Łatwa metoda profilowania polisomów roślin
August 28th, 2016
Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.
Cześć, jestem Cecile. Pracuję w organizacji LGBP w Marsylii. Protokół, który zamierzamy opisać w tym filmie, jest prostą metodą izolowania polisosomów i monosomów z różnych tkanek roślinnych w celu identyfikacji mRNA, które są aktywnie ulegające translacji i zbadania regulacji translacji.
Jako przykład pokażemy izolację polisomów z sześciodniowych siewek rzodkiewnika pospolitego, późniejszą izolację RNA i analizę wyników. Zasiej nasiona na talerzu i pozostaw je na dwa dni w temperaturze czterech stopni. Następnie hoduj rośliny przez sześć dni.
Zbierz sadzonkę i zmiel ją w ciekłym azocie. Odważ 300 miligramów proszku roślinnego i dodaj 2,4 mililitra buforu polisomowego. Odwirować w celu zebrania fragmentów roślin i załadowania supernatantu na wierzch gradientu sacharozy.
Gradient ultra-wirówki, a następnie zbieraj go od dołu do góry z ciągłym odczytem OD. Wciągnij frakcję do frakcji polisomowej, monosomu i supernatantu i wytnij RNA przez noc. Ultra-wirówka, ponowne zaparcie osadu i ekstrakcja RNA do późniejszej analizy. Na kilka dni przed wykonaniem profilowania polisomów należy przygotować gradient sacharozy.
Przygotuj 50, 35 i 20% roztwór sacharozy i utrzymuj je w temperaturze czterech stopni. Wlej warstwę 50% sacharozy. Zamroź go w zamrażarce minus 40.
Po sześciu godzinach dodaj warstwę 35% i zamroź ją w zamrażarce minus 40 przez noc. Wlej pierwsze 20% warstwy i zamroź ją. W dniu eksperymentu wyjmij z zamrażarki niezbędną liczbę gradientów.
Dodaj ostatnią warstwę 20% sacharozy i pozwól gradientom rozmrozić się w zimnym pomieszczeniu. Przygotuj próbkę, którą świeżo zebraliśmy roślinę. Tutaj używamy sześciodniowych sadzonek Arabidopsis thaliana.
Zbierz rośliny zamrożone ciekłym azotem i dokładnie je zmielić. Waga 300 miligramów proszku roślinnego. Szybko dodaj 2,4 mililitra świeżego buforu polisomowego i homogenizuj.
Odpipetować roztwór do dwóch probówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować ekstrakt cytozolowy. Odpipetować supernatant.
Uważaj, aby uniknąć fragmentu rośliny. W następnym kroku zepsuliby profil. Załadować supernatant na gradient sacharozy, nie zakłócając gradientu.
Umieść nachylenie w wiadrze z wirnikiem SW 41. Wirówka. Aby zobrazować profil polisomu i zebrać frakcję, używamy prostego systemu wykonanego z rurki kapilarnej, która zanurza się w gradiencie. Jest on połączony z kuwetą UV.
Jest on samodzielnie podłączony do pompy perystaltycznej. Spektrofotometr UV rejestruje w sposób ciągły średnicę zewnętrzną w miarę postępu gradientu przez kuwetę. Kolektor frakcji umożliwia pobranie dwóch frakcji mililitrowych.
Wyczyść kuwetę i umieść ją w spektrofotometrze. Usuń nachylenie z wiadra, nie zakłócając go. Chlorofile muszą być skoncentrowane na szczycie gradientu.
Zanurz rurki kapilarne na dnie gradientu. Uruchomić pompę perystaltyczną. Gradient jest zbierany od dołu do góry, a OD jest odczytywany w sposób ciągły.
Zbierane są dwie frakcje mililitrowe. Oto kształt klasycznego profilu. Wytrącanie RNA odbywa się przy użyciu chlorowodorku guanidyny i izopropanolu.
Najpierw wlej jedną objętość chlorowodorku guanidyny do 50-mililitrowej probówki, a następnie dodaj frakcję. Następnie dodaj 1,5 objętości izopropanolu i 50 mikrogramów równego kuriera. Wytrącić RNA przez noc w temperaturze minus 20 stopni.
Przenieś frakcje do 40-mililitrowych ultra-probówek wirówkowych i zrównoważ probówkę izopropanolem. Wirówka. Usunąć supernatant i wysuszyć osad na powietrzu. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach ciepłego bufora TE.
Dalej ekstrahować RNA, wykonując klasyczną ekstrakcję chloroformem fenolowym. Reprezentatywny profil ekstraktu polisomów z sześciodniowej siewki rzodkiewnika przedstawiono tutaj. Główny pik odpowiada monosomowi, mRNA, które jest związane z pojedynczym rybosomem.
Pierwsza część profilu odpowiada frakcjom polisomalnym, a mianowicie mRNA związanym z wieloma rybosomami. Każdy pik pasuje do asocjacji nowego rybosomu z mRNA. Ostatnia część profilu odpowiada tzw. frakcji supernatantowej, która zawiera wolne podjednostki rybosomalne i RNA.
Duża ilość podjednostki 60S tworzy ramię obok piku monosomu. Aby ocenić ich integralność, RNA wyekstrahowane z frakcji można uruchomić na klasycznym żelu Aragose przed użyciem do dalszych eksperymentów. Zastosowaliśmy ten protokół do wyizolowania polisomów z siewek Arabidopsis thaliana, ale także z młodych i starych rozet, a także z Nicotiana benthamiana, liści pomidora i ryżu, więc powinien działać z szeroką gamą roślin i tkanek.
Oczyszczone RNA są kompatybilne z analizą mikromacierzową, a także do identyfikacji małych RNA związanych z frakcjami polisomalnymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje prostą metodę izolacji polisomów i monodomów z tkanek roślinnych, umożliwiającą identyfikację aktywnie tłumaczone mRNA i badanie regulacji translacji. Przykład, który jest przedstawiony, koncentruje się na izolacji polisomów z sześcydniowych siewek Arabidopsis thaliana.
Kluczowe Składowe Badania
Dział Badawczy
- Biologia roślin
- Regulacja translacji
- Analiza mRNA
Wprowadzenie
- Zrozumienie aktywności translacji jest kluczowe dla badania ekspresji genów.
- Polisomy to skupiska rybosomów tłumaczących mRNA, podczas gdy monosomy to pojedyncze rybosomy.
- Ta metoda zapewnia wgląd w stan translacyjny konkretnych mRNA.
- Arabidopsis thaliana służy jako organizm modelowy w badaniach roślin.
Cel Badania
- Izolacja polisomów i monodomów z tkanek roślinnych.
- Identyfikacja mRNA, które są aktywnie tłumaczone.
- Badanie regulacji translacji u roślin.
Wykorzystane Metody
- Siew nasion na płytkach i poddawanie ich stratyfikacji na zimno przez dwa dni.
- Uprawa siewek przez sześć dni w optymalnych warunkach.
- Izolacja polisomów i monodomów z tkanek roślinnych.
- Analiza RNA w celu określenia aktywności translacji.
Główne Wyniki
- Pomyślna izolacja polisomów z siewek Arabidopsis thaliana.
- Identyfikacja aktywnie tłumaczone mRNA.
- Wgląd w regulację translacji w tkankach roślinnych.
- Demonstracja skuteczności metody w badaniu translacji.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania translacji u roślin.
- Udoskonala zrozumienie regulacji ekspresji genów.
- Podejście to może być stosowane do różnych gatunków roślin.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
