Name: Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrostrukturalnych urządzeń do stabilizacji i obrazowania. Technika umożliwia precyzyjne ukierunkowanie tkanek w badaniach nad rozwojem i neurobiologią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Davidowi Langenau za hojne udostępnienie miejsca w akwarium; Ericowi Stone'owi, Johnowi C. Moore'owi i Qin Tangowi za pomoc w konserwacji danio pręgowanego i odczynnikach, a Anne Robertson i Elliottowi Hagedornowi z laboratorium Leonarda Zona za pozyskanie użytego tu szczepu danio pręgowanego. Chcieliby również podziękować Octavio Hurtado za porady dotyczące technik fotolitograficznych. FE zostało sfinansowane przez Fellowships ze Szpitala Dziecięcego Shriner's Hospital for Children i American Australian Association. Praca ta została sfinansowana z grantu NIH GM92804.

Mikroiniekcja larw została zatwierdzona przez Podkomitet Szpitala Ogólnego Massachusetts ds. Badań nad Zwierzętami na mocy Protokołu 2011N000127.
1. Produkcja urządzeń
UWAGA: Wszystkie pliki CAD używane do projektowania opisywanych tutaj masek fotolitografii (Rysunek 1) są dostępne do pobrania. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać linki.
<ol>
	<li>Wyprodukuj płytkę wzorcową w pomieszczeniu czystym klasy 1,000 przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych7. W przypadku układów i kanałów mikrostrukturalnych należy sekwencyjnie ułożyć neozystor na bazie żywicy epoksydowej w 3 warstwach za pomocą 3 oddzielnych masek, zgodnie z instrukcjami producenta: 100 μm dla elementów płytkich, 200 μm dla cech średnich i 400 μm dla cech głębokich. W przypadku urządzenia do obrazowania ułóż dwie warstwy, używając 400 μm dla płytkich elementów i 600 μm dla głębokich elementów.</li>
	<li>Przyklej gotową płytkę do podstawy 15 cm szalki Petriego w celu odlewania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrostrukturalnych tablic powierzchniowych - PDMS
<ol>
	<li>Aby wykonać urządzenia użytkowe, odlew polidimetylosiloksan (PDMS), używając płytki głównej jako formy. Połączyć 50 g monomeru PDMS z 5 g inicjatora i dokładnie wymieszać w plastikowym naczyniu wagowym z plastikowym widelcem.</li>
	<li>Ostrożnie wylej mieszaninę na formę.</li>
	<li>Odgazowuje w eksykatorze próżniowym przy 16-25 inHg (54-85 kPa) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Aby utwardzić PDMS, piecz w temperaturze 65 °C przez co najmniej 3 godziny. PDMS powinien utwardzić się do twardego, ale elastycznego ciała stałego.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć urządzenie na płytce wzorcowej za pomocą skalpela, upewniając się, że końcówka skalpela styka się z powierzchnią płytki. Za pomocą kleszczy oderwij replikę PDMS od płytki i przenieś na czystą 10-centymetrową szalkę Petriego, stroną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Potraktuj urządzenie plazmą tlenową za pomocą pieca plazmowego przez 35 sekund, aby zmniejszyć hydrofobowość.</li>
	<li>Przykryć pożywką dla zarodków danio pręgowanego (E3) zawierającą 168 mg/l metanosulfonianu etylu (MS-222, pH 7,5). Usuń wszelkie pęcherzyki z głębszych elementów, spływając wodą po powierzchni urządzenia za pomocą pipety transferowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikrostrukturalnych tablic powierzchniowych - Agaroza
<ol>
	<li>Aby wykonać ujemną formę PDMS, najpierw potraktuj urządzenie PDMS plazmą tlenową.</li>
	<li>Potraktuj urządzenie PDMS oparami silanu 1 H,1 H,2 H-perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS), aby stworzyć obojętną powierzchnię8. Krótko:
	<ol>
		<li>Umieść PDMS, który ma być poddany obróbce, stroną do góry w komorze próżniowej w dygestorium.</li>
		<li>Obok PDMS umieść małe otwarte szklane lub aluminiowe naczynie i ostrożnie odpipetuj 200 μl PFDTS (98% silanu) do naczynia. 
		Uwaga: Silan PFDTS jest bardzo lotny, gwałtownie reaguje z wodą, jest łatwopalny i powoduje poważne uszkodzenia skóry i oczu w kontakcie. Przeczytaj szczegółowo kartę charakterystyki przed użyciem.</li>
		<li>Zamknij komorę próżniową i stosuj próżnię przez 15-30 minut lub do momentu całkowitego odparowania silanu PFDTS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść urządzenie na szalce Petriego i użyj jako formy do świeżego PDMS, przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 2.1-2.3.</li>
	<li>Piec w temperaturze 65 °C przez co najmniej 3 godziny, następnie obrać całą warstwę świeżego PDMS z poddanego działaniu urządzenia i umieścić na świeżej szalce Petriego. Można to następnie wykorzystać jako formę ujemną do odlewania agarozy.</li>
	<li>Aby przygotować agarozę, gotuj 2% roztwór agarozy o niskiej temperaturze żelowania w E3 w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Wlej gorącą agarozę na ujemną formę PDMS i usuń wszelkie pęcherzyki z agarozy pokrywającej urządzenie, przelewając gorącą agarozę na elementy za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Po usunięciu pęcherzyków wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C, aby agaroza stężyła.</li>
	<li>Usuń blok agarozy z ujemnej formy PDMS, ręcznie odkształcając PDMS od spodu, przenieś blok agarozy na nową szalkę Petriego i zwilż E3 zawierającym MS-222.</li>
</ol>
4. Przygotowanie urządzeń do obrazowania PDMS
<ol>
	<li>Aby wykonać użyteczne urządzenia, odlew PDMS, używając płytki wzorcowej jako formy. Połączyć 50 g monomeru PDMS z 5 g inicjatora (takiego samego, jak użyto w kroku 2.1) i dokładnie wymieszać plastikowym widelcem w plastikowym naczyniu wagowym.</li>
	<li>Ostrożnie wylej mieszaninę na formę.</li>
	<li>Odgazowuje w eksykatorze próżniowym przy 16-25 inHg (54-85 kPa) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Aby utwardzić PDMS, piecz w temperaturze 65 °C przez co najmniej 3 godziny. PDMS powinien utwardzić się do twardego, ale elastycznego ciała stałego.</li>
	<li>Wytnij urządzenia z płytki głównej i wybij porty za pomocą dziurkacza 1,5 mm.</li>
	<li>Traktować urządzenia i 6-dołkową płytkę ze szklanym dnem plazmą tlenową przez 35 s, jak opisano w kroku 2.6.</li>
	<li>Przymocować jedno urządzenie stroną do dołu do każdego szklanego szkiełka nakrywkowego płytki 6-dołkowej, umieszczając je na płycie grzejnej o temperaturze 85 °C na 10 minut 
	UWAGA: Aby potwierdzić pomyślne połączenie, mocno dociśnij jedną stronę klejonego urządzenia za pomocą kleszczy. Urządzenie powinno pozostać przymocowane do szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
</ol>
5. Hodowla danio pręgowanego
<ol>
	<li>Hodowla zarodków danio pręgowanego do 2 dpf przy użyciu standardowych technik3.</li>
	<li>Dekorionate zarodki za pomocą kleszczy lub mieszanki proteaz 1 mg/ml (patrz Tabela Materiałów)3 co najmniej 30-60 minut przed załadowaniem do urządzenia, aby umożliwić im wyprostowanie się.</li>
	<li>Znieczulić zarodki za pomocą (168 mg/l) MS-222 (pH 7,5), dodając 1 ml 25-krotnego roztworu podstawowego do E3 na szalce Petriego.</li>
</ol>
6. Orientacja danio pręgowanego na powierzchni mikrostrukturalnej - tablice divot
<ol>
	<li>Przygotuj blok PDMS z kroku 2.7 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) na szalce Petriego tak, aby był pokryty cienką (1-2 mm) warstwą E3, co pozwala na łatwiejszą manipulację zarodkami.</li>
	<li>Przenieś wymaganą liczbę zarodków (zwykle 10-20 na warunek) na powierzchnię bloku PDMS za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do mikromanipulacji (pętla do włosów lub podobne) wepchnij zarodki do mikrostrukturalnych wgłębień (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A). Stosowanie divotów jest szczególnie przydatne w orientacji grzbietowej i brzusznej. 
	UWAGA: W przypadku wgłębień o ciaśniejszym dopasowaniu (grzbietowym i brzusznym) spróbuj ustawić zarodki na powierzchni bloku równolegle do wgłębienia, a następnie zwinąć je na miejsce za pomocą pętli do włosów. Wepchnięcie ich głębiej w divot pomoże utrzymać je stabilnie.</li>
</ol>
7. Orientacja danio pręgowanego na powierzchni mikrostrukturalnej - kanały mikrostrukturalne
<ol>
	<li>Pobrać E3 z bloku PDMS z mikrostrukturalnymi kanałami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B) za pomocą pipety transferowej, aż poziom E3 spadnie poniżej krawędzi bloku, ale nadal będzie obecny w zbiorniku i kanałach oraz w cienkiej warstwie na PDMS.</li>
	<li>Przenieś 10 zarodków z kroku 5.3 do zbiornika za pomocą pipety transferowej, uważając, aby nie przelać krawędzi.</li>
	<li>Za pomocą pętli do włosów manipuluj każdym zarodkiem do lejka przy wejściu do odpowiedniego kanału i ustaw go tak, aby głowa zarodka była skierowana w stronę kanału, a zarodek miał odpowiednią orientację, gdy wchodzi do kanału.</li>
	<li>Przesuń każdy zarodek w dół kanału za pomocą pętli włosowej, aż dotrze do orientujących mikroelementów w ściankach kanału, które pomagają utrzymać go na miejscu. Stosowanie kanałów mikrostrukturalnych jest szczególnie zalecane w orientacji bocznej. 
	UWAGA: Aby zmniejszyć przesuwanie się zarodka podczas mikroiniekcji, spróbuj wyregulować napięcie powierzchniowe, pobierając E3 ze zbiornika.</li>
</ol>
8. Mikroiniekcja danio pręgowanego
<ol>
	<li>Przygotować igłę do mikroiniekcji.
	<ol>
		<li>Wykonaj igły mikrokapilarne ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet, jak opisano wcześniej4. Powstałe igły powinny być zwężone do jednego punktu na jednym końcu, ze stożkiem o długości około 10 mm.</li>
		<li>Przygotować roztwór do wstrzyknięcia, w tym przypadku 100 nM chemoatraktantu (N-formylometionina-leucylo-fenyloalanina (fMLP) lub leukotrien B4 (LTB4)) i 100 nM znacznika dekstranu rodaminy o stężeniu 70 kDa w PBS.</li>
		<li>Umieścić 5 μl roztworu na igle za pomocą drobno zwężającej się końcówki pipety (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zamontuj igłę w mikromanipulatorze zamontowanym na podstawce magnetycznej i podłączonym do mikrowtryskiwacza picopump.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złam końcówkę igły pod kątem 45 °, ściskając stożkową końcówkę kleszczami.</li>
	<li>Dostosować wielkość bolusa iniekcyjnego do 1 nL, regulując czas wstrzykiwania na sterowniku picopump.</li>
	<li>Wyregulować kąt igły do mikroiniekcji. Kąt igły wynoszący 45 ° na kontrolerze mikromanipulacji jest na ogół dobrym punktem wyjścia, z igłą równoległą do długości zarodka. Można zastosować bardziej stromy kąt, aby zminimalizować boczny ruch zarodka podczas mikroiniekcji.</li>
	<li>Sterując szalką Petriego lewą ręką i mikromanipulatorem igłowym prawą, przysunąć igłę jak najbliżej zamierzonego miejsca mikroiniekcji, w tym przypadku pęcherzyka usznego. 
	UWAGA: Pęcherzyk uszny można zidentyfikować jako podłużny narząd znajdujący się za okiem zawierający dwie mniejsze, wyraźne ciemne podłużne struktury (otolity).</li>
	<li>Za pomocą kontrolera mikromanipulacji wbić się w tkankę docelową (w tym przypadku pęcherzyk uszny) tak, aby końcówka igły znalazła się w pęcherzyku, a następnie wstrzyknąć zadaną objętość za pomocą przełącznika nożnego pikopompy. 
	UWAGA: Jeśli tkanka jest odporna na penetrację, spróbuj delikatnie dotknąć pokrętła kontrolera mikromanipulacji.</li>
	<li>Aby uwolnić zarodki, przelej E3 po powierzchni od góry do dołu za pomocą pipety transferowej lub obracając naczynie tak, aby zarodki zostały uwolnione do otaczającego E3.</li>
	<li>Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego E3 bez MS-222 za pomocą pipety transferowej.</li>
</ol>
9. Badania przesiewowe zarodków za pomocą urządzenia do obrazowania PDMS
<ol>
	<li>Zalej urządzenie z kroku 4.7, przepuszczając E3 (+ MS-222) przez port. Można to zrobić za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl lub pipety transferowej z wąską końcówką.</li>
	<li>Napełnij studzienkę E3 + MS-222, aż urządzenie zostanie zakryte.</li>
	<li>Dostarczyć 4 wstrzyknięte zarodki z kroku 8.7 do każdej studzienki za pomocą pipety transferowej. W razie potrzeby zarodki można wstępnie znieczulić poprzez inkubację w E3 + MS-222 przez 1-2 minuty przed załadowaniem (krok 5.3).</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do mikromanipulacji (pętla do włosów lub podobne) ustaw zarodki przy wejściach do kanałów obrazowania w pożądanej orientacji (ogon do przodu lub głowa do przodu, w zależności od używanego urządzenia) i wepchnij je częściowo do urządzenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). Pomoże to równomiernie wciągnąć je do urządzenia.</li>
	<li>Przeciągnij E3 przez urządzenie z portu za pomocą pipety 1,000 μl lub pipety transferowej, aż zarodki zostaną wciągnięte do kanałów w odpowiedniej orientacji do obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać zarodków poza punkt pułapki, ponieważ spowoduje to uszkodzenie zarodków i zmianę ich orientacji.</li>
	<li>Przenieś płytkę studzienkową do mikroskopu w celu obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Obraz za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Dostosuj powiększenie, wybierając odpowiedni obiektyw. 10X jest zwykle przydatnym powiększeniem do obrazowania migracji neutrofili danio pręgowanego.</li>
		<li>Dostosuj intensywność źródła światła i czas ekspozycji dla każdego kanału, aby każdy sygnał był wyraźny, ale nie nasycony.</li>
		<li>Przechwytuj obrazy dla każdego kanału. W tym przypadku użyliśmy białka zielonej fluorescencji (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) i kanałów transmisyjnych. Obrazy wielokanałowe mogą być łączone podczas przetwarzania końcowego (Rysunek 4B-I).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li>
<li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+%28ZEBRA%29+device%3A+a+low-cost%2C+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424712000581">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li>
<li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li>
<li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhagoSight%3A+an+open-source+MATLAB%C2%AE+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636(2013).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016943321201094X">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish-on-a-chip%3A+microfluidics+for+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li>
<li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li>
<li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+a+chip%3A+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792(2014).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping%2C+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630(2012).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400512012154">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li>
<li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu opisujemy zastosowanie urządzeń, które niedawno opracowaliśmy, aby ułatwić mikroiniekcję danio pręgowanego z 2 dpf5 i wprowadzamy proste urządzenie montażowe bez agarozy do wygodnego obrazowania zarodków. Narzędzia te podkreślają użyteczność technik fotolitograficznych do wytwarzania urządzeń przydatnych w technikach grybowanych.
Odkryliśmy, że urządzenia MSA są szczególnie przydatne do wstrzykiwania komórek lub cząstek podatnych na agregację w igle do mik...

Danio pręgowany stał się potężnym modelem dla wielu dziedzin, od badań nad podstawową biologią rozwojową po badania genetyczne i chemiczne na dużą skalę1,2. Rutynowe manipulacje genetyczne, takie jak nadekspresja genów, knockdown, mutageneza CRISPR/Cas9 i transgeneza, opierają się na mikroiniekcji materiału genetycznego do zygoty jednokomórkowej, co doprowadziło do opracowania prostych, łatwych w użyciu, dostępnych na rynku narzędzi do orientacji i stabilizacji komórek jajowych do wstrzyknięcia3. Inne podejścia, takie jak przeszczep i infekcja, często wymagają mikroiniekcji do zarodków i larw w późniejszym stadium przy użyciu igieł kapilarnych o większej średnicy4. Jednak stosowanie igieł o większej średnicy stanowi poważne wyzwanie techniczne, ponieważ trudniej jest przeniknąć do tkanki docelowej bez pchania lub zwijania zarodka. W tych warunkach uzyskanie odpowiedniego ciśnienia wody wymaganego do ustabilizowania zarodka przy jednoczesnym uniknięciu wysuszenia podczas zabiegu jest trudne, a zarodki mogą nie być idealnie zorientowane do wstrzyknięcia do tkanki docelowej.
Po mikroiniekcji, często przydatne jest badanie przesiewowe wstrzykniętych zarodków, aby wybrać te, które zostały pomyślnie wstrzyknięte, oraz uchwycić obrazy początkowego punktu czasowego. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy szereg urządzeń mikrostrukturalnych, które pomagają ustabilizować 2 zarodki dpf w różnych orientacjach, zarówno do mikroiniekcji5, jak i do szybkich badań przesiewowych opartych na obrazie po wstrzyknięciu.
Aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość strukturalną w tych urządzeniach, użyliśmy technik fotolitografii. Metody te, powszechnie stosowane w przemyśle mikroelektronicznym, a ostatnio ekstrapolowane na wytwarzanie mikroprzepływowe, mogą osiągnąć pionowe struktury w zakresie od 1 do 1000 μm, co jest skalą dobrze nadającą się do manipulowania zarodkami i larwami danio pręgowanego. Wszystkie urządzenia zostały wyprodukowane przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS), który jest tani, wytrzymały fizycznie, biologicznie obojętny i przezroczysty.
Mikrostrukturalne tablice powierzchniowe (MSA) zostały sformatowane jako bloki PDMS z wzorzystą górną powierzchnią, analogicznie do prostych kanałów w blokach agarozy powszechnie używanych do mikroiniekcji jaj. W przypadku badań przesiewowych po wstrzyknięciu 6 urządzeń do obrazowania można umieścić w standardowej 6-dołkowej płytce ze szklanym dnem. Urządzenia te zostały zaprojektowane z myślą o łatwym ładowaniu zarodków, podczas gdy procedura rozładowywania wygodnie pozwala na uratowanie określonych zarodków, ułatwiając badania przesiewowe oparte na obrazie w sposób bardziej przyjazny dla użytkownika niż urządzenia opracowane wcześniej przez laboratorium Beebe6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td>Do odlewania urządzeń. Zestaw zawiera monomer PDMS i inicjator</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze żelowania</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Do odlewania urządzeń agarozowych</td></tr><tr><td>PFDTS silan</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 448931-10G</td><td>Do odlewania ujemnych form PDMS</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Do znieczulania danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Rodamina Dekstran 70 000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>Do śledzenia mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Leukotrien B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Chemoatraktant neutrofili</td></tr><tr><td>N-formylometyno-leucylo-fenyloalanina (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Chemoatraktant neutrofili</td></tr><tr><td>15 cm szalka Petriego</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>Do odlewania z płytki głównej</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>Do urządzeń do obrazowania</td></tr><tr><td>Mikrokapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>Do igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>Do przenoszenia zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Fisher</td><td>scientific E5242956003</td><td>Do ładowania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Dziurkacz Harris Uni-Core 1,5 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>Do dziurkowania portów w urządzeniach do obrazowania PDMS</td></tr><tr><td>nr 11 Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Do cięcia PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>Do dekorionacji zarodków i łamania końcówek igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikromanipulator Marzhauser</td><td>ASI</td><td>MM33-R Do</td><td>manipulowania igłą do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Stojak</td> <td>magnetycznyMSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>Do montażu mikromanipulatora</td></tr><tr><td>MPPI-3 Sterownik pompy pikopompowej</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>Do kontroli objętości i czasu mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny EVOS</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>Do obrazowania wstrzykniętych zarodków</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Do wizualizacji mikroinfekcji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AutoCAD Autodesk</td><td></td><td></td><td>Pobierz pliki AutoCAD z: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 oraz na stronie wiki protokołów społeczności ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &nbsp;</td></tr></tbody></table>

urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Danio pręgowany stał się potężnym modelem różnych chorób ludzkich i użytecznym narzędziem do coraz szerszego zakresu badań eksperymentalnych, począwszy od podstawowej biologii rozwojowej, a skończywszy na badaniach genetycznych i chemicznych na dużą skalę. Jednak wiele eksperymentów, zwłaszcza tych związanych z infekcjami i modelami ksenoprzeszczepów, opiera się na mikroiniekcjach i obrazowaniu zarodków i larw, które są pracochłonnymi technikami wymagającymi umiejętności i wiedzy. Aby poprawić precyzję i wydajność obecnych technik mikroiniekcji, opracowaliśmy serię mikrostrukturalnych urządzeń do orientacji i stabilizacji zarodków danio pręgowanego po 2 dniach od zapłodnienia (dpf) w orientacji brzusznej, grzbietowej lub bocznej przed zabiegiem. Aby pomóc w obrazowaniu zarodków, zaprojektowaliśmy również proste urządzenie z kanałami, które ustawiają 4 danio pręgowane równolegle na szklanym szkiełku nakrywkowym. Narzędzia, które tutaj prezentujemy, pokazują skuteczność podejść fotolitograficznych do generowania użytecznych urządzeń do optymalizacji technik danio pręgowanego.

Opisane tutaj podejście demonstruje projekt (Rycina 1) i wykonanie urządzeń do stosowania u dwudniowych (2 dpf) zarodków danio pręgowanego, z wykorzystaniem technik fotolitografii (Rycina 2) i soft-litografii (Rycina 3). Metoda ta umożliwia szybkie testowanie wielu iteracji i modyfikacji projektu, a wprowadzenie zmian i optymalizacja wymiarów mikrostruktury dla danio pręgowanego na innych etapach roz...

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Ogólnym celem tej metodologii jest ułatwienie i zwiększenie dokładności mikroiniekcji larw ryb zerbrafish. Metoda ta pomaga naukowcom wykorzystującym systemy modelowe danio pręgowanego do unieruchamiania larw danio pręgowanego w określonych orientacjach w dużych układach. Technika ta pozwala na łatwiejszy dostęp do określonych tkanek w celu mikroiniekcji i obrazowania i jest bardzo skuteczna, gdy do zastosowań takich jak infekcje lub modele raka ksenoprzeszczepu wymagana jest duża liczba larw.Moje strategie wytwarzania w modelach danio pręgowanego są wysoce komplementarne. Jedna z nich jest stworzona przez człowieka i prosta. Drugi jest żywy i złożony.Oba mają tę samą skalę rozmiarów. Oba są przezroczyste. Oba umożliwiają obserwacje w rozdzielczości pojedynczej komórki.Jak pokazujesz tutaj, można je łatwo łączyć i mogą mieć zastosowanie w badaniach nad praktycznie każdą poważną chorobą. Po przygotowaniu bloku PDMS na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą E-3, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć pipety transferowej, aby przenieść wymaganą liczbę zarodków na powierzchnię bloku PDMS. Za pomocą pętli do włosów lub podobnego narzędzia wepchnij zarodki w wgłębienia mikrostruktu

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Urządzenie do Zranienia i Uwięzienia Danio Zebra dla Wzrostu i Obrazowania), które jest urządzeniem przeznaczonym do orientacji i krępowania larw danio pręgowanego. Konstrukcja pozwala na przecięcie ogona i długoterminowe zbieranie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających gojenie się i regenerację ran.

Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Innowacyjna metoda wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych wykorzystujących laminowanie politereftalanu etylenu (PET) znacznie zmniejsza koszty i złożoność chwytania i obrazowania wielu żywych zarodków danio pręgowanego.

Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego

Poznaj metodę mikroiniekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrostrukturalnych urządzeń do stabilizacji i obrazowania. Technika umożliwia precyzyjne ukierunkowanie tkanek w badaniach nad rozwojem i neurobiologią.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów