Name: Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj metodę profilowania polisomów bez automatycznych systemów frakcjonowania, wykorzystującą gradienty sacharozowe do analizy aktywności rybosomów w komórkach Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Percy Tumbale i dr Melissie Wells za ich krytyczną lekturę tego rękopisu. Prace te były wspierane przez amerykański National Institute of Health Intramural Research Program; Amerykański Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS; ZIA ES103247 do R.E.S.).

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7% - 47%
UWAGA: Liniowy zakres gradientu sacharozy może być zmodyfikowany w celu uzyskania lepszej separacji w zależności od użytego typu komórki. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem profili polisomów dla S. cerevisiae.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe 7% i 47% sacharozy w buforze gradientu sacharozy (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 1 mM DTT). Filtrować, sterylizować roztwory podstawowe sacharozy przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 14 ml 17%, 27% i 37% roztworów sacharozy, dozując i mieszając 7% i 47% roztwory podstawowe sacharozy w sposób opisany w Tabeli 1.</li>
	<li>Umieść sześć polipropylenowych probówek wirówkowych (14 x 89 mm) w stojaku na probówki z pełnym widokiem. Zapewnij wystarczająco dużo miejsca między rurkami, aby działania z jedną rurką nie przeszkadzały innym.</li>
	<li>Podłącz długą igłę do strzykawki o pojemności 3 ml. Do tego protokołu użyj igły o średnicy 9 cali i pojemności 22 G z końcówką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), ale wystarczy każda igła wystarczająco długa, aby dotrzeć do dna probówki wirówkowej. 
	UWAGA: Przed ustawieniem gradientów należy wykonać próbne napełnianie i dozowanie, aby upewnić się, że strzykawka może utrzymać roztwór sacharozy bez kapania.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 7% sacharozy na dno każdej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml 17% sacharozy pod 7% roztworem, umieszczając końcówkę igły w bezpośrednim sąsiedztwie dna probówki i dozując roztwór powoli i ostrożnie.</li>
	<li>Powtórzyć z 2 ml każdego z 27%, 37% i 47% roztworów sacharozy. Upewnij się, że każda warstwa jest odróżnialna od siebie linią oznaczającą separację gęstości (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Jeśli gradienty nie zostaną użyte w ciągu 48 godzin, to w tym momencie, przed ich ustabilizowaniem się w ciągłym gradiencie, należy błyskawicznie zamrozić probówki z warstwowymi roztworami sacharozy w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Gradienty należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić im ustabilizowanie się w ciągłym, rosnącym procentowo zawartości sacharozy. Potrzeba 8-12 godzin, aby warstwowe roztwory sacharozy osiadły się w liniowym gradiencie sacharozy. Gradienty liniowe są stabilne do 48 godzin. Przechowywanie przez noc w temperaturze 4 °C zapewnia wystarczającą ilość czasu na rozmrożenie i osiadanie w liniowym gradiencie, aby można było użyć zamrożonych, warstwowych roztworów sacharozy. Użyj densytometru, aby ocenić jakość gradientu. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przechowywać gradienty w stabilnym miejscu, w którym nie będą zakłócane, ponieważ wszelkie ruchy lub wibracje zakłócą gradient.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów z komórek drożdży
<ol>
	<li>Zaszczepić interesujący szczep drożdży w 50 ml pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD) z ekstraktem drożdżowym i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do fazy stacjonarnej. 
	UWAGA: Temperatura może się różnić w zależności od wymagań szczepu drożdży.</li>
	<li>Przenieść 10 ml kultury w fazie stacjonarnej do 1 l świeżej pożywki YPD. Inkubować komórki, energicznie wstrząsając w temperaturze 30 °C (lub innej odpowiedniej temperatury), aż kultura osiągnie średnią fazę wzrostu wykładniczego (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>W środkowej fazie wzrostu wykładniczego dodać cykloheksymid do kultury w końcowym stężeniu 0,1 mg/ml. Inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W tym momencie komórki można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w schłodzonym 700 μl buforu do ekstrakcji polisomów (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml cykloheksymidu, 0,2 mg/ml heparyny). Dodaj 100 jednostek inhibitora RNazy i przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do probówki wirówkowej dodać ~400 μL wstępnie schłodzonych kulek szklanych o zakresie wielkości 425-600 μm. Rozdrobnić komórki drożdży przez energiczne mieszanie w ubijaku do kulek przez 5 minut.</li>
	<li>Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie RNA w oczyszczonym lizacie, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru lub przy użyciu systemu wykrywania RNA opartego na fluorescencji. 
	UWAGA: Aby uzyskać bardzo dokładne pomiary stężenia RNA, należy użyć zestawów do wykrywania RNA opartych na fluorescencji.</li>
	<li>Upewnij się, że stężenie RNA wynosi 0,5-1 μg/μL. Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, zmniejsz objętość buforu do ekstrakcji polisomów używanego do ponownego zawieszenia komórek w przyszłych eksperymentach. 
	UWAGA: Załaduj lizat na gradienty natychmiast po lizie i ilościowym oznaczeniu RNA. W razie potrzeby błyskawiczne zamrożenie lizatów w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
3. Wirowanie gradientów
<ol>
	<li>Ostrożnie załaduj lizat na górną część gradientów. Przyłóż końcówkę pipety do wewnętrznej ścianki, w górnej części rurki polipropylenowej. Delikatnie ustaw rurkę pod kątem i powoli dozuj lizat na wierzch gradientu, dryblując przy ścianie. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić ani nie zakłócić gradientu podczas ładowania lizatu. 
	UWAGA: Ilość załadowanego lizatu będzie się różnić w zależności od typu ogniwa. Zawartość RNA również będzie się różnić. Konieczne może być przeprowadzenie szeregu eksperymentów w celu określenia ilości lizatu potrzebnej do wygenerowania optymalnego profilu polisomowego. W przypadku drożdży 300 μg RNA jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji.</li>
	<li>Delikatnie umieść rurki we wstępnie schłodzonych wiadrach wahliwego wirnika kubełkowego. 
	UWAGA: Każda probówka wirówkowa z polipropylenu powinna mieć równe objętości gradientu i ilość załadowanego lizatu. Może się to różnić w zależności od rury. Upewnij się, że zmiana nie powoduje błędu niewyważenia podczas ultrawirowania.</li>
	<li>Odwirować gradienty przy 260,110 x g przez 150 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Ułamek i zbieranie danych
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z wahliwego wirnika wiadra i umieść je w uchwycie na probówki.</li>
	<li>Oznacz 96-dołkowe płytki do przechowywania frakcji i wstępnego schłodzenia na lodzie. 
	UWAGA: Użyj 96-dołkowej płytki odpowiedniej dla spektrofotometru, który ma okno optyczne do 230 nm do oznaczania kwasów nukleinowych przy 260 nm/280 nm.</li>
	<li>Zebrać frakcje o objętości 100 μl lub 200 μl, zaczynając od początku gradientu, ostrożnie wkładając końcówkę pipety w górną krawędź gradientu. Zbieraj ułamki, aż cały gradient zostanie podzielony na porcje. Liczba frakcji będzie zależeć od całkowitej objętości gradientu. 
	UWAGA: Zbierz ułamki w sposób, który nie zakłóca reszty gradientu. Upewnij się, że wszystkie frakcje mają równą objętość. Oprócz ręcznego frakcjonowania, inną tanią metodą frakcjonowania jest użycie małej pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Przenieś każdą frakcję na płytkę 96-dołkową, aby dotrzeć do dna probówki wirówkowej. Zebrane frakcje należy zawsze utrzymywać na lodzie.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy długości fali 254 nm za pomocą spektrofotometru. Użyj 7% i 47% roztworów sacharozy jako półfabrykatów. 
	UWAGA: Mierząc absorbancję frakcji należy pamiętać, że dla większości spektrometrów i kolorymetrów najbardziej efektywny zakres absorbancji wynosi 0,1-1. Jeśli pomiary absorbancji są poza zakresem (≥1,0), frakcje mają za dużo materiału. Rozcieńczyć próbkę, przypomnieć sobie dane, a następnie uwzględnić współczynnik rozcieńczenia podczas wykreślania profilu.</li>
	<li>Utwórz profil polisomu, wykreślając liczbę frakcji w funkcji absorbancji.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano metodę tworzenia profili polisomowych bez użycia kosztownych zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona profilowanie polisomów laboratoriom, które nie mają zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Głównymi wadami tego protokołu są żmudne frakcjonowanie ręczne i zmniejszona czułość w porównaniu z dedykowanym systemem frakcjonowania gęstości.
Protokół ten pociąga za sobą staranne przygotowanie gradientów sacharozy z rozdzielczo...

Rybosomy to mega-daltońskie kompleksy rybonukleoproteinowe, które przeprowadzają podstawowy proces przekształcania mRNA w białka. Rybosomy są odpowiedzialne za przeprowadzanie syntezy wszystkich białek w komórce. Rybosomy eukariotyczne składają się z dwóch podjednostek oznaczonych jako mała podjednostka rybosomalna (40S) i duża podjednostka rybosomalna (60S) zgodnie z ich współczynnikami sedymentacji. W pełni złożony rybosom jest oznaczony jako monosom 80S. Polisomy to grupy rybosomów biorących udział w translacji pojedynczej cząsteczki mRNA. Frakcjonowanie polisomów metodą wirowania w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężną metodą stosowaną do tworzenia profili rybosomów, identyfikowania specyficznych mRNA związanych z translacją rybosomów i analizowania czynników związanych z wielosomami1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13. Technika ta jest często stosowana do oddzielania polisosomów od pojedynczych rybosomów, podjednostek rybosomalnych i informacyjnych cząstek rybonukleoproteiny. Profile uzyskane w wyniku frakcjonowania mogą dostarczyć cennych informacji na temat aktywności translacyjnej polisomów14 oraz statusu składania rybosomów15,16,17.
Składanie rybosomów to bardzo złożony proces, który ułatwia grupa białek znanych jako czynniki składania rybosomów18,19,20,21. Czynniki te pełnią szeroki zakres funkcji podczas biogenezy rybosomów poprzez interakcje z wieloma innymi białkami, w tym ATPazami, endo- i egzonukleazami, GTPazami, helikazami RNA i białkami wiążącymi RNA22. Frakcjonowanie polisomów jest potężnym narzędziem wykorzystywanym do badania roli tych czynników w składaniu rybosomów. Na przykład metoda ta została wykorzystana do pokazania, w jaki sposób mutacje w kinazie polinukleotydowej Grc3, czynniku przetwarzania pre-rRNA, mogą negatywnie wpływać na proces składania rybosomów17,23. Profilowanie polisomów uwypukliło również i pokazało, w jaki sposób konserwatywne motywy w ATPazie Rix7 są niezbędne do produkcji rybosomów16.
Procedura frakcjonowania polisomów zaczyna się od wytworzenia rozpuszczalnych lizatów komórkowych z interesujących komórek. Lizat zawiera RNA, podjednostki rybosomalne i polisomy, a także inne rozpuszczalne składniki komórkowe. Ciągły, liniowy gradient sacharozy jest wytwarzany w probówce ultrawirówkowej. Rozpuszczalna frakcja lizatu komórkowego jest delikatnie ładowana na wierzch rurki gradientowej sacharozy. Załadowana rurka gradientowa jest następnie poddawana wirowaniu, które rozdziela składniki komórkowe według wielkości w gradiencie sacharozy pod wpływem siły grawitacji. Większe komponenty przemieszczają się dalej w głąb gradientu niż mniejsze komponenty. W górnej części gradientu znajdują się mniejsze, wolniej poruszające się składniki komórkowe, podczas gdy większe, szybciej poruszające się składniki komórkowe znajdują się na dole. Po odwirowaniu zawartość probówki zbiera się jako frakcje. Ta metoda skutecznie oddziela podjednostki rybosomalne, monosomy i polisomy. Gęstość optyczną każdej frakcji określa się następnie poprzez pomiar absorbancji widmowej przy długości fali 254 nm. Wykreślenie absorbancji w funkcji liczby frakcji daje profil polisomowy.
Liniowe gradienty gęstości sacharozy mogą być generowane za pomocą kreatora gradientów. Po odwirowaniu gradienty są często frakcjonowane, a absorbancje mierzone za pomocą automatycznego systemu frakcjonowania gęstości3,7,13,24,25. Chociaż systemy te bardzo dobrze sprawdzają się w produkcji profili polisomowych, są drogie i mogą być zbyt kosztowne dla niektórych laboratoriów. W tym miejscu przedstawiono protokół generowania profili polisomowych bez użycia tych instrumentów. Zamiast tego protokół ten wykorzystuje sprzęt zwykle dostępny w większości laboratoriów biologii molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny frakcjonator</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Wielomodowy czytnik płytek</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane, myte kwasem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash; 600 &mu; m</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, 1 M</td> Igła <td>medyczna KD</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>, 22 g, metalowa piasta</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>niestandardowa długość 9 cali, styl punktowy 3</td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowy stojak na probówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAzy</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Wahadłowy wirnik kubełkowy Pkg</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka, 3 ml</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M,&nbsp; pH 7,4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Microplate, 96 dołków</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Frakcjonowanie polisomów przez wirowanie w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężnym narzędziem, które może być użyte do tworzenia profili rybosomów, identyfikacji konkretnych mRNA translowanych przez rybosomy i analizy czynników związanych z polisomami. Podczas gdy zautomatyzowane generatory gradientów i systemy frakcjonowania gradientowego są powszechnie stosowane w tej technice, systemy te są na ogół drogie i mogą być zbyt kosztowne dla laboratoriów, które mają ograniczone zasoby lub nie mogą uzasadnić wydatków ze względu na rzadką lub okazjonalną potrzebę wykonywania tej metody w swoich badaniach. W tym miejscu przedstawiono protokół umożliwiający powtarzalne generowanie profili polisomów przy użyciu standardowego sprzętu dostępnego w większości laboratoriów biologii molekularnej bez specjalistycznych przyrządów do frakcjonowania. Ponadto przedstawiono porównanie profili polisomów wygenerowanych z systemem frakcjonowania gradientowego i bez niego. Omówiono strategie optymalizacji i produkcji powtarzalnych profili polisomów. Saccharomyces cerevisiae jest wykorzystywany jako organizm modelowy w tym protokole. Jednak protokół ten można łatwo modyfikować i dostosowywać do generowania profili rybosomów dla wielu różnych organizmów i typów komórek.

Trzy reprezentatywne profile polisomów przedstawiono na Rycini 3. Wszystkie profile pochodzą z tego samego szczepu drożdży. Typowy profil polisomów wykazuje wyraźnie rozdzielone piki dla podjednostek rybosomalnych 40S, 60S i 80S oraz dla polisomów. Szczyt każdego piku podjednostki rybosomalnej i polisomu będzie widoczny na każdym profilu (Rycina 3). Reprezentatywny profil z automatycznego systemu frakcjonowania gęstościowego przedstawiono na <strong class="xfig"...

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wygenerować profil polisomowy, który ujawnia szczegóły molekularne dotyczące aktywności rybosomów wewnątrz komórki. Technika ta pozwala użytkownikom uzyskać cenne informacje dostarczane przez profil polisomowy, którzy nie mają dostępu do zautomatyzowanych systemów frakcjonowania gradientowego. Nie spiesz się z przygotowaniem gradientów i przechowuj je w miejscu, w którym nie zostaną zakłócone przez sprężarkę lub inne operacje mechaniczne, gdy osiadają w gradientzie liniowym.Na początek przygotuj roztwory podstawowe 7 i 47% sacharozy w buforze gradientu sacharozy. Filtr sterylizuje roztwory podstawowe sacharozy przez filtr 0,22 mikrona. Przygotuj 14 mililitrów 17, 27 i 37% roztworów sacharozy, dozując i mieszając 7 i 47% roztwory podstawowe.Umieść sześć polipropylenowych probówek wirówkowych w stojaku na probówki z pełnym widokiem. Upewnij się, że między rurkami jest wystarczająco dużo miejsca, aby działania z jedną rurką nie przeszkadzały innym. Przymocuj dziewięciocalową igłę o rozmiarze 22 z końcówką do trzymililitrowej strzykawki i wykonaj próbne napełnienie i dozowanie, aby upewnić się, że strzykawka może utrzymać roztwór sacharozy bez kapania przed ustawieniem gradientów.Dodaj dwa mililitry 7% sacharozy na dno każdej probówki wirówkowej. Następnie dodaj dwa mililitry 17% sacharozy pod 7% roztworem, umieszczając końcówkę igły w bezpośrednim sąsiedztwie dna probówki. Ostrożnie i powoli dozuj roztwór.Powtórzyć procedurę z dwoma mililitrami każdego z 27, 37 i 47% roztworu sacharozy, upewniając się, że każda warstwa jest odróżnialna od drugiej za pomocą linii oznaczającej separację gęstości. Przechowuj gradienty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby mogły osiąść w ciągłym, rosnącym procencie sacharozy. Po wzroście i zebraniu drożdży, komórki Saccharomyces cerevisiae ponownie zawieszają komórki w schłodzonym buforze do ekstrakcji polisomów o pojemności 700 mikrolitrów.Dodaj 100 jednostek inhibitora RNAzy. Następnie dodaj 400 mikrolitrów wstępnie schłodzonych szklanych kulek o przybliżonej wielkości od 425 do 600 mikronów. Przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej ze szklanymi kulkami i rozbij komórki drożdży przez energiczne mieszanie w ubijaku do kulek przez pięć minut.Po rozbiciu komórek należy sklarować lizat przez odwirowanie. Określić stężenie RNA w oczyszczonym lizacie, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach, przy użyciu systemu detekcji RNA opartego na fluorescencji. Upewnij się, że stężenie RNA wynosi od 0,5 do jednego mikrograma na mikrolitr.Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, zmniejsz objętość buforu ekstrakcyjnego używanego do ponownego zawieszenia komórek. Ostrożnie załaduj lizat na górną część gradientów. Przyłóż końcówkę pipety do wewnętrznej ścianki w górnej części rurki polipropylenowej.Ustaw rurkę pod kątem i powoli dozuj lizat na szczyt gradientu, dryblując przy ścianie. Delikatnie umieść probówki we wstępnie schłodzonych wiadrach wahliwego wirnika kubełkowego i odwiruj gradienty. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z wahadłowego wirnika kubełkowego i umieść je w uchwycie na probówki.Oznacz 96-dołkowe płytki do przechowywania frakcji i wstępnego schłodzenia na lodzie. Zbierz frakcje o objętości 100 lub 200 mikrolitrów, zaczynając od góry gradientu, ostrożnie wkładając końcówkę pipety w górną część gradientu i zbierając frakcje, aż cały gradient zostanie podzielony na porcje. Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy 254 nanometrach za pomocą spektrofotometru w stosunku do 7 i 47% roztworów sacharozy jako ślepych prób.Utwórz profil polisomu, wykreślając liczbę frakcji w funkcji absorbancji. Przedstawiono trzy reprezentatywne profile polisomów drożdży S. Cerevisiae. Grzbiet każdej podjednostki rybosomalnej i piku polisomowego jest widoczny na każdym profilu.Reprezentatywny profil z automatycznego systemu frakcjonowania gęstości jest pokazany tutaj. Profil ten został uzyskany z ciągłego profilu absorbancji, ponieważ gradient sacharozy był przemieszczany od dołu do góry przez roztwór chase, przez celę przepływową detektora i zbierany we frakcjach. Profil polisomowy uzyskany przez ręczne frakcjonowanie próbek o pojemności 200 i 100 mikrolitrów przedstawiono tutaj.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przy tej procedurze, jest to, aby nie zakłócać gradientów. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza ani nie zakłócić gradientu poprzez zbyt szybkie dozowanie roztworu. Po tej procedurze RNA można wyekstrahować z gradientów w celu dalszej analizy w celu określenia mRNA, które kojarzą się z aktywnymi rybosomami

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Poznaj metodę profilowania polisomów bez automatycznych systemów frakcjonowania, wykorzystującą gradienty sacharozowe do analizy aktywności rybosomów w komórkach Saccharomyces cerevisiae.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Przeglądaj więcej filmów