Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w rozwoju mózgu. Profilowanie polisomów stanowi użyteczne i potężne narzędzie do oceny statusu translacyjnego mRNA, umożliwiając badanie funkcji kontroli translacyjnej podczas rozwoju mózgu. Ta metoda jest łatwym i tanim podejściem do tworzenia gradientów sacharozy i oceny frakcjonowania polisomów.

W tym protokole służy do analizy rozwijającej się kory myszy. Można go jednak łatwo dostosować do badania innych systemów. Zacznij od rozcieńczenia 2,2 molowej sacharozy, aby przygotować sześć gradientów sacharozy od 10 do 50%.

Napełnij 30-mililitrową strzykawkę około 16 mililitrami 10% sacharozy, umieść ją na pompie strzykawkowej i podłącz do igły. Upewnij się, że w strzykawce, rurki lub igle nie ma pęcherzyków powietrza i wytrzyj końcówkę igły, aby usunąć resztki roztworu. Przesuń zmotoryzowany stolik w górę tak, aby końcówka igły dotykała środka rurki na dole.

Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mililitrów na minutę dla objętości 2,3 mililitra. Po dozowaniu 2,3 mililitra 10% roztworu sacharozy, przejdź w dół etapu zmotoryzowanego i powtórz proces dla wszystkich sześciu gradientów. Następnie dodaj 20% roztwór sacharozy na dno probówek, a następnie 30, 40 i 50%Zbierz zarodki myszy CD1 w 12 dniu embrionalnym i umieść je na 10-centymetrowej płytce zawierającej lodowaty HBSS na lodzie.

W zakresie preparacji przenieś jeden zarodek na sześciocentymetrową płytkę zawierającą lodowaty HBSS. Użyj igieł o rozmiarze od 21 do 23, aby ustalić pozycję głowy, penetrując przez oczy pod kątem 45 stopni i przyłóż siłę, aby upewnić się, że igły są zamocowane na płytce. Użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć skórę i czaszkę, pracując od środka do boków, a następnie przetnij opuszki węchowe i usuń opony mózgowe, aby odsłonić tkanki korowe.

Użyj zakrzywionych kleszczy, aby przeciąć tkanki korowe na dwa do trzech mililitrów podłoża neurobazalnego na lodzie. W razie potrzeby wyciągnij tkanki z różnych zarodków. Tkanki od 8 do 10 zarodków zwykle dają około 200 mikrogramów całkowitego RNA.

Dodać cykloheksymid do podłoża neurobazalnego z wypreparowanymi tkankami do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwirować tkankę o stężeniu 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Umyj tkanki dwukrotnie lodowatym PBS uzupełnionym 100 mikrogramami na mililitr cykloheksymidu.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy komórek uzupełnionego czterema mikrolitrami inhibitora RNazy i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić tkankę. Użyj igły do insuliny, aby delikatnie zlizować tkankę. Następnie inkubuj na lodzie przez 10 minut z krótkim wirowaniem co dwie do trzech minut.

Po inkubacji odwirować lizat o stężeniu 2000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie. Powtórzyć ten proces jeszcze raz, odwirowując przy 13 000 x g. Po przeniesieniu supernatantu do nowej probówki wirówkowej na lodzie, zmierzyć stężenie RNA w lizacie tkankowym za pomocą spektrofotometru UV-Vis.

Załaduj próbki na gradienty sacharozy, powoli dozując lizat do ścianek probówek ultrawirówek. Delikatnie umieścić gradienty sacharozy w wiadrach i ultraodwirować próbki w temperaturze 190 000 x g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut. Umieść pustą probówkę ultrawirówki na przebijaczu probówki i delikatnie przebij probówkę igłą od dołu.

Napełnij 30-mililitrową strzykawkę 25 mililitrami 60% roztworu sacharozy. Następnie delikatnie naciśnij strzykawkę tak, aby roztwór chase wypełnił pustą probówkę i przeszedł przez monitor UV o długości fali 254 nanometrów, aby ustawić linię bazową do wykrywania. Naciśnij automatyczne zerowanie na monitorze UV, aby zarejestrować linię bazową do wykrywania, a następnie naciśnij przycisk Odtwórz w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie.

Gdy system ustali linię bazową, wstrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu i wycofaj rozwiązanie pościgu, upewniając się, że w systemie nie pozostało żadne szczątkowe rozwiązanie pościgu. Załaduj jedną probówkę na probówkę i delikatnie wbij rurkę igłą od dołu. Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu, upewnij się, że w linii nie ma pęcherzyków powietrza.

Następnie uruchom pompę strzykawkową i kolektor frakcji, aby zebrać frakcje polisomowe, ustawiając frakcjonator na 30 sekund. Zbierz frakcje do 1,5 mililitrowych probówek. Lis korowy zawierający RNA pobrany z ośmiu zarodków został podzielony za pomocą gradientu sacharozy na 12 frakcji.

Piki absorbancji UV przy 254 nanometrach zidentyfikowały frakcje zawierające podjednostkę 40S, podjednostkę 60S oraz monosom i polisomy 80S. Analiza frakcji metodą Western blot dla dużej podjednostki rybosomalnej Rpl10 wykazała jej obecność w monosomach i polisomach podjednostek 60S. Natomiast białka cytoplazmatyczne, Gapdh i Csde1, nie były związane z rybosomami, ale były wzbogacone we frakcje zawierające wolne RNA.

Zgodnie z separacją białek w różnych frakcjach, mRNA Gapdh i sox2 były wysoce wzbogacone we frakcje zawierające ciężkie polisomy, co sugeruje, że te mRNA są skutecznie translowane w rozwijającej się korze mózgowej. Natomiast mRNA rpl7 i rpl35 zostały wzbogacone we frakcję zawierającą monosomy, co sugeruje stłumioną translację. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest zachowanie spójności w tworzeniu gradientów sacharozy.

Do wyrzucania sacharozy należy używać pomp strzykawkowych. Podczas frakcjonowania i pobierania próbek ważne jest, aby umyć system wodą wolną od RNaz. Zmniejsza to wszelkie pozostałości sacharozy pozostałe po poprzedniej próbce.

Metoda ta może być stosowana do oceny statusu translacyjnego mRNA w różnych tkankach. Za pomocą platformy można uzyskać spójne gradienty do profilowania polisomów, co stanowi niedrogie rozwiązanie dla tej klasycznej i użytecznej techniki.