Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Cześć, nazywam się Cecile. Pracuję w LGBP w Marsylii. Protokół, który opiszemy w tym filmie, to prosta metoda izolacji polisomów i monosomów z różnych tkanek roślinnych w celu zidentyfikowania aktywnie translacyjnych mRNA oraz zbadania regulacji translacji.

W ramach przykładu zaprezentujemy izolację polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis thaliana, następującą izolację RNA oraz analizę wyników. Wysiej nasiona na płytkę i pozostaw je na dwa dni w temperaturze 4 °C. Następnie hoduj rośliny przez sześć dni.

Zebrać siewki i rozdrobnić je w ciekłym azocie. Odważyć 300 mg proszku roślinnego i dodać 2,4 ml buforu do polysomów. Wirować w celu osadzenia fragmentów rośliny, a następnie nanieść nadsącz na górę gradientu sacharozy.

Następnie przeprowadź ultrawirowanie gradientu, zbierając go od dołu do góry przy ciągłym pomiarze OD. Rozdziel frakcje na polisomy, monosomy i nadsącz, a następnie przeprowadź nocne wytrącanie RNA. Poddaj próbki ultrawirowaniu, resuspenduj osad i wyekstrahuj RNA do dalszych analiz. Na kilka dni przed wykonaniem profilowania polisomów przygotuj gradient sacharozy.

Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach 50%, 35% i 20% i przechowywać je w temperaturze czterech stopni. Nalać warstwę 50% sacharozy. Zamrozić ją w zamrażarce w temperaturze minus 40 stopni.

Po sześciu godzinach dodaj warstwę 35% i zamroź ją w zamrażarce w temperaturze -40°C przez noc. Wlej pierwszą warstwę 20% i zamroź ją. W dniu eksperymentu wyjmij z zamrażarki odpowiednią liczbę gradientów.

Dodaj ostatnią warstwę 20% sacharozy i pozwól gradientom rozmrozić się w pomieszczeniu chłodniczym. Przygotuj próbkę z niedawno zebranych roślin. W tym przypadku wykorzystujemy sześciodniowe siewki Arabidopsis thaliana.

Zebrać rośliny zamrożone w ciekłym azocie i dokładnie je rozetrzeć. Odważyć 300 mg proszku roślinnego. Szybko dodać 2,4 ml świeżego buforu do polisomów i homogenizować.

Przenieś roztwór pipetą do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Odwiruj ekstrakt cytozolowy. Pobierz nadsącz za pomocą pipety.

Należy uważać, aby nie wprowadzić fragmentów roślin, ponieważ mogłyby one zakłócić profil w następnym kroku. Naniesienie supernatantu na gradient sacharozy należy przeprowadzić w sposób, który nie naruszy struktury gradientu.

Umieść gradient w koszyku wirnika SW 41. Wiruj w wirówce. Aby zwizualizować profil polisomów i zebrać frakcje, stosujemy prosty układ składający się z rurki kapilarnej zanurzonej w gradiencie. Jest ona połączona z kuwetą UV.

Urządzenie jest połączone z pompą perystaltyczną. Spektrofotometr UV stale rejestruje wartość OD w miarę przesuwania się gradientu przez kuwetę. Kolektor frakcji umożliwia zbieranie frakcji o objętości dwóch mililitrów.

Wyczyść kuwetę i umieść ją w spektrofotometrze. Ostrożnie przenieś gradient z naczynia, aby go nie zakłócić. Chlorofile muszą pozostać skoncentrowane w górnej części gradientu.

Zanurz rurki kapilarne do dna gradientu. Uruchom pompę perystaltyczną. Gradient jest zbierany od dołu do góry, a wartość OD jest odczytywana w sposób ciągły.

Zbierane są frakcje o objętości 2 mL. Przedstawiony jest kształt klasycznego profilu. Wytrącanie RNA przeprowadza się przy użyciu chlorku guanydyny i izopropanolu.

Najpierw wlej jedną objętość chlorku guanidynium do probówki o pojemności 50 ml, a następnie dodaj frakcję. Następnie dodaj 1,5 objętości izopropanolu i 50 µg odpowiedniego nośnika. RNA wytrąć przez noc w temperaturze -20 °C.

Przenieś frakcje do 40 mililitrowych probówek do ultrawirówki i zrównoważ probówkę izopropanolem. Wirować. Usuń nadsącz i wysusz osad na powietrzu. Resuspenduj osad w 200 mikrolitrach ciepłego buforu TE.

Następnie przeprowadź dalszą ekstrakcję RNA, stosując klasyczną ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Poniżej przedstawiono reprezentatywny profil ekstraktu polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis. Główny pik odpowiada monosomowi, czyli mRNA związanemu z pojedynczym rybosomem.

Pierwsza część profilu odpowiada frakcjom polisomalnym, a mianowicie mRNA powiązanemu z wieloma rybosomami. Każdy pik odpowiada przyłączeniu kolejnego rybosomu do mRNA. Ostatnia część profilu odpowiada tak zwanej frakcji nadsączu, która zawiera wolne podjednostki rybosomalne oraz RNA.

Duża ilość podjednostek 60S tworzy „ramię” obok piku monosomów. Aby ocenić ich integralność, RNA wyekstrahowane z frakcji można poddać elektroforezie na klasycznym żelu agarozowym przed wykorzystaniem w dalszych eksperymentach. Protokół ten zastosowaliśmy do izolacji polisomów z siewek Arabidopsis thaliana, a także z młodych i starych rozet, jak również z liści Nicotiana benthamiana, pomidora i ryżu, zatem powinien on sprawdzać się w przypadku szerokiego zakresu roślin i tkanek.

Oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy, a także do identyfikacji małych RNA związanych z frakcjami polisomalnymi.