Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Cześć, jestem Cecile. Pracuję w organizacji LGBP w Marsylii. Protokół, który zamierzamy opisać w tym filmie, jest prostą metodą izolowania polisosomów i monosomów z różnych tkanek roślinnych w celu identyfikacji mRNA, które są aktywnie ulegające translacji i zbadania regulacji translacji.

Jako przykład pokażemy izolację polisomów z sześciodniowych siewek rzodkiewnika pospolitego, późniejszą izolację RNA i analizę wyników. Zasiej nasiona na talerzu i pozostaw je na dwa dni w temperaturze czterech stopni. Następnie hoduj rośliny przez sześć dni.

Zbierz sadzonkę i zmiel ją w ciekłym azocie. Odważ 300 miligramów proszku roślinnego i dodaj 2,4 mililitra buforu polisomowego. Odwirować w celu zebrania fragmentów roślin i załadowania supernatantu na wierzch gradientu sacharozy.

Gradient ultra-wirówki, a następnie zbieraj go od dołu do góry z ciągłym odczytem OD. Wciągnij frakcję do frakcji polisomowej, monosomu i supernatantu i wytnij RNA przez noc. Ultra-wirówka, ponowne zaparcie osadu i ekstrakcja RNA do późniejszej analizy. Na kilka dni przed wykonaniem profilowania polisomów należy przygotować gradient sacharozy.

Przygotuj 50, 35 i 20% roztwór sacharozy i utrzymuj je w temperaturze czterech stopni. Wlej warstwę 50% sacharozy. Zamroź go w zamrażarce minus 40.

Po sześciu godzinach dodaj warstwę 35% i zamroź ją w zamrażarce minus 40 przez noc. Wlej pierwsze 20% warstwy i zamroź ją. W dniu eksperymentu wyjmij z zamrażarki niezbędną liczbę gradientów.

Dodaj ostatnią warstwę 20% sacharozy i pozwól gradientom rozmrozić się w zimnym pomieszczeniu. Przygotuj próbkę, którą świeżo zebraliśmy roślinę. Tutaj używamy sześciodniowych sadzonek Arabidopsis thaliana.

Zbierz rośliny zamrożone ciekłym azotem i dokładnie je zmielić. Waga 300 miligramów proszku roślinnego. Szybko dodaj 2,4 mililitra świeżego buforu polisomowego i homogenizuj.

Odpipetować roztwór do dwóch probówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować ekstrakt cytozolowy. Odpipetować supernatant.

Uważaj, aby uniknąć fragmentu rośliny. W następnym kroku zepsuliby profil. Załadować supernatant na gradient sacharozy, nie zakłócając gradientu.

Umieść nachylenie w wiadrze z wirnikiem SW 41. Wirówka. Aby zobrazować profil polisomu i zebrać frakcję, używamy prostego systemu wykonanego z rurki kapilarnej, która zanurza się w gradiencie. Jest on połączony z kuwetą UV.

Jest on samodzielnie podłączony do pompy perystaltycznej. Spektrofotometr UV rejestruje w sposób ciągły średnicę zewnętrzną w miarę postępu gradientu przez kuwetę. Kolektor frakcji umożliwia pobranie dwóch frakcji mililitrowych.

Wyczyść kuwetę i umieść ją w spektrofotometrze. Usuń nachylenie z wiadra, nie zakłócając go. Chlorofile muszą być skoncentrowane na szczycie gradientu.

Zanurz rurki kapilarne na dnie gradientu. Uruchomić pompę perystaltyczną. Gradient jest zbierany od dołu do góry, a OD jest odczytywany w sposób ciągły.

Zbierane są dwie frakcje mililitrowe. Oto kształt klasycznego profilu. Wytrącanie RNA odbywa się przy użyciu chlorowodorku guanidyny i izopropanolu.

Najpierw wlej jedną objętość chlorowodorku guanidyny do 50-mililitrowej probówki, a następnie dodaj frakcję. Następnie dodaj 1,5 objętości izopropanolu i 50 mikrogramów równego kuriera. Wytrącić RNA przez noc w temperaturze minus 20 stopni.

Przenieś frakcje do 40-mililitrowych ultra-probówek wirówkowych i zrównoważ probówkę izopropanolem. Wirówka. Usunąć supernatant i wysuszyć osad na powietrzu. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach ciepłego bufora TE.

Dalej ekstrahować RNA, wykonując klasyczną ekstrakcję chloroformem fenolowym. Reprezentatywny profil ekstraktu polisomów z sześciodniowej siewki rzodkiewnika przedstawiono tutaj. Główny pik odpowiada monosomowi, mRNA, które jest związane z pojedynczym rybosomem.

Pierwsza część profilu odpowiada frakcjom polisomalnym, a mianowicie mRNA związanym z wieloma rybosomami. Każdy pik pasuje do asocjacji nowego rybosomu z mRNA. Ostatnia część profilu odpowiada tzw. frakcji supernatantowej, która zawiera wolne podjednostki rybosomalne i RNA.

Duża ilość podjednostki 60S tworzy ramię obok piku monosomu. Aby ocenić ich integralność, RNA wyekstrahowane z frakcji można uruchomić na klasycznym żelu Aragose przed użyciem do dalszych eksperymentów. Zastosowaliśmy ten protokół do wyizolowania polisomów z siewek Arabidopsis thaliana, ale także z młodych i starych rozet, a także z Nicotiana benthamiana, liści pomidora i ryżu, więc powinien działać z szeroką gamą roślin i tkanek.

Oczyszczone RNA są kompatybilne z analizą mikromacierzową, a także do identyfikacji małych RNA związanych z frakcjami polisomalnymi.