Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wygenerować profil polisomowy, który ujawnia szczegóły molekularne dotyczące aktywności rybosomów wewnątrz komórki. Technika ta pozwala użytkownikom uzyskać cenne informacje dostarczane przez profil polisomowy, którzy nie mają dostępu do zautomatyzowanych systemów frakcjonowania gradientowego. Nie spiesz się z przygotowaniem gradientów i przechowuj je w miejscu, w którym nie zostaną zakłócone przez sprężarkę lub inne operacje mechaniczne, gdy osiadają w gradientzie liniowym.

Na początek przygotuj roztwory podstawowe 7 i 47% sacharozy w buforze gradientu sacharozy. Filtr sterylizuje roztwory podstawowe sacharozy przez filtr 0,22 mikrona. Przygotuj 14 mililitrów 17, 27 i 37% roztworów sacharozy, dozując i mieszając 7 i 47% roztwory podstawowe.

Umieść sześć polipropylenowych probówek wirówkowych w stojaku na probówki z pełnym widokiem. Upewnij się, że między rurkami jest wystarczająco dużo miejsca, aby działania z jedną rurką nie przeszkadzały innym. Przymocuj dziewięciocalową igłę o rozmiarze 22 z końcówką do trzymililitrowej strzykawki i wykonaj próbne napełnienie i dozowanie, aby upewnić się, że strzykawka może utrzymać roztwór sacharozy bez kapania przed ustawieniem gradientów.

Dodaj dwa mililitry 7% sacharozy na dno każdej probówki wirówkowej. Następnie dodaj dwa mililitry 17% sacharozy pod 7% roztworem, umieszczając końcówkę igły w bezpośrednim sąsiedztwie dna probówki. Ostrożnie i powoli dozuj roztwór.

Powtórzyć procedurę z dwoma mililitrami każdego z 27, 37 i 47% roztworu sacharozy, upewniając się, że każda warstwa jest odróżnialna od drugiej za pomocą linii oznaczającej separację gęstości. Przechowuj gradienty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby mogły osiąść w ciągłym, rosnącym procencie sacharozy. Po wzroście i zebraniu drożdży, komórki Saccharomyces cerevisiae ponownie zawieszają komórki w schłodzonym buforze do ekstrakcji polisomów o pojemności 700 mikrolitrów.

Dodaj 100 jednostek inhibitora RNAzy. Następnie dodaj 400 mikrolitrów wstępnie schłodzonych szklanych kulek o przybliżonej wielkości od 425 do 600 mikronów. Przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej ze szklanymi kulkami i rozbij komórki drożdży przez energiczne mieszanie w ubijaku do kulek przez pięć minut.

Po rozbiciu komórek należy sklarować lizat przez odwirowanie. Określić stężenie RNA w oczyszczonym lizacie, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach, przy użyciu systemu detekcji RNA opartego na fluorescencji. Upewnij się, że stężenie RNA wynosi od 0,5 do jednego mikrograma na mikrolitr.

Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, zmniejsz objętość buforu ekstrakcyjnego używanego do ponownego zawieszenia komórek. Ostrożnie załaduj lizat na górną część gradientów. Przyłóż końcówkę pipety do wewnętrznej ścianki w górnej części rurki polipropylenowej.

Ustaw rurkę pod kątem i powoli dozuj lizat na szczyt gradientu, dryblując przy ścianie. Delikatnie umieść probówki we wstępnie schłodzonych wiadrach wahliwego wirnika kubełkowego i odwiruj gradienty. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z wahadłowego wirnika kubełkowego i umieść je w uchwycie na probówki.

Oznacz 96-dołkowe płytki do przechowywania frakcji i wstępnego schłodzenia na lodzie. Zbierz frakcje o objętości 100 lub 200 mikrolitrów, zaczynając od góry gradientu, ostrożnie wkładając końcówkę pipety w górną część gradientu i zbierając frakcje, aż cały gradient zostanie podzielony na porcje. Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy 254 nanometrach za pomocą spektrofotometru w stosunku do 7 i 47% roztworów sacharozy jako ślepych prób.

Utwórz profil polisomu, wykreślając liczbę frakcji w funkcji absorbancji. Przedstawiono trzy reprezentatywne profile polisomów drożdży S. Cerevisiae. Grzbiet każdej podjednostki rybosomalnej i piku polisomowego jest widoczny na każdym profilu.

Reprezentatywny profil z automatycznego systemu frakcjonowania gęstości jest pokazany tutaj. Profil ten został uzyskany z ciągłego profilu absorbancji, ponieważ gradient sacharozy był przemieszczany od dołu do góry przez roztwór chase, przez celę przepływową detektora i zbierany we frakcjach. Profil polisomowy uzyskany przez ręczne frakcjonowanie próbek o pojemności 200 i 100 mikrolitrów przedstawiono tutaj.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przy tej procedurze, jest to, aby nie zakłócać gradientów. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza ani nie zakłócić gradientu poprzez zbyt szybkie dozowanie roztworu. Po tej procedurze RNA można wyekstrahować z gradientów w celu dalszej analizy w celu określenia mRNA, które kojarzą się z aktywnymi rybosomami