Przygotowanie twardych nasion palmy do analizy spektrometrii mas metodą desorpcji laserowej/jonizacji wspomaganej matrycowo

Nasze badania koncentrują się na waloryzacji biomasy roślinnej z tropikalnej różnorodności biologicznej. W tym celu bardzo ważne jest, aby dobrze scharakteryzować te materiały, abyśmy mogli nadać im najlepszą wartość i zaproponować najlepsze miejsca docelowe. W tym celu w tej pracy wykorzystujemy analizę spektrometrii mas obrazowania MALDI jako technikę charakteryzowania, ponieważ jest to bardzo precyzyjna metoda, która może dać nam molekularnie specyficzne obrazowanie tkanki biologicznej.

Dzięki wynikom możemy mieć przegląd głównych składników biomasy roślinnej, a także ich lokalizacji, a to może kierować naszą eksploracją nowych produktów i procesów z tego materiału. Jednak, aby uzyskać bardzo dobrą analizę spektrometrii mas obrazu MALDI, bardzo ważne jest posiadanie dobrej metody przygotowania próbki i to jest dokładnie to, co opisujemy w tej pracy. Postęp technologiczny doprowadził do wielu wyzwań związanych z obrazową analizą spektrometrii mas.

W szczególności tkanki roślinne stanowią złożone wyzwanie ze względu na ich wyspecjalizowane narządy. Ma to kluczowe znaczenie dla tej techniki, przygotowania próbki. Jeśli przygotowanie próbki zostanie wykonane nieprawidłowo, sygnały nie zostaną wykryte lub pojawią się artefakty, co doprowadzi do niedokładnych wyników.

Protokoły te pozwalają nam przygotować cienki plasterek nasion palmowych odpornych na przecięcie, służąc jako dowód słuszności koncepcji mapowania molekularnego do analizy tkanki. Tak więc ta technika oferuje cenny wgląd w oligosacharydy obecne w tych odciskach nasion. Mamy więc nadzieję, że ta technika będzie pomocna dla badaczy z podobnymi przeszkodami.

Ta technika może pomóc w badaniu innych twardych nasion lub innego materiału biologicznego, który stanowi wyzwanie do pokrojenia w cienkie plasterki. Na przykład protokół ten może być narzędziem do badania rozwoju i kiełkowania nasion, jeśli ktoś ma badać twarde nasiona. Na początek zanurz trzy nasiona Euterpe precatoria i trzy nasiona Euterpe edulis w dejonizowanej wodzie na 24 godziny.

Po 24 godzinach włącz kriostat i pozwól, aby temperatura osiągnęła minus 20 stopni Celsjusza. Wyjmij mokre nasiona z wody i przekrój je na pół za pomocą ostrza do mikrotomu. Przygotuj świeży, ciepły 10% roztwór żelatyny, umieść połowę nasion na foremce i napełnij ją roztworem żelatyny.

Zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny przed zabraniem do kriostatu. Przymocuj osadzone ziarno do wspornika kriostatu za pomocą środka o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT i pozostaw je na 10 minut w kriostacie w celu stwardnienia OCT. Następnie dodaj miedzianą dwustronną taśmę klejącą do szkiełka szklanego pokrytego tlenkiem indu i cyny lub szkiełka ITO.

Wyprodukuj skrawki o grubości 20 mikrometrów z każdego gatunku i umieść je na taśmie klejącej przyklejonej do szkiełka ITO. W celu osadzania matrycy należy umieścić szkiełko zawierające plastry w eksykatorze próżniowym do momentu, aż osiągnie temperaturę pokojową. Zrób znaki dydaktyczne za pomocą pisaka korekcyjnego w każdym rogu slajdu i zeskanuj slajd za pomocą skanera stołowego.

Użyj wagi analitycznej, aby zważyć 30 miligramów DHB. Następnie należy przygotować jednomililitrowy roztwór zawierający równe części metanolu i 0,1% kwasu trifluorooctowego i w przygotowanym roztworze rozpuścić zważony DHB. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem DHB i umieść ją na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,8 mililitra na godzinę.

Za pomocą rurki do pobierania podłącz strzykawkę do igły do jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym lub igły APCI, a następnie podłącz azot do igły. Ustaw natężenie przepływu na 12.5 PSI. Przymocuj igłę APCI do platformy ruchu XY.

Upewnij się, że końcówka igły APCI znajduje się cztery centymetry nad szkiełkiem. Korzystając z oprogramowania do rysowania, ustaw platformę ruchu XY tak, aby podążała za szablonem i poczekaj, aż platforma powtórzy szablon 20 razy. Aby rozpocząć, umieść szkiełko zawierające osadzone w matrycy plastry nasion w spektrometrze mas.

Załaduj przykładowy obraz i użyj znaczników pióra korekcyjnego, aby ustawić punkty nauczania w oprogramowaniu, do którego się odwołuje. Następnie ustaw współczynnik redukcji danych na poziomie 99%, zapisz plik FID do kalibracji danych a posteriori i zapisz metodę. Wyznacz obszar do analizy za pomocą narzędzia Dodaj region pomiaru wielokąta w oprogramowaniu spektrometru mas.

Ustaw szerokość rastra na 100 mikrometrów. Edytuj parametry obszaru pomiaru wskazujące zapisaną metodę i zapisz przebieg obrazowania. Następnie rozpocznij akwizycję obrazowania.

Użyj klastra macierzy i znanych zanieczyszczeń, aby utworzyć listę mas w oprogramowaniu w zakładce Kalibert. Następnie w zakładce Kalibracja otwórz utworzoną listę mas. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć okno dialogowe i wybierz opcję Ustaw zablokuj bryły.

Wybierz tryb okna Gaussa z poszerzeniem gaussowskim o 0,5 i poszerzeniem o 3,5 linii. Pozostaw kalibrację online niezaznaczoną. Ustaw tryb na pojedynczy, próg na 1 000 i tolerancję masy na pięć PPM.

Skalibruj dane z procesem i zapisz narzędzie do tworzenia szeregowego zestawu danych 2D. Po kalibracji otwórz plik mis w kompatybilnym oprogramowaniu i zmień normalizację z braku normy na RMS lub TIC. Kliknij kartę Edytuj i wybierz opcję Automatyczne filtrowanie masowe.

Wypełnij masę początkową i końcową minimalną i maksymalną liczbą daltonów na progu zainteresowania i kliknij ikonę OK. Na przefiltrowanej liście należy wybrać wyróżniony szczyt zainteresowania z liczbą odpowiadającą wartości masy zainteresowania w daltonach. Zmień wartość procentową, aby lepiej wyświetlić interesujący obszar.

Kliknij pasek skali intensywności i ikony mapy kolorów. Kliknij obszar obrazu i przeciągnij, przesuń mysz, aby ustawić obszar zainteresowania. Zmień wartość procentową przezroczystości, aby utworzyć scalony obraz sygnału z zeskanowanym obrazem przekroju jako tłem.

Jeśli anality, które mają być zmapowane, są znane, należy wykreślić każdą wartość M na Z dla każdego analitu i zapisać wygenerowane obrazy oraz wykres średniej spektralnej. Poniżej przedstawiono spektrum masowe tkanek nasion Euterpe precatoria i Euterpe edulis uzyskanych przez MALDI-IMS w trybie dodatnim. Ta analiza MALDI-IMS nasion E precatoria wykazała piki reprezentujące addukty oligomerów heksozy bez dodawania soli do matrycy.

Zidentyfikowano heksozy, dimery, trimery, tetramery, pentamery, heksamery i do 14 oligomerów jednostkowych. Takie same wyniki uzyskano również dla tkanki nasiennej E edulis. Wykresy pudełkowe dla obu próbek wskazują szczytową intensywność każdego oligomeru heksozy znajdującego się w bielmie nasion, wykazując ich rozmieszczenie oraz nieco wyższą zawartość wysokiego stopnia polimeryzacji oligomerów.