Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Ogólnym celem tej metodologii jest ułatwienie i zwiększenie dokładności mikroiniekcji larw ryb zerbrafish. Metoda ta pomaga naukowcom wykorzystującym systemy modelowe danio pręgowanego do unieruchamiania larw danio pręgowanego w określonych orientacjach w dużych układach. Technika ta pozwala na łatwiejszy dostęp do określonych tkanek w celu mikroiniekcji i obrazowania i jest bardzo skuteczna, gdy do zastosowań takich jak infekcje lub modele raka ksenoprzeszczepu wymagana jest duża liczba larw.

Moje strategie wytwarzania w modelach danio pręgowanego są wysoce komplementarne. Jedna z nich jest stworzona przez człowieka i prosta. Drugi jest żywy i złożony.

Oba mają tę samą skalę rozmiarów. Oba są przezroczyste. Oba umożliwiają obserwacje w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Jak pokazujesz tutaj, można je łatwo łączyć i mogą mieć zastosowanie w badaniach nad praktycznie każdą poważną chorobą. Po przygotowaniu bloku PDMS na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą E-3, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć pipety transferowej, aby przenieść wymaganą liczbę zarodków na powierzchnię bloku PDMS. Za pomocą pętli do włosów lub podobnego narzędzia wepchnij zarodki w wgłębienia mikrostruktury, szczególnie w orientacji grzbietowej i brzusznej.

Podczas ładowania larw do wgłębień ważne jest, aby mieć wystarczającą ilość wody pokrywającą blok PDMS, aby umożliwić łatwą manipulację. Ważne jest również, aby wepchnąć je do wgłębień, aby pozostały na miejscu podczas wstrzyknięcia. Aby zorientować danio pręgowanego na kanałach mikrostrukturalnych przygotowanych wcześniej zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć pipety transferowej w celu pobrania E-3 z wzorzystego bloku PDMS.

Poziom E-3 powinien spaść poniżej krawędzi bloku, ale nadal być obecny w zbiorniku i kanałach, a na PDMS pozostaje cienka warstwa. Za pomocą pipety transferowej przenieś 10 znieczulonych zarodków do zbiornika, uważając, aby nie przelać krawędzi. Za pomocą pętli do włosów manipuluj każdym zarodkiem w główce lejka, najpierw przy wejściu do odpowiedniego kanału, upewniając się, że zarodek ma odpowiednią orientację, gdy wchodzi do kanału.

Następnie użyj pętli do włosów, aby przesunąć każdy zarodek w dół kanału, aż dotrze do orientujących mikroelementów w ściankach kanału, które utrzymują go na miejscu. Po przygotowaniu igieł do mikroiniekcji i roztworu do mikroiniekcji, za pomocą drobno zwężającej się końcówki pipety należy wprowadzić do igły pięć mikrolitrów roztworu. Zamontuj igłę w mikromanipulatorze zamontowanym na podstawce magnetycznej i podłącz ją do mikrowtryskiwacza z pompką PICO.

Następnie za pomocą kleszczy złamij końcówkę igły pod kątem 45 stopni, ściskając stożkową końcówkę. Dostosuj wielkość bolusa iniekcyjnego do jednego nanolitra, regulując czas wstrzykiwania na sterowniku pompy PICO. Wyreguluj kąt igły do mikroiniekcji na kontrolerze mikromanipulacji, zaczynając od 45 stopni, z igłą równoległą do długości zarodka.

Można zastosować bardziej stromy kąt, aby zminimalizować boczny ruch zarodka podczas mikroiniekcji. Kontrolując szalkę Petriego lewą ręką, a potrzebną mikromanipulatorkę prawą, przyłóż igłę jak najbliżej zamierzonego miejsca mikroiniekcji, takiego jak pęcherzyk uszny. Za pomocą kontrolera mikromanipulacji włóż igłę do tkanki docelowej i użyj przełącznika nożnego pompy PICO, aby wstrzyknąć ustawioną objętość.

Jeśli tkanka opiera się penetracji, delikatnie dotknij pokrętła kontrolera mikromanipulacji. Aby uwolnić zarodki, użyj pipety transferowej, aby przepłynąć E-3 po powierzchni od góry do dołu lub obracając naczynie tak, aby zarodki zostały uwolnione do otaczającego E-3. Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego E-3 bez MS-222.

Aby przebadać zarodki za pomocą urządzenia PDMS w dołkach sześciodołkowej płytki, użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów lub pipety transferowej z wąską końcówką, aby zalać urządzenie poprzez przepuszczenie E-3 przez port. Użyj E-3 i MS-222, aby napełnić studnię, aż urządzenie zostanie zakryte. Następnie za pomocą pipety transferowej należy wprowadzić do każdej studzienki cztery wcześniej wstrzyknięte zarodki.

Za pomocą pętli do włosów lub podobnego narzędzia umieść zarodki przy wejściach kanałów obrazowania w pożądanej orientacji i częściowo wepchnij je do urządzenia. Pomoże to równomiernie wciągnąć je do urządzenia. Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów lub pipety transferowej, przeciągnij E-3 przez urządzenie z portu, aż zarodki zostaną wciągnięte do kanałów w odpowiedniej orientacji do obrazowania.

Przenieść płytkę studzienkową do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Aby zobrazować zarodki, dostosuj powiększenie, wybierając odpowiednią soczewkę, taką jak 10x do obrazowania migracji danio pręgowanego neturaohil. Dostosuj intensywność źródła światła i czas ekspozycji dla każdego kanału, tak aby każdy sygnał był wyraźny, ale nie nasycony.

Na koniec uchwyć obrazy dla każdego kanału fluorescencyjnego i transmitowanego. Za pomocą urządzenia do kanałów mikrostrukturalnych do stabilizacji zarodków w orientacji bocznej przetestowano zdolność neutrofili do reagowania na standardowe chemoatraktanty fMLP i LTB4 mikrowstrzykiwane do pęcherzyków usznych, dwa dni po zapłodnieniu zarodki danio pręgowanego. Aby zobrazować rekrutację neutrofili, prześledzono iniekcje z doddhaminą rodaminy o wysokiej masie cząsteczkowej i wykonano w transgenicznych zarodkach z zielonymi fluorescencyjnymi neutrofilami.

Zarodki, którym nie wstrzyknięto ani zarodków, którym wstrzyknięto samą rodaminę, wykorzystano jako kontrolę ujemną. Po mikroiniekcji zarodki przeniesiono do urządzenia do kanału obrazowania i zobrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego EVOS po 30 minutach i pięciu godzinach od wstrzyknięcia. Zgodnie z oczekiwaniami, niewielka liczba fluorescencyjnych neutrofili została zrekrutowana do pozorowanego wstrzykniętego pęcherzyka usznego we wczesnym okresie czasu, prawdopodobnie z powodu uszkodzonej rekrutacji za pośrednictwem mediacji.

Co ciekawe, zaobserwowano, że znacznik dekstranu rodaminy gromadzi się w otolitach podczas eksperymentu. W przypadku obu chemoatraktantów neutrofile były rekrutowane w większej liczbie, szczególnie w odpowiedzi na LTB4. Po opanowaniu technika ta może znacznie poprawić szybkość i dokładność mikroiniekcji danio pręgowanego.

Rozwój tej techniki był napędzany przez konkretne wyzwania stojące przed naszym laboratorium. Udoskonaliliśmy to podejście, aby dopasować je do potrzeb naszych projektów dotyczących infekcji grzybiczych i ksenoprzeszczepów nowotworowych w modelach danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikrostrukturalnych układów powierzchniowych do mikroiniekcji danio pręgowanego i do rozszerzonego obrazowania na żywo.