Name: Łatwa metoda profilowania polisomów roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj prostą metodę izolacji polisomów i monosomów z tkanek roślinnych w celu identyfikacji aktywnie translowanych mRNA i badania regulacji translacji u Arabidopsis thaliana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-14-CE02-0010). Dziękujemy dr Benjaminowi Fieldowi i dr Elodie Lanet za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Panu Michelowi Terese za pomoc w edycji wideo.

1. Przygotowanie gradientów sacharozy o stężeniu od 20 do 50% (m/v)
Uwaga: Gradienty składają się z 4 warstw sacharozy (50%, 35% oraz 2 warstw 20%) w probówce do ultrawirówki o pojemności 13,2 ml. Z naszego doświadczenia wynika, że nalewanie 20% sacharozy w dwóch oddzielnych warstwach znacznie poprawia jakość preparatów polisomów.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory stokowe. Należy upewnić się, że wszystkie roztwory są wolne od RNaz i DNaz.
	<ol>
		<li>Przygotować 10X roztwór soli: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl oraz 100 mM MgCl2.</li>
		<li>Przygotować 2 M roztwór sacharozy: aby otrzymać 200 ml, rozpuścić 137 g sacharozy w 1X roztworze soli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór sacharozy w roztworze soli zgodnie z opisem w Tabeli 1, aby przygotować gradienty. Podane objętości dotyczą sześciu gradientów.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Końcowe stężenie sacharozy</td>
			<td>Sacharoza 2M (ml)</td>
			<td>Roztwór soli 1X (ml)</td>
			<td>Obj. końcowa (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50%</td>
			<td>8.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35%</td>
			<td>12.9</td>
			<td>12.1</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20%</td>
			<td>7.4</td>
			<td>17.6</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20%</td>
			<td>5.8</td>
			<td>14.2</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Rozcieńczenia roztworu sacharozy w celu przygotowania sześciu gradientów.
<ol start="3">
	<li>Nalej warstwy zgodnie z Tabelą 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Warstwa sacharozy</td>
			<td>50%</td>
			<td>35%</td>
			<td>20%</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obj. (ml)</td>
			<td>1.85</td>
			<td>3.65</td>
			<td>3.65</td>
			<td>1.35</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Objętość roztworu sacharozy na warstwę.
<ol start="4">
	<li>Po nalaniu każdej warstwy należy przechowywać probówki w zamrażarce o temperaturze -40 °C lub -80 °C aż do całkowitego zamrożenia, przed dodaniem kolejnej warstwy sacharozy. Zamrożenie następuje zazwyczaj po 2 hr w -40 °C, jednak zaleca się odczekanie około 6 hr przed nalaniem następnej warstwy. Ostatnią warstwę 20% można zamrozić lub dodać na świeżo w dniu eksperymentu. 
	Uwaga: Zamrażanie każdej warstwy przed dodaniem kolejnej zapobiega mieszaniu lub zaburzeniu granic warstw. Gradienty można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -40 °C lub -80 °C przez co najmniej sześć miesięcy.</li>
	<li>Jeśli nie zostało to jeszcze zrobione, należy dodać ostatnią warstwę 20% do gradientów w dniu eksperymentu. Następnie należy pozwolić gradientom rozmrozić się w chłodni lub lodówce.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów cytozolowych
Uwaga: Zalecamy stosowanie dwóch gradientów na jedną próbkę biologiczną. 300 mg to optymalna ilość materiału roślinnego do przygotowania dwóch gradientów podczas pracy z 6-dniowymi siewkami Arabidopsis thaliana. W przypadku pracy z tkankami o mniejszej aktywności translacyjnej ilość materiału roślinnego można zwiększyć do 600 mg.
<ol>
	<li>Zebrać sześcio-dniowe siewki hodowane na pożywce ½ Murashige and Skoog8 uzupełnionej o 1% sacharozy lub pożywkach równoważnych poprzez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie</li>
	<li>Rozetrzeć materiał roślinny w schłodzonym moździerzu z tłuczkiem przy użyciu ciekłego azotu.</li>
	<li>Odważyć 300 mg sproszkowanego materiału do schłodzonej łódki wagowej. Krok ten należy wykonać szybko, aby uniknąć rozmrożenia próbki. 
	Uwaga: Zamrożone próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C nie dłużej niż przez jeden tydzień.</li>
	<li>Dodać 2,4 ml schłodzonego buforu do polisomów (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v/v) Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched, 50 µg.ml-1 cykloheksymidu, 50 µg.ml1 chloramfenikolu) i homogenizować poprzez mieszanie końcówką pipety. Przenieść do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Pracować szybko, aby zapobiec ogrzaniu się próbek.</li>
	<li>Wirować w mikrowirówce przy 16,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych. 
	Uwaga: Aby zapobiec degradacji RNA, próbki należy zawsze utrzymywać w temperaturze 4°C, stosować roztwory wolne od RNaz/DNaz i pracować w warunkach wolnych od RNaz/DNaz. Do buforu do polisomów można dodać heparynę do stężenia końcowego 300 µg.ml-1, aby zwiększyć ochronę RNA. Jednakże, ponieważ heparyna może zakłócać dalsze analizy, musi zostać usunięta podczas etapu precypitacji RNA poprzez przeprowadzenie precypitacji chlorkiem litu zamiast precypitacji etanolem (patrz uwaga 4.7).</li>
</ol>
3. Profilowanie polisomów
<ol>
	<li>Ostrożnie odpipetować supernatant, nie naruszając pelletu. Jeśli odpipetowano fragmenty roślin, powtórzyć krok 2.5. Nałożyć supernatant na gradient, delikatnie pipetując go na ściankę probówki w jednostajnym strumieniu. Użyć jednego gradientu dla każdej probówki 1,5 ml.</li>
	<li>Przenieść do schłodzonych wcześniej koszy i wirować w ultrawiroworce przy 175 000 x g przez 2 godz. 45 min w temperaturze 4 °C (np. 32 000 rpm przy użyciu rotora SW41).</li>
	<li>Przygotować system zbierania frakcji gradientu zgodnie z opisem na Rysunku 1. Kuweta UV ma długość drogi optycznej 1 mm.</li>
</ol>
<img alt="Schemat chromatografii: układ spektrofotometru, UV przy 260 nm, pompa perystaltyczna, kolektor frakcji." src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. System zbierania gradientu.Kuweta UV jest połączona za pomocą rurek z polichlorku winylu z szklaną rurką kapilarną, która schodzi do dna gradientu. Gradient przemieszcza się przez układ dzięki pompie perystaltycznej. Wartość OD260 jest odczytywana w sposób ciągły, a zbierane są frakcje o objętości 2 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Ustaw kolektor frakcji w temperaturze pokojowej (RT) i dostosuj prędkość karuzeli tak, aby umożliwić zbieranie frakcji o objętości 2 ml. Użyj schłodzonych wcześniej probówek do zbierania frakcji.</li>
	<li>Zbieraj frakcje od dołu do góry, używając szklanej kapilary połączonej rurką z polichlorku winylu z systemem zbierania gradientu. Do zabezpieczenia połączenia między rurką z polichlorku winylu a szklaną kapilarą użyj plastikowej folii parafinowej.</li>
	<li>Zmierz absorbancję przy 260 nm od dołu do góry gradientu. Po zebraniu całego gradientu umieść probówki na lodzie przed ekstrakcją RNA.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Zgrupuj frakcje zebrane z dwóch gradientów w 50 ml zakręcanych probówkach do wirowania w następujący sposób: 
	Polizomy: frakcje od 1 do 3 (12 ml) 
	Monosomy: frakcja 4 (4 ml) 
	 supernatant: frakcje 5 i 6 (8 ml)</li>
	<li>Do każdej frakcji dodaj 1 obj. 8M chlorku guanydyny, 50 µg nośnika akrylowego oraz 1,5 obj. izopropanolu. 
	Uwaga: Nośnik akrylowy to liniowa akrylamida, stosowana jako koprecypitant w celu poprawy odzysku kwasów nukleinowych podczas wytrącania alkoholem.</li>
	<li>Wymieszaj poprzez odwracanie probówek i wytrącaj przez noc (O/N) w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wirowanie przeprowadź przy 175 000 x g przez 1 h w 4 °C w ultrawirowarce (32 000 rpm w rotorze SW32). Jeśli etap wytrącania odbywał się w probówce niekompatybilnej z ultrawirowaniem, przenieś zawartość do odpowiedniej probówki.</li>
	<li>Odlej supernatant i rozpuść osad w 200 µl buforu TE wolnego od RNaz (10 mM Tris-HCl pH 7,5 - 1 mM EDTA). Przenieś do nowej probówki 1,5 ml.</li>
	<li>Wyodrębnij RNA, dodając 1 obj. wody z nasyconym fenolem (pH 6,6) oraz 1 obj. chloroformu:alkoholu izoamylowego (24:1). Wymieszaj energicznie. Wirowanie przeprowadź przy 15 000 x g przez 20 min w 4 °C. Przenieś fazę wodną do nowej probówki 1,5 ml. 
	Uwaga: Aby zminimalizować zanieczyszczenie DNA, można zastosować fenol kwaśny (pH 4,5).</li>
	<li>Wytrącaj RNA, dodając 1/10 obj. 3 M octanu sodu i 3 obj. 100% etanolu. Pozostaw do wytrącenia w -80 °C przez 20 min lub przez noc (O/N) w -20 °C. Wirowanie przeprowadź przy 15 000 x g przez 15 min w 4 °C. 
	Uwaga: Jeśli w buforze do polizomów zastosowano heparynę (patrz uwaga 2.5), zamiast wytrącania etanolem przeprowadź wytrącanie chlorkiem litu (LiCl), aby skutecznie usunąć wszelkie ślady heparyny, która mogłaby zakłócić dalsze analizy9. Po ekstrakcji dodaj LiCl do końcowego stężenia 2,5 M. Pozostaw do wytrącenia przez 30 min w -20 °C lub przez noc (O/N) w 4 °C. Wirowanie przeprowadź przy 15 000 x g przez 15 min w 4 °C.</li>
	<li>Przemyj osad 500 µl 75% etanolu. Osusz osad na powietrzu i rozpuść w 30 µl buforu TE. Oceń jakość RNA za pomocą elektroforezy na wolnym od RNaz 1,2% żelu agarozowym (100V, 15 min) lub metodami elektroforezy kapilarnej.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyeksportuj surowe dane do oprogramowania do analizy danych i grafiki. 
	Uwaga: Jak pokazano na Rysunku 2A i B, surowe profile dostarczają informacji jakościowych: liczby widocznych pików polisomów, wysokości piku monosomów oraz obecności ramienia odpowiadającego wolnym podjednostkom rybosomalnym.</li>
	<li>Połącz profile, aby umożliwić porównanie ich pomiędzy próbkami. Użyj narzędzia odczytu ekranowego, aby wyznaczyć wartość X piku monosomów dla każdej próbki, a następnie wyrównaj piki monosomów, usuwając nadmiarowe punkty danych na początku krzywych. Zidentyfikuj najniższy punkt krzywej i wyznacz jego wartość Y (za pomocą narzędzia odczytu ekranowego). Ustaw wartość Y najniższego punktu na 0, korzystając z funkcji „set columns value”.</li>
	<li>Wyznacz stosunek polisomów do monosomów poprzez całkowanie pola pod krzywą z surowych profili (Rysunek 3C). Użyj narzędzia wyboru danych, aby zdefiniować granicę obszaru do całkowania. Następnie użyj funkcji całkowania (Analiza-Matematyka).</li>
	<li>Znormalizuj krzywe względem piku monosomów, dzieląc wszystkie punkty danych krzywej przez wartość Y wierzchołka piku monosomów (wyznaczoną za pomocą narzędzia odczytu ekranowego). Wybierz kolumnę, a następnie w sekcji Analiza-Matematyka wybierz opcję Normalizuj i wybierz metodę „podzielone przez określoną wartość”. Ten krok umożliwia porównanie względnego poziomu polisomów (Rysunek 3D).</li>
</ol>
<img alt="Schemat profilowania polisomów z użyciem gradientu sacharozy; analiza translacji mRNA; rysunek zawiera wykresy." src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne profile polisomów. Siewki typu dzikiego (wt, ekotyp Col-0) oraz siewki mutantów Arabidopsis thaliana hodowano przez sześć dni na pożywce ½ Murashige and Skoog w warunkach długiego dnia (16 h światła, 8 h ciemności). A: surowe profile polisomów z siewek wt. B: surowe profile polisomów z siewek mutantów. C: Wyznaczenie procentowego udziału polisomów i monosomów poprzez całkowanie pola pod krzywą D: Profile polisomów znormalizowane względem piku monosomów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).</li>
<li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li>
<li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms%3A+30+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li>
<li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starting+the+protein+synthesis+machine%3A+eukaryotic+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li>
<li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Arabidopsis+protocols%22">Arabidopsis protocols</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).</li>
<li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+and+transcript+copy+numbers%2C+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+syst+biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).</li>
<li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li>
<li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li>
<li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngolia%2C+NT+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Przedstawiony przez nas protokół jest łatwą i tanią metodą generowania profili polisomowych i izolowania mRNA związanych z polisosomami, pojedynczymi rybosomami lub wolnymi od rybosomów. W literaturze opisano szeroki zakres różnych metod frakcjonowania polisomów. Opisana przez nas metoda została zoptymalizowana tak, aby zachować tylko niezbędne związki i została dostosowana do materiału roślinnego. W szczególności zmniejszyliśmy ilość detergentu11 i dodaliśmy chloramfenikol do buforu, aby związać rybosomy chlo...

Synteza białek jest niezbędnym i kosztownym energetycznie procesem we wszystkich komórkach 1. Przede wszystkim komórki muszą inwestować energię w produkcję maszynerii translacyjnej, rybosomów. Na przykład aktywnie dzieląca się komórka drożdży wytwarza nawet 2000 rybosomów na minutę. Taka produkcja wymaga do 60% całkowitej aktywności transkrypcyjnej i do 90% całkowitej aktywności splicingowej komórki 2. Ponadto energia jest potrzebna do syntezy aminokwasów, aminoacylo-tRNA i wiązań peptydowych. W roślinach dodanie jednego aminokwasu do łańcucha peptydowego kosztuje od 4,5 do 5,9 cząsteczki ATP 3. Dlatego nie jest zaskakujące, że translacja mRNA na białko jest głównym miejscem regulacji, szczególnie jeśli chodzi o radzenie sobie ze zmieniającymi się warunkami środowiskowymi.
Etap inicjacji translacji, czyli powiązanie mRNA z rybosomem, jest głównym celem regulacji translacji4. W wyniku regulacji translacji, jak również innych potranskrypcyjnych etapów regulacyjnych, tylko 40% zmian w stężeniu białka można wyjaśnić obfitością mRNA 5,6. Tak więc badanie całkowitego mRNA daje stosunkowo słabe informacje na temat obfitości białek. Z drugiej strony, powiązanie mRNA z rybosomami daje lepszy wgląd w obfitość białek, dając dostęp do tych mRNA, które biorą udział w translacji. Aktywnie ulegające translacji mRNA są związane z kilkoma rybosomami w strukturach zwanych polisomami. I odwrotnie, słabo translowane mRNA będą związane tylko z jednym rybosomem (monosomem). W związku z tym status translacyjny mRNA można ocenić, monitorując jego związek z rybosomami7.
Ten protokół opisuje izolację polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis thaliana, późniejszą izolację RNA i analizę wyników. Polisomy i monosomy są oddzielone gradientem gęstości sacharozy. Gradienty są zebrane w sześć frakcji. Niektóre frakcje są łączone w celu uzyskania trzech dobrze oddzielonych frakcji: polisomów, monosomów i frakcji lekkiej (zwanej dalej supernatantem), która zawiera wolne podjednostki rybosomalne 60S i 40S oraz mRNA, które nie są związane z rybosomami. Globalną aktywność translacyjną można oszacować, generując stosunek polisomów do monosomów, który jest określany przez całkowanie obszaru pod krzywą oraz przez porównanie profili polisomów. mRNA i białka są następnie ekstrahowane z różnych frakcji i wykorzystywane do analizy za pomocą RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, mikromacierzy, western blot lub proteomiki. Protokół ten został zatwierdzony dla innych roślin i tkanek.
Sprzęt wymagany do wykonania tego protokołu jest powszechnie spotykany w większości laboratoriów: Nie ma potrzeby korzystania z kreatora gradientów. Zamrożenie każdej warstwy przed dodaniem kolejnej zapobiega jakiemukolwiek mieszaniu się lub zakłóceniu warstw. Do zbierania gradientu nie używa się przekłuwacza do probówek, co można osiągnąć poprzez zanurzenie szklanej rurki kapilarnej w gradiencie. Dzięki temu kosztowne probówki do ultrawirówek pozostają nieuszkodzone i mogą być wielokrotnie używane. Podsumowując, sprawia to, że obecny protokół jest łatwą i tanią metodą profilowania polisomów.

<table><tbody><tr><td>Probówka do ultrawirówek, cienkościenna, poliallomer - 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do ultrawirówek, cienkościenna, polialomerowa - 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka&nbsp;</td>Wirnik ultrawirówkowy <td>Beckman Coulter</td><td>serii Optima</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rurka z polichlorku winylu Tygon R3607&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Rurka z polichlorku winylu, 2,29 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolektor frakcji Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta UV</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Kwarcowa kuweta przepływowa</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Odczyt co 0,0125 sekundy</td></tr><tr><td>Wszystkie chemikalia</td><td>Tylko</td><td></td><td>do użytku Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog Mieszanina soli bazalnej (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od rnazy</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oktylofenoksyetanol poli(etylenoksy)etanol, rozgałęziony (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy akryloamid (nośnik akrylowy)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>Nośnik wytrącania RNA</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>Oprogramowanie analityczne</td> <td>OriginLab</td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translacja mRNA na białko jest podstawowym i wysoce regulowanym procesem biologicznym. Profilowanie polisomów jest uważane za złoty standard w analizie regulacji translacyjnej. Opisana tutaj metoda to łatwy i ekonomiczny sposób frakcjonowania polisomów z różnych tkanek roślinnych. Gradient sacharozy jest wytwarzany bez potrzeby stosowania kreatora gradientu poprzez sekwencyjne zamrażanie każdej warstwy. Ekstrakty cytozolowe są następnie przygotowywane w buforze zawierającym cykloheksymid i chloramfenikol w celu unieruchomienia rybosomów cytozolowych i chloroplastycznych do mRNA i są ładowane na gradient sacharozy. Po odwirowaniu sześć frakcji jest zbieranych bezpośrednio od dołu do góry gradientu, bez przebijania probówki do ultrawirówki. Podczas zbierania absorbancja przy 260 nm jest odczytywana w sposób ciągły w celu wygenerowania profilu polisomowego, który daje obraz globalnej aktywności translacyjnej. Frakcje są następnie łączone w celu przygotowania trzech różnych populacji mRNA: polisomów, mRNA związanych z kilkoma rybosomami; monosomy, mRNA związane z jednym rybosomem; i mRNA, które nie są związane z rybosomami. Następnie ekstrahuje się mRNA. Protokół ten został zatwierdzony dla różnych roślin i tkanek, w tym siewek Arabidopsis thaliana i roślin dorosłych, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum i liści Oryza sativa.

W literaturze profile polisomów są często przedstawiane od frakcji lekkiej do ciężkiej, co wynika ze sposobu zbierania gradientów, tj. od góry do dołu. Ponieważ w opisanym tutaj protokole gradienty są zbierane od dołu do góry, prezentowane przez nas profile zaczynają się od frakcji ciężkiej (polisomów) i przechodzą do frakcji lekkiej (wolnych podjednostek rybosomalnych i RNA) (Rysunek 2A). Następnie każdy gradient zbieramy w sześciu frakcjach o objętości 2 ml, jednak możn...

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Cześć, nazywam się Cecile. Pracuję w LGBP w Marsylii. Protokół, który opiszemy w tym filmie, to prosta metoda izolacji polisomów i monosomów z różnych tkanek roślinnych w celu zidentyfikowania aktywnie translacyjnych mRNA oraz zbadania regulacji translacji.W ramach przykładu zaprezentujemy izolację polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis thaliana, następującą izolację RNA oraz analizę wyników. Wysiej nasiona na płytkę i pozostaw je na dwa dni w temperaturze 4 °C. Następnie hoduj rośliny przez sześć dni.Zebrać siewki i rozdrobnić je w ciekłym azocie. Odważyć 300 mg proszku roślinnego i dodać 2,4 ml buforu do polysomów. Wirować w celu osadzenia fragmentów rośliny, a następnie nanieść nadsącz na górę gradientu sacharozy.Następnie przeprowadź ultrawirowanie gradientu, zbierając go od dołu do góry przy ciągłym pomiarze OD. Rozdziel frakcje na polisomy, monosomy i nadsącz, a następnie przeprowadź nocne wytrącanie RNA. Poddaj próbki ultrawirowaniu, resuspenduj osad i wyekstrahuj RNA do dalszych analiz. Na kilka dni przed wykonaniem profilowania polisomów przygotuj gradient sacharozy.Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach 50%, 35% i 20% i przechowywać je w temperaturze czterech stopni. Nalać warstwę 50% sacharozy. Zamrozić ją w zamrażarce w temperaturze minus 40 stopni.Po sześciu godzinach dodaj warstwę 35% i zamroź ją w zamrażarce w temperaturze -40°C przez noc. Wlej pierwszą warstwę 20% i zamroź ją. W dniu eksperymentu wyjmij z zamrażarki odpowiednią liczbę gradientów.Dodaj ostatnią warstwę 20% sacharozy i pozwól gradientom rozmrozić się w pomieszczeniu chłodniczym. Przygotuj próbkę z niedawno zebranych roślin. W tym przypadku wykorzystujemy sześciodniowe siewki Arabidopsis thaliana.Zebrać rośliny zamrożone w ciekłym azocie i dokładnie je rozetrzeć. Odważyć 300 mg proszku roślinnego. Szybko dodać 2,4 ml świeżego buforu do polisomów i homogenizować.Przenieś roztwór pipetą do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Odwiruj ekstrakt cytozolowy. Pobierz nadsącz za pomocą pipety.Należy uważać, aby nie wprowadzić fragmentów roślin, ponieważ mogłyby one zakłócić profil w następnym kroku. Naniesienie supernatantu na gradient sacharozy należy przeprowadzić w sposób, który nie naruszy struktury gradientu.Umieść gradient w koszyku wirnika SW 41. Wiruj w wirówce. Aby zwizualizować profil polisomów i zebrać frakcje, stosujemy prosty układ składający się z rurki kapilarnej zanurzonej w gradiencie. Jest ona połączona z kuwetą UV.Urządzenie jest połączone z pompą perystaltyczną. Spektrofotometr UV stale rejestruje wartość OD w miarę przesuwania się gradientu przez kuwetę. Kolektor frakcji umożliwia zbieranie frakcji o objętości dwóch mililitrów.Wyczyść kuwetę i umieść ją w spektrofotometrze. Ostrożnie przenieś gradient z naczynia, aby go nie zakłócić. Chlorofile muszą pozostać skoncentrowane w górnej części gradientu.Zanurz rurki kapilarne do dna gradientu. Uruchom pompę perystaltyczną. Gradient jest zbierany od dołu do góry, a wartość OD jest odczytywana w sposób ciągły.Zbierane są frakcje o objętości 2 mL. Przedstawiony jest kształt klasycznego profilu. Wytrącanie RNA przeprowadza się przy użyciu chlorku guanydyny i izopropanolu.Najpierw wlej jedną objętość chlorku guanidynium do probówki o pojemności 50 ml, a następnie dodaj frakcję. Następnie dodaj 1,5 objętości izopropanolu i 50 µg odpowiedniego nośnika. RNA wytrąć przez noc w temperaturze -20 °C.Przenieś frakcje do 40 mililitrowych probówek do ultrawirówki i zrównoważ probówkę izopropanolem. Wirować. Usuń nadsącz i wysusz osad na powietrzu. Resuspenduj osad w 200 mikrolitrach ciepłego buforu TE.Następnie przeprowadź dalszą ekstrakcję RNA, stosując klasyczną ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Poniżej przedstawiono reprezentatywny profil ekstraktu polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis. Główny pik odpowiada monosomowi, czyli mRNA związanemu z pojedynczym rybosomem.Pierwsza część profilu odpowiada frakcjom polisomalnym, a mianowicie mRNA powiązanemu z wieloma rybosomami. Każdy pik odpowiada przyłączeniu kolejnego rybosomu do mRNA. Ostatnia część profilu odpowiada tak zwanej frakcji nadsączu, która zawiera wolne podjednostki rybosomalne oraz RNA.Duża ilość podjednostek 60S tworzy „ramię” obok piku monosomów. Aby ocenić ich integralność, RNA wyekstrahowane z frakcji można poddać elektroforezie na klasycznym żelu agarozowym przed wykorzystaniem w dalszych eksperymentach. Protokół ten zastosowaliśmy do izolacji polisomów z siewek Arabidopsis thaliana, a także z młodych i starych rozet, jak również z liści Nicotiana benthamiana, pomidora i ryżu, zatem powinien on sprawdzać się w przypadku szerokiego zakresu roślin i tkanek.Oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy, a także do identyfikacji małych RNA związanych z frakcjami polisomalnymi.

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Poznaj prostą metodę izolacji polisomów i monosomów z tkanek roślinnych w celu identyfikacji aktywnie translowanych mRNA i badania regulacji translacji u Arabidopsis thaliana.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Przeglądaj więcej filmów