Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Ogólnym celem tej techniki jest zbadanie zaangażowania poszczególnych mRNA w polisomy podczas translacji. Profilowanie polisomów to potężna technologia do badania zaangażowania mRNA w rybosomy i polisomy. Technika ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją translacji i represją.

Nasz zespół przedstawia tutaj techniki frakcjonowania polissomalnego i analizy frakcji na przykładzie trzech organizmów. Pasożyt Leishmania major, hodowane komórki ludzkie i tkanka zwierzęca. Podejście to składa się z czterech głównych etapów: przygotowania lizatu, przygotowania gradientu sacharozy i ultrawirowania, frakcjonowania polisomów i pobierania próbek.

Analiza frakcji. Komórki z różnych źródeł są zbierane, przemywane i lizowane w buforze do lizy przez przejście przez homogenizator igłowy lub Dounce. Wirowanie służy do usuwania resztek komórkowych klarujących lizat.

Ciągły gradient sacharozy powstaje w wyniku zmieszania 10% i 50% roztworów sacharozy w ekspresie do gradientów. Lizat jest ładowany na górze gradientu. Ultrawirowanie oddziela mrNA związane z różną liczbą rybosomów.

Który jest monitorowany przez detektor UV podczas frakcjonowania, tworząc wyraźne widma absorpcyjne. Przygotowanie lizatu. Istnieją pewne różnice w przygotowaniu lizatu w zależności od źródła.

Po przygotowaniu lizatu procedury są identyczne niezależnie od pochodzenia próbki. Leishmania major Preparat lizatu cytoplazmatycznego. Umieść główne komórki Leishmania w 30 mililitrach pożywki o gęstości 100 000 komórek na mililitr.

Ten etap jest przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieścić kolbę z kulturą Leishmania w inkubatorze i hodować komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza, aż do fazy logarytmicznej. Wzrost trwa zwykle około dwóch dni.

Główne komórki Leishmania są łatwo widoczne pod mikroskopem. Dodaj cykloheksymid do wyhodowanej kultury Leishmania do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dziesięć minut w temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Po leczeniu cykloheksymidem przenosi się komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i wiruje się nią o wadze 1 800 g przez 8 minut. Odrzucić supernatant. Umyj komórki 30 mililitrami pbs i odwiruj.

Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pbs. Weź porcję komórek i wymieszaj ją z roztworem formaldehydu. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru.

Przenieś żądaną liczbę komórek do probówki do mikrofuge. Wiruj komórki w temperaturze 1 800 g przez 8 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy zawierającego inhibitory proteazy i RNAsin. Przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 23 trzy razy. Po przejściu przez igłę lizat staje się przezroczysty

Wirować w temperaturze 11,200 g przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu sklarowania lizatu. Przenieść oczyszczony lizat do świeżej probówki do mikrofuge i trzymać ją na lodzie do momentu ultrawirowania sacharozy w gradionym gradicy. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z hodowanych komórek ludzkich.

Hoduj komórki HeLa na dużej płytce w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% CO2. Dodaj cykloheksymid do wyhodowanych komórek HeLa do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA. Inkubuj komórki przez dziesięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Odessać pożywkę i dwukrotnie umyć płytkę na lodzie zimnymi pbs. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy na płytkę i zeskrob komórki. Przenieś zlizowane komórki do probówki do mikrofuge.

Przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 23 trzy razy. Wirować w temperaturze 11 200 g przez osiem minut, aby sklarować lizat. Po odwirowaniu przesunąć probówki na lodzie i przenieść supernatant do nowej probówki.

Weź porcję, rozcieńcz ją i zmierz absorbancję przy 260 nanometrach za pomocą nanokropli. Jeżeli istnieje wiele próbek, dostosuj lizaty do tej samej gęstości optycznej i trzymaj próbki na lodzie do czasu ultrawirowania w gradiencie sacharozy. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z jądra myszy.

Wypreparuj jądro myszy. Wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej i zbierz kanaliki nasienne jądra i przenieś je do stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów pbs. Energicznie wymieszaj tkankę.

I pozwól tkance osiąść na lodzie przez pięć minut. Usuń bufor i umyj go pbs jeszcze dwa razy. Przenieś kanaliki nasienne do dwumililitrowej probówki i wiruj je z prędkością 500 g przez jedną minutę.

Usunąć supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do kanalików i użyj pipety, aby rozbić tkankę. Przenieść zawiesinę do homogenizatora o małej objętości

Rozerwij tkankę siedmioma do ośmiu pociągnięciami szklanego tłuczka. Przenieś lizat do mikroprobówki wirówkowej. Odwirować próbkę o masie 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem minut w celu usunięcia lizatu.

Przenieść supernatant do nowej probówki i trzymać go na lodzie. Następnie przystąp do przygotowania gradientu sacharozy. Preparat gradientu sacharozy.

Umieść probówkę ultrawirówki w mikrobloku i narysuj linię wzdłuż górnego poziomu bloku. Następnie przenieś rurkę do stabilnego stojaka. Weź dziesięciomililitrową strzykawkę z dołączonym urządzeniem do nakładania warstw i napełnij strzykawkę 10% roztworem sacharozy.

Delikatnie zwolnij go na dnie probówki ultrawirówki, aż roztwór sacharozy dotrze do kreski. Napełnij kolejną strzykawkę 50% roztworem sacharozy i ostrożnie włóż jej urządzenie do nakładania warstw przez warstwę 10% sacharozy na dno probówki. Delikatnie wypuść roztwór sacharozy, zaczynając od dołu, aż dotrze do znaku na probówce.

Następnie uszczelnij rurkę dołączoną nakrętką. Aby przygotować gradient sacharozy, włącz urządzenie do tworzenia gradientów. Następnie wypoziomuj płytkę za pomocą przycisków w górę lub w dół i naciśnij gotowe.

Po wyrównaniu płyty wciśnij grad. Przejdź do listy menu gradientu i wybierz wirnik SW41. Następnie wybierz żądany gradient sacharozy.

Naciśnij przycisk użycia. Umieść uchwyt rurki podstawy magnesu na maszynie gradientu. Następnie przenieś rurkę do uchwytu.

Jednocześnie można przygotować do sześciu gradientów. Naciśnij uruchom. Kreator gradientów obraca rury z prędkością i kątami programu, tworząc gradient liniowy.

Przygotowanie gradientu zajmie tylko kilka minut. Po zakończeniu procesu umieść probówkę w stojaku. Usunąć objętość równą objętości próbki z górnej części probówek ultrawirówek z gradientami sacharozy.

Ostrożnie załaduj 500 mikrolitrów lizatu na wierzch. Umieść rurki w wiadrach wirnika i wyważ je. Wirować w temperaturze 260 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Frakcjonowanie polisomów i pobieranie próbek. Po ultraodwirowaniu umieść probówki w wiadrach wirnika na lodzie. Włącz kolektor frakcji i frakcjonator.

Kliknij przycisk Skanuj w menu frakcjonatora. Umieść stojak z probówkami zbiorczymi do kolektora frakcji. Napełnij zbiornik do płukania z boku frakcjonatora wodą dejonizowaną.

Naciśnij przycisk płukania przez dziesięć sekund, aby przepłukać pompę. Podłączyć adapter do płukania ze strzykawką wypełnioną wodą do tłoka w celu kalibracji. Otwórz oprogramowanie frakcjonatora na komputerze.

Naciśnij przycisk kalibruj. Użyć ustawienia domyślnego i nacisnąć przycisk Ok.Be gotowy do wstrzyknięcia wody ze strzykawki. Naciśnij przycisk OK, aby przeprowadzić kalibrację.

Natychmiast rozpocznij wstrzykiwanie wody przez następne pięć sekund. Pojawi się znak Kalibracja zera zakończona. Wyjmij adapter do płukania ze strzykawką i przymocuj końcówkę do tłoka frakcjonatora.

Otwórz mosiężny zawór powietrza i naciśnij powietrza przez dziesięć sekund, aby wysuszyć rurę przewodzącą powietrze i komórkę przepływową. Zamknij zawór powietrza. Wyjmij rurkę gradientową z wiadra wirnika i umieść ją w stojaku.

Nałóż nasadkę uchwytu probówki na górną część probówki i ostrożnie wsuń rurkę do uchwytu probówki i zablokuj ją. Umieść uchwyt pod tłokiem. Często pasma polisomalne można zobaczyć gołym okiem.

Wprowadź żądane ustawienia liczb ułamkowych i objętości. Nazwij plik i naciśnij OK, a następnie przejdź do przycisku wykresu. W następnym oknie naciśnij Rozpocznij skanowanie.

Pojawią się ustawienia i naciśnij Ok.Kolektor przesunie się od rynny do pierwszej frakcji, a tłok wsunie się do rury. Gdy tłok dotrze do szczytu gradientu, zwolni do wybranej prędkości, a ułamki zostaną zebrane. Zwykle zbieramy 24 frakcje po 500 mikrolitrów każda.

Po zakończeniu tłok wysunie się z rury gradientowej. Otwórz mosiężny zawór powietrza. Naciśnij powietrza na frakcjonowniku, aby pobrać ostatnią frakcję.

Na końcu biegu zobaczysz profil absorbancji gradientu. Analiza frakcji. Otrzymane frakcje można wykorzystać do analizy RNA i białek.

RNA może być analizowane za pomocą elektroforezy, a następnie Northern Blot lub wykorzystywane do produkcji cDNA, a następnie reakcji RT-qPCR w celu analizy asocjacji poszczególnych mRNA z polisomami. Sekwencjonowanie nowej generacji może być wykorzystane do analizy statusu translacji mRNA w skali transkryptomu. Do analizy białek frakcji polisomalnych białka wytrąca się kwasem triklorycemidowym w celu ich zagęszczenia.

Następnie białka są analizowane za pomocą Western Blotting lub Mass Spec na poziomie proteomu. Wyniki. W tym miejscu przedstawiamy wyniki frakcjonowania i analizy polisomów na przykładach trzech organizmów. Leishmania, hodowane komórki ludzkie i tkanka myszy.

Frakcjonowanie polisomów wykorzystano do zbadania związku mRNA Sherpa i tubuliny z rybosomami podczas translacji i Leishmania major. Wykres absorbancji dla frakcjonowania ma wyraźny kształt z typowymi pikami dla podjednostek rybosomów 40S i 60S, monosomów 80S i polisomów. Podwielokrotności ułamków połączono w trzy grupy.

Pre-polissomy, lekkie polisomy i ciężkie polissomy. Względne poziomy mRNA badano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Dane sugerują, że mRNA tubuliny ulega aktywnej translacji.

Ponieważ kojarzył się głównie z ciężkimi i lekkimi polisomami. Podczas gdy translacja mRNA Sherp jest mniej aktywna. Stwierdzono go głównie w połączeniu z pre-polisomami i lekkimi polisomami.

Tak więc eksperyment ten wyraźnie pokazuje zdolność tej techniki do badania indywidualnego zaangażowania mRNA w translację. Rysunek ten przedstawia typowy wykres absorbancji frakcjonowania polisomów komórek HeLa. Białka zagęszczono przez wytrącanie 10% kwasem trichlorooctowym.

Małe podjednostkowe białko rybosomalne RPS6 i duże podjednostkowe białko rybosomalne RPL11 wykryto za pomocą Western Blot. Ich rozkład dobrze korelował z wyraźnymi pikami w widmie absorbancji. Na tym rysunku przedstawiamy przykład wykrywania rybosomalnego RNA za pomocą elektroforezy we frakcjonowanych polisomach z jądra myszy. Wnioski.

Profilowanie polisomalne to wszechstronna technika, którą można wykorzystać do analizy stanu translacyjnego poszczególnych mRNA, badania białek związanych z rybosomami i badania regulacji translacyjnej w różnych organizmach modelowych w różnych warunkach.