Name: Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Poznaj technikę profilowania polisomów do badania translacji mRNA u Leishmania major, komórek ludzkich i tkanek myszy. Metoda ta pozwala analizować regulację syntezy białek w różnych systemach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Ching Lee za pomoc w nagrywaniu dźwięku. Badania były wspierane przez fundusze start-upowe z Centrum Nauk o Zdrowiu Texas Tech University oraz przez grant Center of Excellence for Translational Neuroscience and Therapeutics (CTNT) PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW dla A.L.K.; częściowo dzięki grantowi NIH R01AI099380 dla K.Z. James C. Huffman i Kristen R. Baca byli stypendystami CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research) i byli wspierani przez program.

<ol><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Capewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Trypanosoma+brucei+Total+and+Polysomal+mRNA+during+Development+within+Its+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.</a> PLoS One. 8 (6), e67069(2013).</li>
<li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).</li>
<li>Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+immune+responses%3A+from+transcripts+to+translatomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes.</a> Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).</li>
<li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycloheximide%3A+Aspects+of+Inhibition+of+Protein+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li>
<li>Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Zuccotti, P., Modelska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Translatome+with+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying the Translatome with Polysome Profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).</li>
<li>Arava, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+translation+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoCAGE+reveals+5%27+UTR+features+that+define+specific+modes+of+translation+of+functionally+related+MTOR-sensitive+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs.</a> Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).</li>
<li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li>
<li>Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nip7p+interacts+with+Nop8p%2C+an+essential+nucleolar+protein+required+for+60S+ribosome+biogenesis%2C+and+the+exosome+subunit+Rrp43p%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p.</a> Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Gkogkas, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism-related+deficits+via+dysregulated+eIF4E-dependent+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control.</a> Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).</li>
<li>Robichaud, N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+and+the+cancer+cell+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control and the cancer cell response to stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).</li>
<li>Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+protein+synthesis+and+the+effects+of+catabolic+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).</li>
<li>Ishimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+function.+Ribosome+stalling+induced+by+mutation+of+a+CNS-specific+tRNA+causes+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration.</a> Science. 345 (6195), 455-459 (2014).</li>
<li>Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+RNAs+repress+translation+after+initiation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells.</a> Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 14 (11), R128(2013).</li>
<li>De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation in trypanosomatids.</a> Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).</li>
<li>Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+related+to+stress+response+and+differentiation+in+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).</li>
<li>De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+differentiation+in+Leishmania+lifecycle+progression%3A+post-transcriptional+control+conducts+the+orchestra%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra.</a> Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).</li>
<li>Soto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-dependent+translation+of+histone+mRNAs+is+the+key+control+point+for+regulation+of+histone+biosynthesis+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum.</a> Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).</li>
<li>McNicoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3+%27-untranslated+region+elements+regulate+stage-specific+mRNA+accumulation+and+translation+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).</li>
<li>Folgueira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+efficiencies+of+the+two+Leishmania+infantum+HSP70+mRNAs%2C+differing+in+their+3+%27-untranslated+regions%2C+are+affected+by+shifts+in+the+temperature+of+growth+through+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).</li>
<li>Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+developmentally+regulated+noncoding+RNAs+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania.</a> Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+SecA+association+with+signal+sequences+in+ribosome-bound+nascent+chains%3A+a+potential+role+for+SecA+in+ribosome+targeting+to+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Fractionation+to+Analyze+mRNA+Distribution+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles.</a> Bio Protocols. 7 (3), (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+CFTR+transmembrane+span+integration+by+disease-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Frakcjonowanie polisomów za pomocą gradientu sacharozy w połączeniu z analizą RNA i białek frakcji jest potężną metodą analizy stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub całego translatomu, a także roli czynników białkowych regulujących maszynerię translacyjną w normalnym stanie fizjologicznym lub chorobowym. Profilowanie polisomalne jest szczególnie odpowiednią techniką do badania regulacji translacji u organizmów takich jak trypanosomatydy, w tym Leishmania, gdzie kontrola transkrypcji jest w dużej mierze ni...

Regulacja ekspresji genów w komórkach jest kontrolowana przez mechanizmy transkrypcyjne, potranskrypcyjne i potranslacyjne. Postępy w głębokim sekwencjonowaniu RNA pozwalają na badanie poziomów mRNA w stanie ustalonym w skali całego genomu na niespotykanym dotąd poziomie. Jednak ostatnie odkrycia ujawniły, że poziom mRNA w stanie stacjonarnym nie zawsze koreluje z produkcją białka1,2. Los pojedynczego transkryptu jest bardzo złożony i zależy od wielu czynników, takich jak bodźce wewnętrzne/zewnętrzne, stres itp. Regulacja ekspresji genów podczas syntezy białek zapewnia kolejną warstwę kontroli ekspresji niezbędną do szybkiej reakcji w zmieniających się warunkach. Profilowanie polisomów (lub "polirybosomów"), czyli separacja i wizualizacja aktywnie translujących rybosomów, jest potężną metodą badania regulacji syntezy białek. Chociaż pierwsze eksperymentalne zastosowania pojawiły się w latach sześćdziesiątych XX wieku3, profilowanie polisomów jest obecnie jedną z najważniejszych technik w badaniach nad translacją białek4. Pojedyncze mRNA mogą ulegać translacji przez więcej niż jeden rybosom, co prowadzi do powstania polisomu. Transkrypty mogą być zatrzymywane na rybosomach za pomocą cykloheksymidu5, a mRNA zawierające różną liczbę polisomów można rozdzielić w procesie frakcjonowania polisomów za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy6,7,8,9. Analiza RNA frakcji polisomilnych pozwala następnie na pomiar zmian w stanach translacyjnych poszczególnych mRNA w skali całego genomu i podczas różnych warunków fizjologicznych4,7,10. Metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia roli sekwencji 5'UTR i 3'UTR w kontroli translatowalności mRNA11, zbadania roli miRNA w represji translacyjnej12, odkrycia defektów w biogenezie rybosomów13 oraz zrozumienia roli białek związanych z rybosomami w chorobach człowieka14,15. W ciągu ostatniej dekady pojawiła się rosnąca rola regulacji ekspresji genów podczas translacji, co ilustruje jej znaczenie w chorobach człowieka. Dowody na kontrolę translacyjną w chorobach nowotworowych, metabolicznych i neurodegeneracyjnych są przytłaczające15,16,17,18. Na przykład rozregulowanie kontroli translacyjnej zależnej od eIF4E przyczynia się do deficytów związanych z autyzmem15, a FMRP jest zaangażowana w zatrzymanie rybosomów na mRNA związanych z autyzmem14. Tak więc profilowanie polisomalne jest bardzo ważnym narzędziem do badania defektów regulacji translacyjnej w wielu chorobach człowieka.
Analiza białek frakcji polisomalnych w różnych warunkach fizjologicznych analizuje funkcję czynników związanych z rybosomami podczas translacji. Technika profilowania polisomów została zastosowana u wielu gatunków, w tym drożdży, komórek ssaków, roślin i pierwotniaków10,19,20,21. Pasożytnicze pierwotniaki, takie jak Trypanosoma i Leishmania, wykazują ograniczoną kontrolę transkrypcji ekspresji genów. Ich genomy są zorganizowane w polistroniczne klastry genów, które nie mają transkrypcji regulowanej przez promotor22. Zamiast tego ekspresja genów rozwojowych jest głównie kontrolowana na poziomie translacji białek i stabilności mRNA u gatunków trypanosomatidów23,24. Dlatego zrozumienie kontroli translacyjnej przy braku regulacji transkrypcji jest szczególnie ważne dla tych organizmów. Profilowanie polisomalne jest potężnym narzędziem do badania potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów w Leishmania25,26,27,28.
Niedawny postęp w wykrywaniu indywidualnych poziomów mRNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i pełnej transkryptomu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji, a także technologie proteomiczne, przenoszą rozdzielczość i zalety profilowania polisomalnego na nowy poziom. Zastosowanie tych metod można dodatkowo rozszerzyć o analizę poszczególnych frakcji polisomicznych za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA połączonego z analizą proteomiczną w celu monitorowania stanu translacyjnego komórek w skali całego genomu. Pozwala to na identyfikację nowych graczy molekularnych regulujących translację w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany w trzech różnych modelach: pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Przedstawiamy porady dotyczące przygotowania lizatów komórkowych z różnych organizmów, optymalizacji warunków gradientowych, wyboru inhibitorów RNazy oraz zastosowania RT-qPCR, Western blot i elektroforezy RNA do analizy frakcji polisomów w tym badaniu.

<table><tbody><tr><td>Instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Tłokowy frakcjonator gradientowy</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Zbieracz frakcji</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon</td><td></td><td>ECLIPSE Ts2-FL/TS2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Termocykler</td><td>Applied Biosystems firmy Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>inkubator CO2</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator HERATHERM</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego, klasa II, typ A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka Revco</td><td>Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Redlica Beckman</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki SW41</td><td>Redlica Beckman 331362</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor wahadłowo-kubełkowy</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym Quant Studio 12K Flex 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax oprogramowanie&nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>< mocny>Materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Otwarte probówki wirówkowe polyclear, (14 mm x 89 mm)</td>Strzykawka <td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>Strzykawka BD 3 mL23 Gauge 1 calowa igła</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoprzepływowa jednostka filtrująca Nalgene 90 mm, 500 mL, 0,2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3</ kolby sup></td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion firmy Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor rybonukleazy Rnasina</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini inhibitory proteazy wolne od EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy odwadnianie disodowe (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Pojemność cDNA Zestaw odwrotnej transkryptazy</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RPL11</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku rybosomalnemu S6 (C-8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Kloródek litu</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący żel II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Podłoże chemiluminescencyjne Pico PLUS</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 5'-trifosforanu adenozyny (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna 5'-trifosforan sól disodowa hydrat (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli trisodowej 5'-trifosforanu urydyny (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfataza</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie polisomów w leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Prawidłowa ekspresja białka we właściwym czasie i w odpowiednich ilościach jest podstawą prawidłowego funkcjonowania komórek i przetrwania w szybko zmieniającym się środowisku. Przez długi czas badania nad ekspresją genów były zdominowane przez badania na poziomie transkrypcji. Jednak poziomy mRNA w stanie stacjonarnym nie korelują dobrze z produkcją białek, a translatowalność mRNA różni się znacznie w zależności od warunków. W niektórych organizmach, takich jak pasożyt Leishmania, ekspresja białka jest regulowana głównie na poziomie translacyjnym. Ostatnie badania wykazały, że dysregulacja translacji białek jest związana z rakiem, chorobami metabolicznymi, neurodegeneracyjnymi i innymi chorobami ludzkimi. Profilowanie polisomów jest potężną metodą badania regulacji translacji białek. Pozwala na pomiar stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub badanie translacji w skali całego genomu. Podstawą tej techniki jest oddzielenie polisomów, rybosomów, ich podjednostek i wolnych mRNA podczas wirowania lizatu cytoplazmatycznego przez gradient sacharozy. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany na trzech różnych modelach - pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Komórki Leishmania swobodnie rosną w zawiesinie, a hodowane komórki ludzkie rosną w przylegającej monowarstwie, podczas gdy jądra myszy reprezentują próbkę tkanki zwierzęcej. W ten sposób technika jest dostosowana do wszystkich tych źródeł. Protokół analizy frakcji polisomicznych obejmuje detekcję poszczególnych poziomów mRNA metodą RT-qPCR, białek metodą Western blot oraz analizę rybosomalnego RNA metodą elektroforezy. Metodę można dalej rozszerzyć poprzez badanie związku mRNA z rybosomem na poziomie transkryptomu za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA oraz analizę białek związanych z rybosomami za pomocą spektroskopii mas frakcji. Metodę można łatwo dostosować do innych modeli biologicznych.

W niniejszym badaniu opisujemy zastosowanie techniki profilowania polisomalnego w odniesieniu do trzech różnych źródeł: pasożytniczych Leishmania major, hodowlanych ludzkich komórek oraz jądra myszy. Komórki Leishmania rosną swobodnie w zawiesinie w pożywkach płynnych, hodowlane ludzkie komórki rosną w adherentnej warstwie monowarstwy na płytkach, a jądro myszy stanowi próbkę tkankową. Metodę tę można łatwo dostosować do innych typów komórek rosnących swobodnie w zawiesi...

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Ogólnym celem tej techniki jest zbadanie zaangażowania poszczególnych mRNA w polisomy podczas translacji. Profilowanie polisomów to potężna technologia do badania zaangażowania mRNA w rybosomy i polisomy. Technika ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją translacji i represją.Nasz zespół przedstawia tutaj techniki frakcjonowania polissomalnego i analizy frakcji na przykładzie trzech organizmów. Pasożyt Leishmania major, hodowane komórki ludzkie i tkanka zwierzęca. Podejście to składa się z czterech głównych etapów: przygotowania lizatu, przygotowania gradientu sacharozy i ultrawirowania, frakcjonowania polisomów i pobierania próbek.Analiza frakcji. Komórki z różnych źródeł są zbierane, przemywane i lizowane w buforze do lizy przez przejście przez homogenizator igłowy lub Dounce. Wirowanie służy do usuwania resztek komórkowych klarujących lizat.Ciągły gradient sacharozy powstaje w wyniku zmieszania 10% i 50% roztworów sacharozy w ekspresie do gradientów. Lizat jest ładowany na górze gradientu. Ultrawirowanie oddziela mrNA związane z różną liczbą rybosomów.Który jest monitorowany przez detektor UV podczas frakcjonowania, tworząc wyraźne widma absorpcyjne. Przyg

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Poznaj technikę profilowania polisomów do badania translacji mRNA u Leishmania major, komórek ludzkich i tkanek myszy. Metoda ta pozwala analizować regulację syntezy białek w różnych systemach biologicznych.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Przeglądaj więcej filmów