Name: Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Poznaj technikę profilowania polisomów do badania translacji mRNA u Leishmania major, komórek ludzkich i tkanek myszy. Metoda ta pozwala analizować regulację syntezy białek w różnych systemach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ching Lee za pomoc w nagrywaniu dźwięku. Badania były wspierane przez fundusze start-upowe z Centrum Nauk o Zdrowiu Texas Tech University oraz przez grant Center of Excellence for Translational Neuroscience and Therapeutics (CTNT) PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW dla A.L.K.; częściowo dzięki grantowi NIH R01AI099380 dla K.Z. James C. Huffman i Kristen R. Baca byli stypendystami CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research) i byli wspierani przez program.

<ol><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Capewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Trypanosoma+brucei+Total+and+Polysomal+mRNA+during+Development+within+Its+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.</a> PLoS One. 8 (6), e67069(2013).</li>
<li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).</li>
<li>Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+immune+responses%3A+from+transcripts+to+translatomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes.</a> Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).</li>
<li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycloheximide%3A+Aspects+of+Inhibition+of+Protein+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li>
<li>Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Zuccotti, P., Modelska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Translatome+with+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying the Translatome with Polysome Profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).</li>
<li>Arava, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+translation+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoCAGE+reveals+5%27+UTR+features+that+define+specific+modes+of+translation+of+functionally+related+MTOR-sensitive+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs.</a> Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).</li>
<li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li>
<li>Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nip7p+interacts+with+Nop8p%2C+an+essential+nucleolar+protein+required+for+60S+ribosome+biogenesis%2C+and+the+exosome+subunit+Rrp43p%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p.</a> Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Gkogkas, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism-related+deficits+via+dysregulated+eIF4E-dependent+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control.</a> Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).</li>
<li>Robichaud, N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+and+the+cancer+cell+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control and the cancer cell response to stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).</li>
<li>Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+protein+synthesis+and+the+effects+of+catabolic+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).</li>
<li>Ishimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+function.+Ribosome+stalling+induced+by+mutation+of+a+CNS-specific+tRNA+causes+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration.</a> Science. 345 (6195), 455-459 (2014).</li>
<li>Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+RNAs+repress+translation+after+initiation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells.</a> Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 14 (11), R128(2013).</li>
<li>De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation in trypanosomatids.</a> Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).</li>
<li>Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+related+to+stress+response+and+differentiation+in+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).</li>
<li>De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+differentiation+in+Leishmania+lifecycle+progression%3A+post-transcriptional+control+conducts+the+orchestra%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra.</a> Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).</li>
<li>Soto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-dependent+translation+of+histone+mRNAs+is+the+key+control+point+for+regulation+of+histone+biosynthesis+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum.</a> Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).</li>
<li>McNicoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3+%27-untranslated+region+elements+regulate+stage-specific+mRNA+accumulation+and+translation+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).</li>
<li>Folgueira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+efficiencies+of+the+two+Leishmania+infantum+HSP70+mRNAs%2C+differing+in+their+3+%27-untranslated+regions%2C+are+affected+by+shifts+in+the+temperature+of+growth+through+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).</li>
<li>Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+developmentally+regulated+noncoding+RNAs+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania.</a> Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+SecA+association+with+signal+sequences+in+ribosome-bound+nascent+chains%3A+a+potential+role+for+SecA+in+ribosome+targeting+to+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Fractionation+to+Analyze+mRNA+Distribution+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles.</a> Bio Protocols. 7 (3), (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+CFTR+transmembrane+span+integration+by+disease-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Frakcjonowanie polisomów za pomocą gradientu sacharozy w połączeniu z analizą RNA i białek frakcji jest potężną metodą analizy stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub całego translatomu, a także roli czynników białkowych regulujących maszynerię translacyjną w normalnym stanie fizjologicznym lub chorobowym. Profilowanie polisomalne jest szczególnie odpowiednią techniką do badania regulacji translacji u organizmów takich jak trypanosomatydy, w tym Leishmania, gdzie kontrola transkrypcji jest w dużej mierze ni...

Regulacja ekspresji genów w komórkach jest kontrolowana przez mechanizmy transkrypcyjne, potranskrypcyjne i potranslacyjne. Postępy w głębokim sekwencjonowaniu RNA pozwalają na badanie poziomów mRNA w stanie ustalonym w skali całego genomu na niespotykanym dotąd poziomie. Jednak ostatnie odkrycia ujawniły, że poziom mRNA w stanie stacjonarnym nie zawsze koreluje z produkcją białka1,2. Los pojedynczego transkryptu jest bardzo złożony i zależy od wielu czynników, takich jak bodźce wewnętrzne/zewnętrzne, stres itp. Regulacja ekspresji genów podczas syntezy białek zapewnia kolejną warstwę kontroli ekspresji niezbędną do szybkiej reakcji w zmieniających się warunkach. Profilowanie polisomów (lub "polirybosomów"), czyli separacja i wizualizacja aktywnie translujących rybosomów, jest potężną metodą badania regulacji syntezy białek. Chociaż pierwsze eksperymentalne zastosowania pojawiły się w latach sześćdziesiątych XX wieku3, profilowanie polisomów jest obecnie jedną z najważniejszych technik w badaniach nad translacją białek4. Pojedyncze mRNA mogą ulegać translacji przez więcej niż jeden rybosom, co prowadzi do powstania polisomu. Transkrypty mogą być zatrzymywane na rybosomach za pomocą cykloheksymidu5, a mRNA zawierające różną liczbę polisomów można rozdzielić w procesie frakcjonowania polisomów za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy6,7,8,9. Analiza RNA frakcji polisomilnych pozwala następnie na pomiar zmian w stanach translacyjnych poszczególnych mRNA w skali całego genomu i podczas różnych warunków fizjologicznych4,7,10. Metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia roli sekwencji 5'UTR i 3'UTR w kontroli translatowalności mRNA11, zbadania roli miRNA w represji translacyjnej12, odkrycia defektów w biogenezie rybosomów13 oraz zrozumienia roli białek związanych z rybosomami w chorobach człowieka14,15. W ciągu ostatniej dekady pojawiła się rosnąca rola regulacji ekspresji genów podczas translacji, co ilustruje jej znaczenie w chorobach człowieka. Dowody na kontrolę translacyjną w chorobach nowotworowych, metabolicznych i neurodegeneracyjnych są przytłaczające15,16,17,18. Na przykład rozregulowanie kontroli translacyjnej zależnej od eIF4E przyczynia się do deficytów związanych z autyzmem15, a FMRP jest zaangażowana w zatrzymanie rybosomów na mRNA związanych z autyzmem14. Tak więc profilowanie polisomalne jest bardzo ważnym narzędziem do badania defektów regulacji translacyjnej w wielu chorobach człowieka.
Analiza białek frakcji polisomalnych w różnych warunkach fizjologicznych analizuje funkcję czynników związanych z rybosomami podczas translacji. Technika profilowania polisomów została zastosowana u wielu gatunków, w tym drożdży, komórek ssaków, roślin i pierwotniaków10,19,20,21. Pasożytnicze pierwotniaki, takie jak Trypanosoma i Leishmania, wykazują ograniczoną kontrolę transkrypcji ekspresji genów. Ich genomy są zorganizowane w polistroniczne klastry genów, które nie mają transkrypcji regulowanej przez promotor22. Zamiast tego ekspresja genów rozwojowych jest głównie kontrolowana na poziomie translacji białek i stabilności mRNA u gatunków trypanosomatidów23,24. Dlatego zrozumienie kontroli translacyjnej przy braku regulacji transkrypcji jest szczególnie ważne dla tych organizmów. Profilowanie polisomalne jest potężnym narzędziem do badania potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów w Leishmania25,26,27,28.
Niedawny postęp w wykrywaniu indywidualnych poziomów mRNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i pełnej transkryptomu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji, a także technologie proteomiczne, przenoszą rozdzielczość i zalety profilowania polisomalnego na nowy poziom. Zastosowanie tych metod można dodatkowo rozszerzyć o analizę poszczególnych frakcji polisomicznych za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA połączonego z analizą proteomiczną w celu monitorowania stanu translacyjnego komórek w skali całego genomu. Pozwala to na identyfikację nowych graczy molekularnych regulujących translację w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany w trzech różnych modelach: pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Przedstawiamy porady dotyczące przygotowania lizatów komórkowych z różnych organizmów, optymalizacji warunków gradientowych, wyboru inhibitorów RNazy oraz zastosowania RT-qPCR, Western blot i elektroforezy RNA do analizy frakcji polisomów w tym badaniu.

<table><tbody><tr><td>Instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Tłokowy frakcjonator gradientowy</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Zbieracz frakcji</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon</td><td></td><td>ECLIPSE Ts2-FL/TS2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Termocykler</td><td>Applied Biosystems firmy Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>inkubator CO2</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator HERATHERM</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego, klasa II, typ A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka Revco</td><td>Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Redlica Beckman</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki SW41</td><td>Redlica Beckman 331362</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor wahadłowo-kubełkowy</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym Quant Studio 12K Flex 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax oprogramowanie&nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>< mocny>Materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Otwarte probówki wirówkowe polyclear, (14 mm x 89 mm)</td>Strzykawka <td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>Strzykawka BD 3 mL23 Gauge 1 calowa igła</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoprzepływowa jednostka filtrująca Nalgene 90 mm, 500 mL, 0,2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3</ kolby sup></td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion firmy Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor rybonukleazy Rnasina</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini inhibitory proteazy wolne od EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy odwadnianie disodowe (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Pojemność cDNA Zestaw odwrotnej transkryptazy</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RPL11</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku rybosomalnemu S6 (C-8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Kloródek litu</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący żel II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Podłoże chemiluminescencyjne Pico PLUS</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 5'-trifosforanu adenozyny (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna 5'-trifosforan sól disodowa hydrat (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli trisodowej 5'-trifosforanu urydyny (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfataza</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie polisomów w leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Prawidłowa ekspresja białka we właściwym czasie i w odpowiednich ilościach jest podstawą prawidłowego funkcjonowania komórek i przetrwania w szybko zmieniającym się środowisku. Przez długi czas badania nad ekspresją genów były zdominowane przez badania na poziomie transkrypcji. Jednak poziomy mRNA w stanie stacjonarnym nie korelują dobrze z produkcją białek, a translatowalność mRNA różni się znacznie w zależności od warunków. W niektórych organizmach, takich jak pasożyt Leishmania, ekspresja białka jest regulowana głównie na poziomie translacyjnym. Ostatnie badania wykazały, że dysregulacja translacji białek jest związana z rakiem, chorobami metabolicznymi, neurodegeneracyjnymi i innymi chorobami ludzkimi. Profilowanie polisomów jest potężną metodą badania regulacji translacji białek. Pozwala na pomiar stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub badanie translacji w skali całego genomu. Podstawą tej techniki jest oddzielenie polisomów, rybosomów, ich podjednostek i wolnych mRNA podczas wirowania lizatu cytoplazmatycznego przez gradient sacharozy. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany na trzech różnych modelach - pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Komórki Leishmania swobodnie rosną w zawiesinie, a hodowane komórki ludzkie rosną w przylegającej monowarstwie, podczas gdy jądra myszy reprezentują próbkę tkanki zwierzęcej. W ten sposób technika jest dostosowana do wszystkich tych źródeł. Protokół analizy frakcji polisomicznych obejmuje detekcję poszczególnych poziomów mRNA metodą RT-qPCR, białek metodą Western blot oraz analizę rybosomalnego RNA metodą elektroforezy. Metodę można dalej rozszerzyć poprzez badanie związku mRNA z rybosomem na poziomie transkryptomu za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA oraz analizę białek związanych z rybosomami za pomocą spektroskopii mas frakcji. Metodę można łatwo dostosować do innych modeli biologicznych.

W niniejszym badaniu opisujemy zastosowanie techniki profilowania polisomalnego w odniesieniu do trzech różnych źródeł: pasożytniczych Leishmania major, hodowlanych ludzkich komórek oraz jądra myszy. Komórki Leishmania rosną swobodnie w zawiesinie w pożywkach płynnych, hodowlane ludzkie komórki rosną w adherentnej warstwie monowarstwy na płytkach, a jądro myszy stanowi próbkę tkankową. Metodę tę można łatwo dostosować do innych typów komórek rosnących swobodnie w zawiesi...

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Ogólnym celem tej techniki jest zbadanie zaangażowania poszczególnych mRNA w polisomy podczas translacji. Profilowanie polisomów to potężna technologia do badania zaangażowania mRNA w rybosomy i polisomy. Technika ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją translacji i represją.Nasz zespół przedstawia tutaj techniki frakcjonowania polissomalnego i analizy frakcji na przykładzie trzech organizmów. Pasożyt Leishmania major, hodowane komórki ludzkie i tkanka zwierzęca. Podejście to składa się z czterech głównych etapów: przygotowania lizatu, przygotowania gradientu sacharozy i ultrawirowania, frakcjonowania polisomów i pobierania próbek.Analiza frakcji. Komórki z różnych źródeł są zbierane, przemywane i lizowane w buforze do lizy przez przejście przez homogenizator igłowy lub Dounce. Wirowanie służy do usuwania resztek komórkowych klarujących lizat.Ciągły gradient sacharozy powstaje w wyniku zmieszania 10% i 50% roztworów sacharozy w ekspresie do gradientów. Lizat jest ładowany na górze gradientu. Ultrawirowanie oddziela mrNA związane z różną liczbą rybosomów.Który jest monitorowany przez detektor UV podczas frakcjonowania, tworząc wyraźne widma absorpcyjne. Przygotowanie lizatu. Istnieją pewne różnice w przygotowaniu lizatu w zależności od źródła.Po przygotowaniu lizatu procedury są identyczne niezależnie od pochodzenia próbki. Leishmania major Preparat lizatu cytoplazmatycznego. Umieść główne komórki Leishmania w 30 mililitrach pożywki o gęstości 100 000 komórek na mililitr.Ten etap jest przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieścić kolbę z kulturą Leishmania w inkubatorze i hodować komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza, aż do fazy logarytmicznej. Wzrost trwa zwykle około dwóch dni.Główne komórki Leishmania są łatwo widoczne pod mikroskopem. Dodaj cykloheksymid do wyhodowanej kultury Leishmania do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dziesięć minut w temperaturze 27 stopni Celsjusza.Po leczeniu cykloheksymidem przenosi się komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i wiruje się nią o wadze 1 800 g przez 8 minut. Odrzucić supernatant. Umyj komórki 30 mililitrami pbs i odwiruj.Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pbs. Weź porcję komórek i wymieszaj ją z roztworem formaldehydu. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru.Przenieś żądaną liczbę komórek do probówki do mikrofuge. Wiruj komórki w temperaturze 1 800 g przez 8 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy zawierającego inhibitory proteazy i RNAsin. Przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 23 trzy razy. Po przejściu przez igłę lizat staje się przezroczysty.Wirować w temperaturze 11,200 g przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu sklarowania lizatu. Przenieść oczyszczony lizat do świeżej probówki do mikrofuge i trzymać ją na lodzie do momentu ultrawirowania sacharozy w gradionym gradicy. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z hodowanych komórek ludzkich.Hoduj komórki HeLa na dużej płytce w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% CO2. Dodaj cykloheksymid do wyhodowanych komórek HeLa do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA. Inkubuj komórki przez dziesięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Odessać pożywkę i dwukrotnie umyć płytkę na lodzie zimnymi pbs. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy na płytkę i zeskrob komórki. Przenieś zlizowane komórki do probówki do mikrofuge.Przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 23 trzy razy. Wirować w temperaturze 11 200 g przez osiem minut, aby sklarować lizat. Po odwirowaniu przesunąć probówki na lodzie i przenieść supernatant do nowej probówki.Weź porcję, rozcieńcz ją i zmierz absorbancję przy 260 nanometrach za pomocą nanokropli. Jeżeli istnieje wiele próbek, dostosuj lizaty do tej samej gęstości optycznej i trzymaj próbki na lodzie do czasu ultrawirowania w gradiencie sacharozy. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z jądra myszy.Wypreparuj jądro myszy. Wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej i zbierz kanaliki nasienne jądra i przenieś je do stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów pbs. Energicznie wymieszaj tkankę.I pozwól tkance osiąść na lodzie przez pięć minut. Usuń bufor i umyj go pbs jeszcze dwa razy. Przenieś kanaliki nasienne do dwumililitrowej probówki i wiruj je z prędkością 500 g przez jedną minutę.Usunąć supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do kanalików i użyj pipety, aby rozbić tkankę. Przenieść zawiesinę do homogenizatora o małej objętości.Rozerwij tkankę siedmioma do ośmiu pociągnięciami szklanego tłuczka. Przenieś lizat do mikroprobówki wirówkowej. Odwirować próbkę o masie 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem minut w celu usunięcia lizatu.Przenieść supernatant do nowej probówki i trzymać go na lodzie. Następnie przystąp do przygotowania gradientu sacharozy. Preparat gradientu sacharozy.Umieść probówkę ultrawirówki w mikrobloku i narysuj linię wzdłuż górnego poziomu bloku. Następnie przenieś rurkę do stabilnego stojaka. Weź dziesięciomililitrową strzykawkę z dołączonym urządzeniem do nakładania warstw i napełnij strzykawkę 10% roztworem sacharozy.Delikatnie zwolnij go na dnie probówki ultrawirówki, aż roztwór sacharozy dotrze do kreski. Napełnij kolejną strzykawkę 50% roztworem sacharozy i ostrożnie włóż jej urządzenie do nakładania warstw przez warstwę 10% sacharozy na dno probówki. Delikatnie wypuść roztwór sacharozy, zaczynając od dołu, aż dotrze do znaku na probówce.Następnie uszczelnij rurkę dołączoną nakrętką. Aby przygotować gradient sacharozy, włącz urządzenie do tworzenia gradientów. Następnie wypoziomuj płytkę za pomocą przycisków w górę lub w dół i naciśnij gotowe.Po wyrównaniu płyty wciśnij grad. Przejdź do listy menu gradientu i wybierz wirnik SW41. Następnie wybierz żądany gradient sacharozy.Naciśnij przycisk użycia. Umieść uchwyt rurki podstawy magnesu na maszynie gradientu. Następnie przenieś rurkę do uchwytu.Jednocześnie można przygotować do sześciu gradientów. Naciśnij uruchom. Kreator gradientów obraca rury z prędkością i kątami programu, tworząc gradient liniowy.Przygotowanie gradientu zajmie tylko kilka minut. Po zakończeniu procesu umieść probówkę w stojaku. Usunąć objętość równą objętości próbki z górnej części probówek ultrawirówek z gradientami sacharozy.Ostrożnie załaduj 500 mikrolitrów lizatu na wierzch. Umieść rurki w wiadrach wirnika i wyważ je. Wirować w temperaturze 260 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Frakcjonowanie polisomów i pobieranie próbek. Po ultraodwirowaniu umieść probówki w wiadrach wirnika na lodzie. Włącz kolektor frakcji i frakcjonator.Kliknij przycisk Skanuj w menu frakcjonatora. Umieść stojak z probówkami zbiorczymi do kolektora frakcji. Napełnij zbiornik do płukania z boku frakcjonatora wodą dejonizowaną.Naciśnij przycisk płukania przez dziesięć sekund, aby przepłukać pompę. Podłączyć adapter do płukania ze strzykawką wypełnioną wodą do tłoka w celu kalibracji. Otwórz oprogramowanie frakcjonatora na komputerze.Naciśnij przycisk kalibruj. Użyć ustawienia domyślnego i nacisnąć przycisk Ok.Be gotowy do wstrzyknięcia wody ze strzykawki. Naciśnij przycisk OK, aby przeprowadzić kalibrację.Natychmiast rozpocznij wstrzykiwanie wody przez następne pięć sekund. Pojawi się znak Kalibracja zera zakończona. Wyjmij adapter do płukania ze strzykawką i przymocuj końcówkę do tłoka frakcjonatora.Otwórz mosiężny zawór powietrza i naciśnij powietrza przez dziesięć sekund, aby wysuszyć rurę przewodzącą powietrze i komórkę przepływową. Zamknij zawór powietrza. Wyjmij rurkę gradientową z wiadra wirnika i umieść ją w stojaku.Nałóż nasadkę uchwytu probówki na górną część probówki i ostrożnie wsuń rurkę do uchwytu probówki i zablokuj ją. Umieść uchwyt pod tłokiem. Często pasma polisomalne można zobaczyć gołym okiem.Wprowadź żądane ustawienia liczb ułamkowych i objętości. Nazwij plik i naciśnij OK, a następnie przejdź do przycisku wykresu. W następnym oknie naciśnij Rozpocznij skanowanie.Pojawią się ustawienia i naciśnij Ok.Kolektor przesunie się od rynny do pierwszej frakcji, a tłok wsunie się do rury. Gdy tłok dotrze do szczytu gradientu, zwolni do wybranej prędkości, a ułamki zostaną zebrane. Zwykle zbieramy 24 frakcje po 500 mikrolitrów każda.Po zakończeniu tłok wysunie się z rury gradientowej. Otwórz mosiężny zawór powietrza. Naciśnij powietrza na frakcjonowniku, aby pobrać ostatnią frakcję.Na końcu biegu zobaczysz profil absorbancji gradientu. Analiza frakcji. Otrzymane frakcje można wykorzystać do analizy RNA i białek.RNA może być analizowane za pomocą elektroforezy, a następnie Northern Blot lub wykorzystywane do produkcji cDNA, a następnie reakcji RT-qPCR w celu analizy asocjacji poszczególnych mRNA z polisomami. Sekwencjonowanie nowej generacji może być wykorzystane do analizy statusu translacji mRNA w skali transkryptomu. Do analizy białek frakcji polisomalnych białka wytrąca się kwasem triklorycemidowym w celu ich zagęszczenia.Następnie białka są analizowane za pomocą Western Blotting lub Mass Spec na poziomie proteomu. Wyniki. W tym miejscu przedstawiamy wyniki frakcjonowania i analizy polisomów na przykładach trzech organizmów. Leishmania, hodowane komórki ludzkie i tkanka myszy.Frakcjonowanie polisomów wykorzystano do zbadania związku mRNA Sherpa i tubuliny z rybosomami podczas translacji i Leishmania major. Wykres absorbancji dla frakcjonowania ma wyraźny kształt z typowymi pikami dla podjednostek rybosomów 40S i 60S, monosomów 80S i polisomów. Podwielokrotności ułamków połączono w trzy grupy.Pre-polissomy, lekkie polisomy i ciężkie polissomy. Względne poziomy mRNA badano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Dane sugerują, że mRNA tubuliny ulega aktywnej translacji.Ponieważ kojarzył się głównie z ciężkimi i lekkimi polisomami. Podczas gdy translacja mRNA Sherp jest mniej aktywna. Stwierdzono go głównie w połączeniu z pre-polisomami i lekkimi polisomami.Tak więc eksperyment ten wyraźnie pokazuje zdolność tej techniki do badania indywidualnego zaangażowania mRNA w translację. Rysunek ten przedstawia typowy wykres absorbancji frakcjonowania polisomów komórek HeLa. Białka zagęszczono przez wytrącanie 10% kwasem trichlorooctowym.Małe podjednostkowe białko rybosomalne RPS6 i duże podjednostkowe białko rybosomalne RPL11 wykryto za pomocą Western Blot. Ich rozkład dobrze korelował z wyraźnymi pikami w widmie absorbancji. Na tym rysunku przedstawiamy przykład wykrywania rybosomalnego RNA za pomocą elektroforezy we frakcjonowanych polisomach z jądra myszy. Wnioski.Profilowanie polisomalne to wszechstronna technika, którą można wykorzystać do analizy stanu translacyjnego poszczególnych mRNA, badania białek związanych z rybosomami i badania regulacji translacyjnej w różnych organizmach modelowych w różnych warunkach.

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Poznaj technikę profilowania polisomów do badania translacji mRNA u Leishmania major, komórek ludzkich i tkanek myszy. Metoda ta pozwala analizować regulację syntezy białek w różnych systemach biologicznych.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Przeglądaj więcej filmów