Name: Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę profilowania polisomów do analizy translacji mRNA w rozwijającym się mózgu myszy. Protokół umożliwia ocenę efektywności translacyjnej genów kluczowych dla rozwoju nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 dla G.Y.). G.Y. jest Kanadyjskim Kierownikiem Badań. S.K. został ufundowany przez Mitacs Globalink Graduate Fellowship i ACHRI Graduate Student Scholarship.

Całe wykorzystanie zwierząt było nadzorowane przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary. Myszy CD1 użyte w eksperymencie zostały zakupione od komercyjnego dostawcy.
1. Przygotowanie roztworów
UWAGA Aby zapobiec degradacji RNA, spryskaj stół warsztatowy i wszystkie urządzenia roztworem do dekontaminacji RNazy. W eksperymencie używane są końcówki wolne od RNaz. Wszystkie roztwory przygotowuje się w wodzie wolnej od RNaz.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy cykloheksymidu (100 mg/ml) w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 2,2 M roztwór podstawowy sacharozy, dodając 75,3 g sacharozy do wody wolnej od RNaz i uzupełniając objętość do 100 ml (dla preparatu o gradinie ~16). Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Przygotować 10x roztwór soli (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).</li>
	<li>Przygotować 60% (w/v) roztwór sacharozy, zawierający 30 g sacharozy, 5 ml 10x roztworu soli i uzupełnić objętość do 50 ml wodą wolną od RNaz.</li>
	<li>Opcjonalnie dodać odrobinę błękitu bromofenolowego lub około 5 μl 1% błękitu bromofenolowego w wodzie wolnej od RNaz do roztworu bruzdy. 1.6. Przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie gradientu sacharozy
UWAGA: Precyzja w przygotowaniu gradientów sacharozy jest kluczowa dla uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników.
<ol>
	<li>Aby przygotować sześć 10-50% gradientów sacharozy, rozcieńczyć 2,2 M roztwór sacharozy, jak w tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór sacharozy</td>
			<td>10%</td>
			<td>20%</td>
			<td>30%</td>
			<td>40 proc</td>.
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2 M sacharoza</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>4 ml</td>
			<td>6 ml</td>
			<td>8 ml</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X roztwór soli</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cykloheksymid</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>11,5 ml</td>
			<td>9,5 ml</td>
			<td>7,5 ml</td>
			<td>5,5 ml</td>
			<td>3,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Rozcieńczenia sacharozy do preparatów gradientów sacharozy.
UWAGA: Zawsze przygotowuj gradienty sacharozy w wielokrotnościach dwóch, aby zrównoważyć wagę podczas ultrawirowania.
<ol start="2">
	<li>Przetrzyj metalową igłę z końcem roztworem do odkażania RNazy. Krótko przepłukać probówki ultrawirówki, rurki i strzykawkę wodą wolną od RNaz. Wysuszyć probówki na powietrzu, tak aby w probówkach nie pozostała kropla wody, ponieważ pozostała woda zmieni stężenie sacharozy.</li>
	<li>Umieść metalową igłę na uchwycie zaciskowym, a probówkę wirówkową na zmotoryzowanym stoliku. Aby konsekwentne przygotowanie gradientów, użyto systemu zmontowanego w domu, który zawiera zmotoryzowany stolik do utrzymywania probówki ultrawirówki i pompę strzykawkową do wstrzykiwania roztworów sacharozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, szczegóły w kroku 9).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml ~16 ml 10% sacharozy (wystarcza na sześć gradientów), umieść ją na pompie strzykawkowej i podłącz do igły. Upewnij się, że w strzykawce, rurki i igle nie ma pęcherzyków powietrza. Wytrzeć końcówkę z igły, aby usunąć resztki roztworu.</li>
	<li>Przesuń zmotoryzowany stolik w górę tak, aby końcówka igły dotykała środka rurki na dole.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową na natężenie przepływu 2 ml/min dla objętości 2,3 ml.</li>
	<li>Po dozowaniu 2,3 ml 10% roztworu sacharozy, przejdź do etapu zmotoryzowanego i powtórz proces dla wszystkich sześciu gradientów.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.4-2.7, aby dodać 20% roztwór sacharozy na dno probówek, a następnie podobnie 30%, 40% i 50% roztwory sacharozy.</li>
	<li>Po przygotowaniu gradientu uszczelnij probówkę ultrawirówki za pomocą folii parafinowej.</li>
	<li>Pozostawić probówki na noc w temperaturze 4 °C, tak aby różne warstwy sacharozy dyfundowały się razem, tworząc ciągły gradient.</li>
</ol>
3. Sekcja tkanek
UWAGA: Ciężarne myszy zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy poprzedzone znieczuleniem 5% izofluranem.
<ol>
	<li>Zbierz zarodki myszy CD1 w 12 dniu embrionalnym lub w innych punktach czasowych w razie potrzeby i umieść zarodki na płytce Ø 10 cm zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) na lodzie, aby zachować żywotność komórek.</li>
	<li>W ramach sekcji należy przenieść jeden zarodek na płytkę Ø 6 cm zawierającą lodowaty HBSS.</li>
	<li>Użyj igieł 21-23 G, aby ustalić pozycję głowy, penetrując przez oczy pod kątem około 45° i przyłóż siłę, aby upewnić się, że igły są przymocowane do płytki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj kleszczy nr 5, aby usunąć skórę i czaszkę, od środka do boków.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przeciąć opuszki węchowe i usunąć opony mózgowe, aby odsłonić tkanki korowe.3.6. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby pociąć tkanki korowe na 2-3 ml podłoża neurobazalnego na lodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). W razie potrzeby należy pobrać tkanki korowe z różnych zarodków. Tkanki z 8-10 zarodków dają zwykle ~200 μg całkowitego RNA.</li>
</ol>
4. Liza komórek
<ol>
	<li>W dniu rozbioru tkanek należy przygotować świeży bufor do lizy komórek, jak opisano w Tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>rozwiązanie</td>
			<td>Końcowe stężenie</td>
			<td>głośność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7,5)</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton X-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoksycholan sodu</td>
			<td>0,5% (w/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ditiotreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cykloheksymid</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od RNaz</td>
			<td></td>
			<td>Uzupełnij do 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łączny</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przygotowanie buforu do lizy polisomów.
UWAGA: Bufor do lizy uzupełnij inhibitorami proteazy i fosfatazy.
<ol start="2">
	<li>Dodać cykloheksymid do podłoża neurobazalnego z wypreparowanymi tkankami do końcowego stężenia 100 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Cykloheksymid blokuje wydłużenie translacji, a tym samym zapobiega spływaniu rybosomów 15.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć tkanki dwukrotnie lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 100 μg/ml cykloheksymidu.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do lizy komórek uzupełnionego 4 μl inhibitora RNazy. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić tkankę w buforze do lizy. Użyj igły do insuliny, aby delikatnie zlizować tkankę.</li>
	<li>Inkubować tkanki na lodzie przez 10 minut z krótkim wirowaniem co 2-3 min. 
	UWAGA: Aby zapobiec degradacji tkanek, upewnij się, że wszystkie etapy lizy tkanek są przeprowadzane na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy ~13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie RNA w lizacie tkankowym za pomocą spektrofotometru UV-Vis. 
	UWAGA: Jeśli w eksperymencie uwzględniono wiele próbek, rozcieńczyć próbki do tego samego stężenia za pomocą dodatkowego buforu do lizy komórek, aby zminimalizować zmienność.</li>
</ol>
5. Ładowanie próbki i ultrawirowanie
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić wirnik ultrawirówki i wiadra wahadłowe do temperatury 4 °C i ustawić temperaturę ultrawirówki na 4 °C.</li>
	<li>Zachowaj 20 μl lizatu tkankowego jako całkowity wkład RNA.</li>
	<li>Załaduj próbki (50-300 μg RNA o równej objętości) na wierzch gradientów sacharozy, powoli dozując lizat do ścianek probówek ultrawirówek.</li>
	<li>Delikatnie umieść probówki ultrawirówki w wiadrze wahadłowym. Upewnij się, że wszystkie średnicowo przeciwległe łyżki są wyważone.</li>
	<li>Załaduj wiadra obrotowe na wirnik. Ustawić ultrawirówkę na 190 000 x g (~39 000 obr./min) w temperaturze 4 °C na 90 min.</li>
	<li>Po odwirowaniu delikatnie umieść gradienty na lodzie.</li>
</ol>
6. Frakcjonowanie i pobieranie próbek
UWAGA: Do analizy i pobierania próbek z gradientów używany jest domowy system frakcjonowania, rejestracji i zbierania próbek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, zobacz Komponenty urządzenia).
<ol>
	<li>Umieść pustą probówkę ultrawirówki na przebijaczu probówki i delikatnie przebij probówkę igłą od dołu.</li>
	<li>Włącz monitor UV i otwórz oprogramowanie do nagrywania sygnału cyfrowego.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml 25 ml 60% roztworu sacharozy. Delikatnie nacisnąć strzykawkę tak, aby roztwór chase wypełnił pustą probówkę i przejść przez monitor UV 254 nm, aby ustawić linię bazową do wykrywania.</li>
	<li>Naciśnij automatyczne zerowanie na monitorze UV, aby zarejestrować linię bazową do wykrywania. Naciśnij przycisk odtwarzania w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
	<li>Gdy system ustali linię bazową, wstrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu i wycofaj rozwiązanie pościgu. Upewnij się, że w systemie nie pozostały żadne resztki roztworu bruzdy. 
	UWAGA: Przepłucz system wodą wolną od RNaz, aby usunąć pozostałości roztworów sacharozy pozostałych po poprzednim przebiegu.</li>
	<li>Załaduj jedną probówkę z próbką do przebijacza do probówki. Delikatnie wbić igłę w rurkę od dołu.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu. Uruchomić pompę strzykawkową (natężenie przepływu 1 ml/min dla objętości 25 ml) i kolektor frakcji w celu zebrania frakcji polisomowych. Ustaw frakcjonator na 30 s. 
	UWAGA: Przed każdym uruchomieniem upewnij się, że w strzykawce lub rurce nie ma pęcherzyków powietrza, delikatnie naciskając strzykawkę, aby roztwór chase przepływał w sposób ciągły przez igłę.</li>
	<li>Zebrać frakcje do probówek o pojemności 1,5 ml (każda po 500 μl) za pomocą kolektora frakcji.</li>
	<li>Frakcje mogą być przetwarzane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Po zebraniu frakcji przepłucz system wodą wolną od RNaz, aby usunąć resztki sacharozy.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Do każdej frakcji dodaj 10 ng kontroli skoków mRNA lucyferazy.</li>
	<li>Do każdej frakcji dodać trzy objętości komercyjnego odczynnika do izolacji RNA na bazie hydrocholku guanidu.</li>
	<li>Wiruj krótko przez 15 s.</li>
	<li>Ekstrahować RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnego z roztworem użytym w ppkt 7.2.</li>
</ol>
8. Odwrotna transkrypcja i PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis.</li>
	<li>Poddaj RNA odwrotnej transkrypcji za pomocą zestawu do syntezy cDNA, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Jako przykład użyj ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), aby zbadać rozkład polisomalny mRNA gapdh. qPCR przeprowadzono przy użyciu systemu detekcji qPCR i odczynnika qPCR mastermix, w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 10 min, następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 40 s, a następnie 95 °C przez 60 s.</li>
	<li>Uzyskać wartości cyklu progowego (Ct) z wykresów amplifikacji i wykorzystać do obliczenia zmiany krotności przy użyciu metody ΔΔCt.</li>
</ol>
9. Montaż systemu do produkcji gradientu sacharozy
UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby złożyć każdy komponent (jak opisano w Tabeli 3) ekspresu do gradientu sacharozy (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Zamontuj dwa wsporniki pionowe (A2) na płytce stykowej podstawy (A1).</li>
	<li>Użyj dwóch wąskich wsporników kątowych (B2), aby zamontować siłownik stolika liniowego na płytce stykowej podstawy (A1).</li>
	<li>Użyj dociskowej na aluminiowym słupku Ø12,7 mm (C2), aby przymocować go do płytki stykowej podstawy uchwytu rurki (C1) jako podstawki dla uchwytu rury.</li>
	<li>Zamontuj słupek pod kątem prostym Ø1/2" do Ø6 mm clamp (C3) ze słupkiem (C2) i słupkiem optycznym serii mini (C4).</li>
	<li>Użyj ustalającej na słupku optycznym (C4), aby podłączyć mały zacisk V-clamp (C5) jako uchwyt rury.</li>
	<li>Umieść probówkę wirówkową w uchwycie probówki i wyreguluj kąt, aby ustawić ją w pionie. Zaznacz położenie rury i zamontuj uchwyt słupka cokołu (C6) na płycie stykowej podstawy (C1), aby podeprzeć rurę.</li>
	<li>Po drugiej stronie płytki stykowej (A1) użyj dociskowej aluminiowego słupka Ø12,7 mm (D1), aby go zamocować i podłącz słupek optyczny serii mini (D3) za pomocą kąta prostego Ø1/2" do Ø6 mm zacisku słupka (D2).</li>
	<li>Podłącz miniaturowy zacisk V (D4) za pomocą igły (D5) do słupka (D3). Dostosuj kąt zacisku, aby ustawić igłę w pionie i wyreguluj długość słupka, aby upewnić się, że igła styka się z probówką wirówkową.</li>
	<li>Podłącz siłownik (B1) do sterownika silnika krokowego (E1) i użyj płytki sterownika UNO R3 oraz modułu joysticka z zestawu startowego UNO (E2) do sterowania siłownikiem. Zasilacz (np. zasilacz z regulacją 9-24 V AC/DC) może być używany do oddzielnego napędzania silnika.</li>
	<li>Umieścić pompę strzykawkową (F) obok stacji do tworzenia gradientu i połączyć strzykawkę z igłą.</li>
	<li>Steruj stopniem uchwytu rurki w górę iw dół za pomocą joysticka.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>przedmiot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa B1</td>
			<td>Siłownik stolika liniowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa E1</td>
			<td>Sterownik silnika krokowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa E2</td>
			<td>Super zestaw startowy projektu UNO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa A1</td>
			<td>Makiet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa A2</td>
			<td>Wspornik pionowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa B2</td>
			<td>Wąski wspornik kątowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa C1</td>
			<td>Płytka stykowa z serii Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał C5</td>
			<td>Mały zacisk V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa D4</td>
			<td>Miniaturowy zacisk V-clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa C2</td>
			<td>Słupek aluminiowy Ø12,7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C4, D3</td>
			<td>Słupek optyczny serii Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klasa D1</td>
			<td>Słupek aluminiowy Ø12,7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3, D2</td>
			<td>Zacisk słupka kątowego Ø1/2" do Ø6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał C6</td>
			<td>Podstawa uchwytu na cokół z serii Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał D5</td>
			<td>Igła z końcem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>Pompa strzykawkowa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Elementy systemu tworzenia gradientów.
10. Frakcjonowanie i wykrywanie montażu systemu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
<ol>
	<li>Użyj zwykłej biurety z okrągłymi szczękami clamp do zamontowania modułu optycznego monitora UV na przekłuwaczu rurowym. Podłącz jeden koniec rurki (o długości 1 cm i średnicy wewnętrznej 0.56 mm) do łącznika przekłuwacza rurek, a drugi koniec do portu Fluid In modułu optycznego. Podłącz port Fluid Out do frakcjonatora.</li>
	<li>Połącz moduł optyczny z jednostką sterującą monitora UV zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Za pomocą rozdzielającego podłącz gniazdo wyjściowe sygnału do konwertera cyfrowego na masie i złączach wejść analogowych, zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Podłącz konwerter cyfrowy do laptopa za pomocą zwykłego USB i nagrywaj przekonwertowane sygnały cyfrowe za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.</li>
</ol>

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Profilowanie polisomów jest powszechnie stosowaną i skuteczną techniką oceny stanu translacji zarówno na poziomie pojedynczego genu, jak i całego genomu14 . W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół profilowania polisomów z wykorzystaniem domowej platformy i jej zastosowania do analizy rozwijającej się kory myszy. Ta ekonomiczna platforma jest łatwa w montażu i generuje solidne, powtarzalne gradienty sacharozy i profilowanie polisomów z wysoką czułością.
Warto zauważ...

Podczas rozwoju mózgu ssaków, nerwowe komórki macierzyste namnażają się i różnicują, tworząc neurony i glej1,2 . Zaburzenia tego procesu mogą prowadzić do zmian w strukturze i funkcjonowaniu mózgu, co można zaobserwować w wielu zaburzeniach neurorozwojowych3,4. Prawidłowe zachowanie nerwowych komórek macierzystych wymaga zaaranżowanej ekspresji określonych genów5. Podczas gdy kontrola epigenetyczna i transkrypcyjna tych genów była intensywnie badana, ostatnie odkrycia sugerują, że regulacja genów na innych poziomach również przyczynia się do koordynacji proliferacji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych6,7,8,9,10. W związku z tym zajęcie się programami kontroli translacyjnej znacznie poszerzy naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw decyzji o losie neuronalnych komórek macierzystych i rozwoju mózgu.
Trzy główne techniki o różnej sile były szeroko stosowane do oceny stanu translacji mRNA, w tym profilowanie rybosomów, oczyszczanie powinowactwa do rybosomów (TRAP) i profilowanie polisomów. Profilowanie rybosomów wykorzystuje sekwencjonowanie RNA do określania fragmentów mRNA chronionych rybosomami, umożliwiając globalną analizę liczby i lokalizacji translujących rybosomów na każdym transkryptie w celu pośredniego wywnioskowania szybkości translacji, porównując ją z obfitością transkryptu11. TRAP wykorzystuje białka rybosomalne znakowane epitopami do wychwytywania mRNA związanych z rybosomami12. Biorąc pod uwagę, że znakowane białka rybosomalne mogą ulegać ekspresji w określonych typach komórek przy użyciu metod genetycznych, projekt TRAP umożliwia analizę translacji w sposób specyficzny dla typu komórki. Dla porównania, profilowanie polisomów, które wykorzystuje frakcjonowanie gradientu gęstości sacharozy w celu oddzielenia wolnych i słabo translowanych części (lżejszych monosomów) od tych aktywnie przekształcanych przez rybosomy (cięższe polisomy), zapewnia bezpośredni pomiar gęstości rybosomów na mRNA13. Jedną z zalet tej techniki jest jej wszechstronność w badaniu translacji specyficznego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania, a także analizie translatomu całego genomu14.
W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół profilowania polisomów w celu analizy rozwijającej się kory mózgowej myszy. Używamy systemu zmontowanego w domu do przygotowania gradientów gęstości sacharozy i zbierania frakcji do dalszych zastosowań. Przedstawiony tutaj protokół można łatwo dostosować do analizy innych typów tkanek i organizmów.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml mikroprobówki bez RNA</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>igła 21-23G</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>30 mL strzykawka</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>koniec igła</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>Płytka stykowa</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530/M</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol niebieski</td><td>Sigma</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>Mysz CD1 Charles</td><td></td><td>River Laboratory Kleszczyki</td><td></td></tr><tr><td>z zakrzywioną końcówką</td><td>Sigma</td><td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td></td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych TracerDAQ</td><td>Measurement Computing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konwerter</td><td></td> cyfrowy <td>Measurement Computing</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprepu Direct-zol RNA</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-basic</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont No.5</td><td>Sigma</td><td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Żubr</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Siłownik stopnia liniowego</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola lucyferazy RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Maxima zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>Themo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowy zacisk V-clamp</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td> Płytka stykowa serii Mini Thorlabs MSB7515/M Słupek optyczny serii Mini Thorlabs MS2R/M <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podstawa uchwytu postumentu serii Mini</td><td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-basic</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>&Oslash;<td></td></tr><tr><td> Słupek aluminiowy 12,7 mm</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M Parafilm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR zielony fastmix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Żubr</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Klema kątowa</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>Kąt prosty i Oslash; 1/2" na &Oslash; Zacisk słupkowy 6 mm</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M Rnase</td><td></td></tr><tr><td>AWAY</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki bez RNaz</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez RNaz</td><td>Żubr</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Wąski kątownik</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>Mały zacisk V-clamp</td><td>Thorlabs</td><td>VC1/M</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik silnika krokowego</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Bioshop</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Bio-basic</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Przekłuwacz rurkowy</td><td>Brandel</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy projektu UNO</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>Monitor UV</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik pionowy</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Prawidłowy rozwój mózgu ssaków opiera się na doskonałej równowadze między proliferacją i różnicowaniem nerwowych komórek macierzystych na różne typy komórek nerwowych. Równowaga ta jest ściśle kontrolowana przez ekspresję genów, która jest precyzyjnie dostrojona na wielu poziomach, w tym transkrypcji, po transkrypcji i translacji. W związku z tym coraz więcej dowodów wskazuje na kluczową rolę regulacji translacyjnej w koordynowaniu decyzji dotyczących losu neuronalnych komórek macierzystych. Frakcjonowanie polisomów jest potężnym narzędziem do oceny statusu translacji mRNA zarówno na poziomie globalnym, jak i poszczególnych genów. W tym miejscu przedstawiamy wewnętrzny proces profilowania polisomów w celu oceny wydajności translacji w komórkach z rozwijającej się kory mózgowej myszy. Opisujemy protokoły przygotowania gradientu sacharozy, lizy tkanek, ultrawirowania i analizy stanu translacji mRNA opartej na frakcjonowaniu.

W ramach demonstracji lizat kory zawierający 75 µg RNA (połączony z 8 embrionów) rozdzielono za pomocą gradientu sacharozy na 12 frakcji. Piki absorbancji UV przy 254 nm pozwoliły zidentyfikować frakcje zawierające podjednostkę 40S, podjednostkę 60S, monosomy 80S oraz polisomy (Rysunek 4A). Analiza frakcji metodą western blot w celu wykrycia dużej podjednostki rybosomalnej Rpl10 wykazała jej obecność w podjednostce 60S (frakcja 3), monosomach (frakcja 4) i polisomach (frakcje 5-12) (<strong ...

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w rozwoju mózgu. Profilowanie polisomów stanowi użyteczne i potężne narzędzie do oceny statusu translacyjnego mRNA, umożliwiając badanie funkcji kontroli translacyjnej podczas rozwoju mózgu. Ta metoda jest łatwym i tanim podejściem do tworzenia gradientów sacharozy i oceny frakcjonowania polisomów.W tym protokole służy do analizy rozwijającej się kory myszy. Można go jednak łatwo dostosować do badania innych systemów. Zacznij od rozcieńczenia 2,2 molowej sacharozy, aby przygotować sześć gradientów sacharozy od 10 do 50%.Napełnij 30-mililitrową strzykawkę około 16 mililitrami 10% sacharozy, umieść ją na pompie strzykawkowej i podłącz do igły. Upewnij się, że w strzykawce, rurki lub igle nie ma pęcherzyków powietrza i wytrzyj końcówkę igły, aby usunąć resztki roztworu. Przesuń zmotoryzowany stolik w górę tak, aby końcówka igły dotykała środka rurki na dole.Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mililitrów na minutę dla objętości 2,3 mililitra. Po dozowaniu 2,3 mililitra 10% roztworu sacharozy, przejdź w dół etapu zmotoryzowanego i powtórz proces dla wszystkich sześciu gradientów. Następnie dodaj 20% roztwór sacharozy na dno probówek, a następnie 30, 40 i 50%Zbierz zarodki myszy CD1 w 12 dniu embrionalnym i umieść je na 10-centymetrowej płytce zawierającej lodowaty HBSS na lodzie.W zakresie preparacji przenieś jeden zarodek na sześciocentymetrową płytkę zawierającą lodowaty HBSS. Użyj igieł o rozmiarze od 21 do 23, aby ustalić pozycję głowy, penetrując przez oczy pod kątem 45 stopni i przyłóż siłę, aby upewnić się, że igły są zamocowane na płytce. Użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć skórę i czaszkę, pracując od środka do boków, a następnie przetnij opuszki węchowe i usuń opony mózgowe, aby odsłonić tkanki korowe.Użyj zakrzywionych kleszczy, aby przeciąć tkanki korowe na dwa do trzech mililitrów podłoża neurobazalnego na lodzie. W razie potrzeby wyciągnij tkanki z różnych zarodków. Tkanki od 8 do 10 zarodków zwykle dają około 200 mikrogramów całkowitego RNA.Dodać cykloheksymid do podłoża neurobazalnego z wypreparowanymi tkankami do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwirować tkankę o stężeniu 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Umyj tkanki dwukrotnie lodowatym PBS uzupełnionym 100 mikrogramami na mililitr cykloheksymidu.Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy komórek uzupełnionego czterema mikrolitrami inhibitora RNazy i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić tkankę. Użyj igły do insuliny, aby delikatnie zlizować tkankę. Następnie inkubuj na lodzie przez 10 minut z krótkim wirowaniem co dwie do trzech minut.Po inkubacji odwirować lizat o stężeniu 2000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie. Powtórzyć ten proces jeszcze raz, odwirowując przy 13 000 x g. Po przeniesieniu supernatantu do nowej probówki wirówkowej na lodzie, zmierzyć stężenie RNA w lizacie tkankowym za pomocą spektrofotometru UV-Vis.Załaduj próbki na gradienty sacharozy, powoli dozując lizat do ścianek probówek ultrawirówek. Delikatnie umieścić gradienty sacharozy w wiadrach i ultraodwirować próbki w temperaturze 190 000 x g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut. Umieść pustą probówkę ultrawirówki na przebijaczu probówki i delikatnie przebij probówkę igłą od dołu.Napełnij 30-mililitrową strzykawkę 25 mililitrami 60% roztworu sacharozy. Następnie delikatnie naciśnij strzykawkę tak, aby roztwór chase wypełnił pustą probówkę i przeszedł przez monitor UV o długości fali 254 nanometrów, aby ustawić linię bazową do wykrywania. Naciśnij automatyczne zerowanie na monitorze UV, aby zarejestrować linię bazową do wykrywania, a następnie naciśnij przycisk Odtwórz w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie.Gdy system ustali linię bazową, wstrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu i wycofaj rozwiązanie pościgu, upewniając się, że w systemie nie pozostało żadne szczątkowe rozwiązanie pościgu. Załaduj jedną probówkę na probówkę i delikatnie wbij rurkę igłą od dołu. Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu, upewnij się, że w linii nie ma pęcherzyków powietrza.Następnie uruchom pompę strzykawkową i kolektor frakcji, aby zebrać frakcje polisomowe, ustawiając frakcjonator na 30 sekund. Zbierz frakcje do 1,5 mililitrowych probówek. Lis korowy zawierający RNA pobrany z ośmiu zarodków został podzielony za pomocą gradientu sacharozy na 12 frakcji.Piki absorbancji UV przy 254 nanometrach zidentyfikowały frakcje zawierające podjednostkę 40S, podjednostkę 60S oraz monosom i polisomy 80S. Analiza frakcji metodą Western blot dla dużej podjednostki rybosomalnej Rpl10 wykazała jej obecność w monosomach i polisomach podjednostek 60S. Natomiast białka cytoplazmatyczne, Gapdh i Csde1, nie były związane z rybosomami, ale były wzbogacone we frakcje zawierające wolne RNA.Zgodnie z separacją białek w różnych frakcjach, mRNA Gapdh i sox2 były wysoce wzbogacone we frakcje zawierające ciężkie polisomy, co sugeruje, że te mRNA są skutecznie translowane w rozwijającej się korze mózgowej. Natomiast mRNA rpl7 i rpl35 zostały wzbogacone we frakcję zawierającą monosomy, co sugeruje stłumioną translację. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest zachowanie spójności w tworzeniu gradientów sacharozy.Do wyrzucania sacharozy należy używać pomp strzykawkowych. Podczas frakcjonowania i pobierania próbek ważne jest, aby umyć system wodą wolną od RNaz. Zmniejsza to wszelkie pozostałości sacharozy pozostałe po poprzedniej próbce.Metoda ta może być stosowana do oceny statusu translacyjnego mRNA w różnych tkankach. Za pomocą platformy można uzyskać spójne gradienty do profilowania polisomów, co stanowi niedrogie rozwiązanie dla tej klasycznej i użytecznej techniki.

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Chociaż struktura rybosomów została szczegółowo opisana, organizacja polisomów jest nadal niedostatecznie zbadana. Aby przezwyciężyć ten brak wiedzy, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół przygotowania do dokładnego obrazowania polisomów ssaków za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w powietrzu i cieczy.

Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Poznaj metodę profilowania polisomów do analizy translacji mRNA w rozwijającym się mózgu myszy. Protokół umożliwia ocenę efektywności translacyjnej genów kluczowych dla rozwoju nerwowego.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Przeglądaj więcej filmów