współczynnik liniowy krzywej kalibracyjnej tak, aby krzywa odpowiadała pomiarom wykonanym we krwi ryb (szczegóły patrz: Borvinskaya et al. 20175).</li>
</ol>
3. Przygotowanie do iniekcji
<ol>
	<li>Uwolnić stalową igłę z końcówki penu insulinowego (lub strzykawki), usuwając plastik za pomocą ostrego lancetu. 
	UWAGA: Do mikroiniekcji można przygotować dowolną cienką igłę (Ø0,33 mm lub mniejszą) lub kapilarę szklaną (zazwyczaj Ø1 mm)10,11.</li>
	<li>Wsunąć igłę do połowy do szklanej mikrokapiilary; szybko i ostrożnie przylutować ją za pomocą palnika gazowego.</li>
	<li>Podłączyć szklaną mikrokapilarę do mikroinjektora i przepłukać ją trzy razy sterylną wodą. Upewnić się, że ciecz przepływa przez igłę.</li>
	<li>Wypełnić układ wodą destylowaną. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
4. Iniekcja
<ol>
	<li>Resuspend przygotowaną zawiesinę mikrokapsułek (w sterylnym 0,9% NaCl lub innym medium używanym do iniekcji, o stężeniu od 0,5 do 6 milionów mikrokapsułek na mikrolitr), korzystając z kąpieli ultradźwiękowej przez 1 min. 
	UWAGA: Ponieważ mikrokapsułki mają tendencję do osiadania, podczas następnej iniekcji należy wstrząsać fiolką z mikrokapsułkami mechanicznie (za pomocą rotora) lub ręcznie co kilka minut, aby je resuspendować i zapobiec ich agregacji.</li>
	<li>Umieść rybę w szalce Petriego z anestetykiem (0,1 mL/L olejku goździkowego zawieszonego w wodzie) na ok. 2-3 min. Czekaj, aż ryba położy się na boku i przestanie reagować na lekkie uszczypnięcie płetwy.</li>
	<li>Używając łyżki, przenieś rybę z anestetyku i delikatnie połóż ją na wilgotnej gąbce w pozycji bocznej, głową skierowaną w lewo (dla osoby praworęcznej) lub w prawo (dla osoby leworęcznej).</li>
	<li>Tuż przed iniekcją nabierz 1-2 mm powietrza do kapilary szklanej połączonej z mikroinjektorem. Następnie nabierz do niej około 2 µL zdyspergowanych mikrokapsułek. 
	UWAGA: Przed iniekcją roztwór mikrokapsułek musi zostać dostosowany do temperatury, w której utrzymywane są ryby.</li>
	<li>Delikatnie ustabilizuj ciało ryby na gąbce niedominującą ręką.
	<ol>
		<li>Zlokalizuj linię boczną ryby. Wyznacz w myśli odcinek rozciągający się od pokrywy skrzelowej do końca jamy brzusznej. Znajdź środek tego odcinka. Umieść igłę 1 mm niżej w kierunku brzuchnym.</li>
		<li>Ruchom skrobiącym delikatnie odsuń łuski ryby i wykonaj nakłucie. Wprowadź igłę w ciało pod kątem 45° do powierzchni stołu.</li>
		<li>Wsuń igłę w kierunku kręgosłupa, aż ostrożnie go dotknie.</li>
		<li>Podaj około 1 µL zawiesiny mikrokapsułek do nerki i powoli wycofaj igłę. 
		UWAGA: Aby łatwiej znaleźć odpowiednie miejsce nakłucia, warto poćwiczyć lokalizację nerki tułowiałej poprzez prześwietlenie ryb światłem dolnym, jak pokazano na Rysunku 2A i 2B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłucz rybę od głowy do ogona strumieniem wody, aby usunąć wszelkie rozlane mikrokapsułki z miejsca iniekcji.</li>
</ol>
5. Wizualizacja in vivo
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek sekcyjnych należy usunąć pokrywę skrzelową z głowy ryby i odsłonić skrzela. Skrzela należy wypłukać wodą.</li>
	<li>Za pomocą łyżeczki przenieś rybę na szkiełko przedmiotowe, a następnie umieść je na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. 
	UWAGA: Należy dopilnować, aby skrzela ryby nie wyschły podczas kolejnych etapów procedury. Aby tego uniknąć, należy je okresowo nawilżać wodą za pomocą pipety Pasteura (mniej więcej co 1–2 min).</li>
	<li>Przyciemnij pomieszczenie i przy użyciu małego powiększenia (obiektyw x10) obejrzyj skrzela, aby zlokalizować fluorescencyjne mikrokapsułki. 
	UWAGA: W przypadku stosowania tej procedury w celu wprowadzenia cząstek fluorescencyjnych do układu krążenia ryb, zaleca się sprawdzenie skrzeli kilku osobników pod kątem obecności nieoczekiwanych cząstek fluorescencyjnych przed przystąpieniem do iniekcji. Skrzela zebrafish typu dzikiego nie wykazują autofluorescencji, jednak w niektórych przypadkach na skrzelach mogą wystąpić sporadyczne cząstki fluorescencyjne (takie jak fragmenty pokarmu lub symbionty jednokomórkowe). W razie potrzeby cząstki te można rozpoznać na podstawie ich specyficznego kształtu (na przykład fragmenty pokarmu mają nieregularny kształt, w przeciwieństwie do sferycznych mikrokapsułek) lub widma fluorescencji (t. j. kolor).
	<ol>
		<li>Przełącz obiektyw na większe powiększenie (obiektyw ×40) i ustaw mikrokapsułkę lub grupę mikrokapsułek w centrum pola widzenia.</li>
		<li>Przełącz dźwignię na port, do którego podłączony jest spektrometr. Zarejestruj sygnał widmowy.</li>
		<li>Przesuń dźwignię z powrotem w stronę okularu.</li>
		<li>Powtórz pomiary dla różnych mikrokapsułek kilkukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś ryby do akwarium z odpowiednim napowietrzaniem w celu rekonwalescencji. 
	UWAGA: Przy minimalnej wprawie możliwe jest przeprowadzenie iniekcji i rejestracji sygnału w tempie około 2–3 min na rybę. Pomiar u jednego osobnika można powtórzyć kilka razy, stosując wielokrotne niskie, nieszkodliwe dawki anestetyku lub inną metodę unieruchomienia. Do obserwacji długoterminowych należy użyć systemu z ciągłą anestezją.12.</li>
</ol>

<ol><li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li>
<li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427(2016).</li>
<li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li>
<li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).</li>
<li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/jm/b705419j#!divAbstract">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li>
<li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210020">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+-+Version+1.44%22">ImageJ User Guide - Version 1.44</a>. , 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ">imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ </a> (2012).</li>
<li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960(2008).</li>
<li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+renal+pathology%3A+Emerging+models+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li>
<li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092777570300195X">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li>
<li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl0259333">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li>
<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zademonstrować wstrzykiwanie mikrocząstek do nerki danio pręgowanego, użyliśmy półprzepuszczalnych mikrokapsułek wypełnionych barwnikiem wskaźnikowym. W związku z tym protokół zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania mikrokapsułek przy użyciu montażu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów 7,8,15,16,17,18 (<sup class="xref"...

Podawanie mikrocząsteczek do organizmu zwierzęcego jest ważnym zadaniem w takich dziedzinach jak dostarczanie leków i szczepionek1, wizualizacja naczyń krwionośnych2, implantacja komórek transgenicznych3, oraz implantacja małego czujnika optycznego4,5. Jednak procedura implantacji mikrocząstek do układu naczyniowego małych zwierząt laboratoryjnych jest trudna, szczególnie w przypadku delikatnych organizmów wodnych. W przypadku popularnych okazów badawczych, takich jak danio pręgowany, zaleca się wyjaśnienie tych procedur za pomocą protokołów wideo.
Mikroiniekcje dosercowe i kapilarne wymagają przeszkolonego personelu i unikalnego zaplecza mikrochirurgicznego do dostarczania mikroobiektów do krwi danio pręgowanego. Wcześniej, manualne wstrzykiwanie po orbicie po orbicie3 było sugerowane jako łatwa i skuteczna metoda podawania całych komórek. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że ze względu na mały obszar sieci naczyń włosowatych oka, osiągnięcie pożądanego rezultatu tej techniki wymaga dużo praktyki.
Tutaj opisujemy metodę solidnego i skutecznego wszczepiania mikrocząsteczek do układu krążenia poprzez ręczne wstrzykiwanie bezpośrednio do tkanki nerkowej dorosłego danio pręgowanego, która jest bogata w naczynia włosowate i nerkowe. Technika ta opiera się na protokole wideo do przeszczepu komórek do nerki danio pręgowanego6, ale traumatyczne i czasochłonne etapy mikrochirurgiczne zostały wyeliminowane. Proponowana metoda charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% skuteczności), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu.
Ważną częścią proponowanego protokołu jest wizualizacja wszczepionych mikrocząsteczek (jeśli są fluorescencyjne lub kolorowe) w naczyniach włosowatych skrzelowych, co pozwala na weryfikację jakości iniekcji, przybliżoną względną ocenę liczby wstrzykniętych cząstek, oraz wykrywanie sygnału spektralnego do pomiarów fizjologicznych bezpośrednio z krążącej krwi. Jako przykład możliwych zastosowań opisanej techniki przedstawiamy protokół pomiarów in vivo pH krwi danio pręgowanego za pomocą mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, pierwotnie zasugerowanej w Borvinskaya i wsp. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td> Sonda fluorescencyjna <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>. Jako wypełniacz mikrokapsułek można użyć dowolnego innego odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego związanego z polimerem</td></tr><tr><td>Koniugat izotiocyjanianu albuminy-fluoresceiny (FITC-BSA)</td> <td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Sonda fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian rodaminy B (RITC-dektran)</td> <td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Sonda fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Tworzenie</td></tr> <tr><td>szablonów CaCO3Węglan sodu</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3 tworzenie matryc</td></tr><tr><td>Poli(chlorowodorek alliloaminy), MW 50000 (WWA)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>polimer kationowy</td></tr><tr><td>Poli(4-styrenosulfonian sodu), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionowy polimer</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna [20 kDa] szczepiony glikolem polietylenowym [5 kDa], g = 3,0 do 4,5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Końcowy</td> <td>polimer zwiększający biokompatybilność mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Do rozpuszczania zastosowanych polimerów</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Do przygotowania wody dejonizowanej</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Stegler</td><td></td><td>Do tworzenia</td></tr> <tr><td>szablonów CaCO3Eppendorf&nbsp; Badania&nbsp; plus pipeta, 1000 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Rozwiązania dozujące</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Badania&nbsp; plus pipeta, 10 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Rozwiązania dozujące</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, zakres objętości od 200 do 1000 i mikro; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Roztwory dozujące</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, zakres objętości 0,1-10&nbsp; &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Roztwory dozujące</td></tr><tr><td>Miniwirówka Microspin 12, szybkoobrotowa</td><td>BioSan</td><td></td><td>Do procedury wirowania i mycia mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Synteza i przechowywanie mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Sp. z o.o.</td><td></td><td>Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Myjka</td><td></td><td></td> ultradźwiękowa <td>Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Słuchawki&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do ochrony uszu przed ultradźwiękami</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>Do rozpuszczania matryc CaCO3</td></tr><tr><td>Fosforan sodowy</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Przygotowanie pH Fosforan</td></tr><tr><td>disodowy</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Przygotowanie pH</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>Do regulacji pH roztworu EDTA i</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> termostatyczna <td>Do suszenia mikrokapsułek na szkiełku Komora</td></tr><tr><td>do zliczania krwinek Hemocytometr Badanie</td><td></td><td></td><td>rozkładu wielkości i stężenia przygotowanych mikrokapsułek</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>Wizualizacja in vivo mikrokapsułek we krwi ryb</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych do SNARF-1 (należy dobrać w zależności od modelu mikroskopu; przykład jest podany)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Wizualizacja mikrokapsułek z sondami fluorescencyjnymi</td></tr><tr><td>Spektrometr światłowodowy QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Światłowód QP400-2-VIS NIR, 400 &mu; m, 2 m</td><td>Optyka oceaniczna</td><td></td><td>Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu</td></tr><tr><td>Kolimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Mikrokapilary szklane Intra MARK, 10 &micro; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Do pobierania krwi ryb</td></tr><tr><td>Olejek goździkowy</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Lancet do znieczulenia ryb</td></tr><tr><td>Lancet nr 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>Aby przeciąć rybi ogon i zwolnić stalową igłę z końcówki automatycznego wstrzykiwacza insuliny</td></tr><tr><td>Heparyna, 5000 U/ml</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Do leczenia wszystkich powierzchni, które mają kontakt z krwią ryb podczas pobierania krwi ryb</td></tr><tr><td>PH-metr Seven 2 Go Pro z mikroelektrodą</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Aby określić pH krwi ryb</td></tr><tr><td>Igły do wstrzykiwacza insuliny Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Do zabiegu iniekcyjnego. Każda cienka igła (&Oslash; 0,33 mm lub mniej) jest odpowiednia</td></tr><tr><td>Kapilary szklane, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>Do procedury iniekcyjnej</td></tr><tr><td>Palnik</td><td></td><td></td> gazowy <td>Do stalowej igły do szklanej kapilary</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Do precyzyjnego dozowania zawiesiny mikrokapsułek</td></tr> szalki <tr><td>Petriego, 60 mm x 15 mm, polistyren</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Do manipulacji rybami pod narkozą</td></tr><tr><td>Łyżka</td><td></td><td></td> <td>plastikowaDo manipulacji rybami pod narkozą</td></tr><tr><td>Wilgotna gąbka</td><td></td><td></td><td>Do manipulacji rybami pod narkozą</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, 3,5 ml</td><td>MARKI</td><td>Z331767</td><td>Do nawilżania skrzeli ryb</td></tr></tbody></table>

proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Systemowe podawanie mikrocząsteczek do żywego organizmu może być stosowane do wizualizacji naczyń krwionośnych, dostarczania leków i szczepionek, implantacji komórek transgenicznych i maleńkich czujników optycznych. Jednak mikroiniekcje dożylne małym zwierzętom, które są najczęściej stosowane w laboratoriach biologicznych i weterynaryjnych, są bardzo trudne i wymagają przeszkolonego personelu. W niniejszym artykule przedstawiamy solidną i skuteczną metodę wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Aby uwidocznić wprowadzone mikrocząstki do układu krwionośnego, proponujemy prostą technikę obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Monitorowanie in vivo pH krwi danio pręgowanego przeprowadzono za pomocą wstrzykiwanej mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, aby zademonstrować jedno z możliwych zastosowań opisanej techniki. W artykule przedstawiono szczegółowy opis enkapsulacji barwnika wrażliwego na pH oraz przedstawiono zasady szybkiego wstrzykiwania i wizualizacji otrzymanych mikrokapsułek w celu rejestracji sygnału fluorescencyjnego in vivo. Proponowana metoda iniekcji charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% sukcesu), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu. Wszystkie opisane zabiegi można wykonywać na innych małych gatunkach ryb, takich jak gupiki i medaka.

Uzyskane wyniki pochodzą z jednej z trzech głównych kategorii przedstawionego protokołu: tworzenia fluorescencyjnych mikrocząsteczek poprzez enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (Rysunek 1), wstrzykiwania mikrokapsułek do nerki z późniejszą wizualizacją w kapilarach skrzelowych (Rysunek 2  i 3) oraz, na koniec, rejestracji spektralnej fluorescencji SNARF-1 in vivo w celu monitorowania...

Ten artykuł demonstruje zasady szybkiego, minimalnie inwazyjnego wstrzykiwania mikrocząsteczek fluorescencyjnych do układu krążenia małych ryb oraz wizualizacji in vivo mikrocząsteczek we krwi ryb.

Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie techniki wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłych ryb danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Wprowadzone mikrocząstki są dalej wizualizowane w układzie naczyniowym za pomocą prostej techniki obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Procedura ta może być stosowana na przykład do przeprowadzania powtarzających się pomiarów pH krwi ryb in vivo poprzez wprowadzenie mikrokapsułkowanych sond fluorescencyjnych do pomiaru pH.W tym celu w pierwszym etapie wrażliwy na pH barwnik SNARF-1 sprzężony z dekstranem jest zamykany w półprzepuszczalnej powłoce polielektrolitowej przy użyciu podejścia warstwa po warstwie. Barwnik fluorescencyjny jest współwytrącany w porowate mikrordzenie węglanu wapnia, a rdzenie są pokryte wieloma warstwami przeciwnie naładowanych, nieulegających biodegradacji polimerów i pokryte biokompatybilnym polimerem zawierającym glikol polietylenowy. Następnie rdzenie z węglanu wapnia są rozpuszczane w celu uzyskania całych mikrokapsułek otaczających SNARF-1.W drugim etapie znieczulenia i utrwalenia ryb przygotowane mikrokapsułki są wstrzykiwane bezpośrednio do nerki zwierzęcia w celu dostarczen

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Ten film demonstruje dożylne wstrzykiwanie nefrotoksyn do żyły ogonowej zarodka danio pręgowanego w celu zbadania ich chemicznego wpływu na czynność nerek.

Dożylne mikrowstrzyknięcie nefrotoksyn do zarodka danio pręgowanego: technika dostarczania środków nefrotoksycznych do krwiobiegu zarodka danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Prezentujemy użycie mikroskopii 2-fotonowej do umieszczenia mikropipety w przestrzeni moczowej Bowmana u myszy, łącząc 2 podstawowe techniki fizjologii nerek. Zastosowanie mikroskopii 2-fotonowej pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia konwencjonalnej mikroskopii w badaniach fizjologii nerek z mikronakłuciem.

Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową

Ta metoda polega na wstrzyknięciu 0,5−3 μL roztworu do klatki piersiowej dorosłego danio pręgowanego. Procedura skutecznie dostarcza białka i związki chemiczne w pobliże serca danio pręgowanego, nie uszkadzając przy tym narządu. Podejście to nadaje się do badania wpływu czynników egzogennych na różne tkanki serca.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej w celu zbadania serca dorosłego danio pręgowanego

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Poznaj technikę iniekcji mikrocząstek do układu krążenia dorosłych ryb Danio rerio poprzez wstrzyknięcie do nerki. Metoda umożliwia wizualizację in vivo i powtarzalne pomiary pH krwi.

Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Przeglądaj więcej filmów