Name: Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Naucz się przygotowywać próbki tkanek utrwalonych formaliną do obrazowania spektrometrii mas peptydów. Ta metoda sublimacji jest prosta, powtarzalna i ekonomiczna, umożliwiając początkującym badaczom samodzielne tworzenie workflow.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Sydney Medical School oraz Blues and Foundation za sfinansowanie części tej pracy poprzez program stypendialny doktorancki na badania nad chorobą Alzheimera oraz grant ARC Discovery (DP160102063) przyznany PKW.

UWAGA: Podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać wszystkich obowiązujących środków ostrożności, w tym stosowania odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE) (np. fartuchów laboratoryjnych, rękawic nitrylowych, okularów ochronnych, itp.)
1. Przygotowanie odczynników i sprzętu
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Aby przygotować 500 ml płynu Carnoya, wymieszaj 100% etanol (EtOH), chloroform i lodowaty kwas octowy w stosunku 6:3:1 v/v/v w czystej szklanej butelce Schotta.</li>
		<li>Aby uzyskać ciekłą nitrocelulozę (NC), rozpuść membranę NC (powszechnie stosowaną w western blotting) w czystym acetonie, delikatnie mieszając, do końcowego stężenia 40 mg / ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie prowadnic z powłoką NC
	<ol>
		<li>Do przygotowania preparatów z powłoką NC należy użyć techniki podobnej do tej, która jest używana do przygotowania rozmazów krwi do badania histologicznego20.</li>
		<li>Odpipetować 40 μl cieczy NC na jedną krawędź szkiełka mikroskopowego z przewodzącego tlenku indu i cyny (ITO). Używając zwykłego szkiełka mikroskopowego, przeciągnij NC pod napięciem powierzchniowym po szkiełku, aby uzyskać równą cienką powłokę.</li>
		<li>Pozostaw NC do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 s, a następnie przechowuj, aż będzie potrzebny, w temperaturze pokojowej. Przechowywanie próbek w tych warunkach może być nieograniczone, pod warunkiem że tkanki są konserwowane i wolne od pyłu. 
		UWAGA: Ta metoda przygotowania jest lepiej znana jako "cienka folia" i zapewnia jednolitą powłokę, która opiera się na lepkości NC, a także na braku napięcia powierzchniowego do samopoziomowania na szkiełku. Jedyną ostrożnością, jaką należy zachować podczas przygotowywania szkiełek, jest to, aby nie poruszać się zbyt szybko, co spowoduje powstanie smug NC, a nie pełnego pokrycia. 
		UWAGA: Ponieważ płyn NC wysycha bardzo szybko, ważne jest, aby pracować szybko, aby uniknąć wysuszenia roztworu przed jego odpowiednim rozprowadzeniem. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z NC w stanie ciekłym, ponieważ jest to związek wysokoenergetyczny i nie powinien stykać się ze źródłem zapłonu, aby zapobiec wybuchowi zapalającemu. NC ulega również przemianom endotermicznym podczas suszenia i może powodować oparzenia zimnem, jeśli pozwoli się mu na długotrwały kontakt ze skórą lub dłońmi w rękawiczkach. Aby zminimalizować wszelkie związane z tym ryzyko, za każdym razem należy przygotowywać tylko niewielkie ilości (zaleca się <1 ml). Po wyschnięciu jest stabilny w temperaturze pokojowej. Jednak NC może pozostać wybuchowy, gdy występuje w dużych ilościach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie niestandardowych komór parowych
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek grubej bibuły nożyczkami wystarczająco dużymi, aby zmieścił się w dolnej połowie standardowej plastikowej szalki Petriego (94 mm średnicy i 3 mm grubości).</li>
		<li>Przeciąć papier, pozostawiając prostokątny pasek pośrodku, tego samego rozmiaru co szkiełko mikroskopowe, pozostawiając wystarczająco dużo nadmiaru, aby papier zachował swoją pozycję na szalce Petriego (rysunek uzupełniający 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie skrawków tkanek
<ol>
	<li>FFPE Tissue21.
	<ol>
		<li>Wybierz żądany blok tkanki i przekrój go o grubości 12 μm w standardowym mikrotomie montowanym na stole i mocowaniu pływakowym na wstępnie powlekanych szkiełkach ITO NC.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie, aby usunąć resztki parafiny na 2 minuty i powtórz operację po raz drugi. 
		UWAGA: Jeśli blok parafinowy jest szczególnie rozpowszechniony lub tkanka jest stosunkowo mała w porównaniu z blokiem parafinowym, próbki można podgrzać w temperaturze 60 °C, aby stopić większość przed myciem w ksylenie.</li>
		<li>Umyj odparafinowane próbki, zanurzając szkiełka w stopniowanej serii rozpuszczalników: 70% v/v EtOH/woda, 100% EtOH, płyn Carnoya, 100% EtOH, ultraczysta woda i 100% EtOH. Czas trwania każdego zanurzenia powinien wynosić 30 s, z wyjątkiem płynu Carnoya, który musi trwać 2 min. 
		UWAGA: Płyn Carnoya i ksylen muszą być przechowywane i używane w dygestorium, ponieważ są wysoce toksyczne w przypadku wdychania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tkanka mrożona utrwalona formaliną (FFF) 
	UWAGA: Próbki powinny być już zamrożone, odpowiednio do typu próbki.
	<ol>
		<li>Równoważ blok tkankowy w temperaturze roboczej mikrotomu przez 20 min22. 
		UWAGA: Temperatura równowagi zależy od rodzaju tkanki.</li>
		<li>Tkankę należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu o wielkości 12 μm i rozmrozić na wstępnie przygotowanym szkiełku podstawowym ITO pokrytym NC.</li>
		<li>Przechowywać szkiełka w eksykatorze próżniowym na stole w ciemności. 
		UWAGA: W takich warunkach próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni.</li>
		<li>Przemyć próbki w serii rozpuszczalników o stopniowanej czystości, jak podano dla tkanek FFPE (2.1.3). 
		UWAGA: Nie ma potrzeby przeprowadzania etapu odparafinowania ksylenu, ponieważ próbka nie jest osadzona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hydroliza usieciowania metylenowego
<ol>
	<li>Załaduj szkiełka podstawowe (FFF lub FFPE) do plastikowego pudełka na szkiełka, które jest wypełnione do góry 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Zamknij pudełko i umieść je w łaźni wodnej zawierającej 500 ml wody, tak aby pudełko dotykało dna. Następnie podgrzewaj go przez 15 minut w temperaturze 120 °C w szybkowarze, który może osiągnąć ciśnienie robocze 70 kPa.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka, pozwól im ostygnąć i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze otoczenia przez 15 minut.</li>
</ol>
4. Trawienie tkankowe
<ol>
	<li>Po hydrolizie próbki należy pokryć 10 μl roztworu trypsyny (1 mg/ml) w ultraczystej wodzie, pipetując 10 μl roztworu na krawędź sekcji tkanki, a następnie, używając tej samej końcówki pipety, przeciągnąć kroplę po całej powierzchni tkanki pod napięciem powierzchniowym. 
	UWAGA: Unikaj drapania powierzchni tkanki końcówką pipety i nadmiernego rozprowadzania enzymu poza granice krawędzi tkanki.</li>
	<li>Pozostawić próbki do wyschnięcia w temperaturze otoczenia.</li>
	<li>Po wyschnięciu zamontuj próbki w górnej części wcześniej skonstruowanej komory parowej (tkanka skierowana w dół) za pomocą taśmy autoklawu na obu krawędziach szkiełka (rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>Ostrożnie odmierzyć pipetą 600 μl roztworu zawierającego mieszaninę 100% acetonitrylu i wodorowęglanu amonu w proporcji 1:1 v/v na palec bibuły w dolnej części szalki Petriego, aż palec będzie wyglądał na równomiernie mokry.</li>
	<li>Umieść górną połowę komory parowej na dolnej połowie, upewniając się, że palec papierowy i szkiełko próbki są idealnie wyrównane, a następnie uszczelnij komorę wokół równika folią parafinową.</li>
	<li>Pozostawić próbkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić całkowite roztrawienie.</li>
</ol>
5. Powlekanie matrycy metodą sublimacji
<ol>
	<li>Po strawieniu zważyć szkiełko z próbką na 5-cyfrowej wadze mikroanalitycznej.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko na palcu chłodzącym aparatu sublimacyjnego i zabezpiecz go taśmą miedzianą, w taki sam sposób, jak opisano dla komory parowej (rysunek uzupełniający 3). 
	UWAGA: Aby zapewnić równomierny kontakt ze szkiełkiem przez palec chłodzący, na spodzie palca chłodzącego umieszcza się warstwę taśmy miedzianej w celu wyrównania powierzchni. Zapewnia to równomierne chłodzenie szkiełka, co prowadzi do równomiernego osadzania się matrycy.</li>
	<li>Umieścić 300 mg matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) na szklanej szalce Petriego na dnie komory i równomiernie rozprowadzić, aby utworzyć cienką warstwę kryształów matrycy.</li>
	<li>Zmontuj sublimator i zabezpiecz dwie połówki za pomocą zacisku podkowiastego. Zmontowaną jednostkę zawiesić na wysokości 15-20 cm nad łaźnią piaskową podgrzaną do temperatury 220 °C, umieszczając ją w metalowym pierścieniu połączonym ze stojakiem na retortę.</li>
	<li>Podłącz komorę do źródła podciśnienia, włącz podciśnienie i pozwól mu ustabilizować się do ~25 mTorr przez 5 minut.</li>
	<li>Zapakuj palec chłodzący do góry lodem i dodaj 50 ml wody. Pozwól urządzeniu osiąść przez kolejne 5 minut przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Opuść komorę na powierzchnię piasku, upewniając się, że piasek całkowicie styka się z dnem komory, i pozostaw ją na 45 minut, aby uzyskać idealną powłokę 0,22 mg/cm2 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze szklanymi naczyniami w wysokiej próżni, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie urządzenia podczas ewakuacji może spowodować katastrofalną awarię szklanej komory.</li>
	<li>Po 45 minutach wyjmij komorę z kąpieli piaskowej, podnosząc metalowy pierścień i odpowietrz komorę. 
	UWAGA: Po odpowietrzeniu komory szkiełko należy bardzo szybko zdjąć, ponieważ woda w powietrzu zacznie skraplać się na palcu zamrażającym i szkiełku do próbek.</li>
	<li>Zdejmij szkiełko i zważ je, aby upewnić się, że uzyskano pożądaną powłokę. 
	UWAGA: Jeśli uzyskano niewystarczającą powłokę, po prostu powtórz proces sublimacji dla szkiełka, aż do uzyskania żądanej grubości powłoki.</li>
</ol>
6. Rekrystalizacja
<ol>
	<li>Po sublimacji zamontuj szkiełko z próbką w górnej części wcześniej skonstruowanej komory parowej, jak opisano wcześniej (tkanka skierowana w dół).</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 600 μl roztworu zawierającego mieszaninę 100% acetonitrylu i 0,1% v/v kwasu trifluorooctowego w wodzie w stosunku 1:1 (v/v), ostrożnie na bibułę w dolnej części płytki Petriego, aby zapewnić równomierne pokrycie.</li>
	<li>Zmontuj komorę, upewniając się, że zakładka papieru i szkiełko mikroskopu są idealnie wyrównane, i pozostaw w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę 
	Uwaga: NIE uszczelniaj komory. 
	UWAGA: Po rekrystalizacji normalnie żółty odcień matrycy powinien zmienić się na biały, wyglądać mniej błyszcząco i wydawać się bardzo równomierny. Oznacza to, że rekrystalizacja została przeprowadzona prawidłowo.</li>
	<li>Próbka jest teraz gotowa do analizy.</li>
</ol>
7. Oprzyrządowanie
<ol>
	<li>Zeskanuj slajd w skanerze płaskim, aby utworzyć obraz cyfrowy.</li>
	<li>Załaduj próbkę do spektrometru mas, a następnie przeanalizuj ją za pomocą odpowiedniej platformy oprogramowania.</li>
	<li>Analizuj próbki w trybie reflektronu jonów dodatnich o zakresie masowym 750-3,500 Da, z rozdzielczością punktową, która ma zastosowanie do pożądanego wyniku. W większości przypadków wystarczająca jest szerokość rastra 20-50 μm, jednak można użyć zaledwie 10 μm15. 
	UWAGA: Lasery UV MALDI są źródłem promieniowania jonizującego i nie należy ich oglądać bezpośrednio. Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że laser jest umieszczony w osłonie przyrządu.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów ani interesów komercyjnych do ujawnienia

Protokół ten został zaprojektowany w celu maksymalizacji generowania jonizowalnych form molekularnych przy jednoczesnym wyeliminowaniu delokalizacji analitów. Kluczowe czynniki obejmują stosowanie tej samej nadrzędnej zasady podczas nakładania matrycy, trawienia próbki lub rekrystalizacji po sublimacji24; Mianowicie, że należy stworzyć i utrzymać równomierne osadzanie pary, matrycy lub w inny sposób. Pipetowanie rozpuszczalników do płukania w celu rekrystalizacji i mineralizacji, równomiernie pod ...

Obrazowanie metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI MSI) jest stosowane jako technika oparta na obrazie od dwóch dekad1,2, analizując szereg biomolekuł, w tym: lipids3, peptydy2,4, białka2,5, metabolity6,7, N-glikany8, oraz syntetyczne cząsteczki, takie jak leki terapeutyczne9,10. W ciągu ostatniej dekady znacznie wzrosła liczba publikacji demonstrujących użyteczność tej techniki6,11,12,13. Niektóre cząsteczki, takie jak lipidy, są stosunkowo łatwe do analizy za pomocą MALDI MSI, ponieważ łatwo jonizują ze względu na swoją naturę chemiczną, a zatem wymagają niewielkiego wcześniejszego przygotowania3. Jednak w przypadku trudniejszych celów, takich jak peptydy, kroki wymagane do skutecznej jonizacji tych cząsteczek są rozległe i ogólnie skomplikowane14. Obecnie istnieje bardzo niewiele publikacji, które mają na celu odniesienie się lub wykazanie odtwarzalności w metodologiach stosowanych do przygotowania tkanek do tej unikalnej techniki wizualnej15. Z tego powodu zebraliśmy obserwacje i wdrożyliśmy optymalizacje w jedną, łatwą do wdrożenia metodologię, która powinna wymagać niewielkiej lub żadnej modyfikacji, do analizy peptydów z usieciowanego źródła tkanek formaldehydu14.
W tym manuskrypcie opisaliśmy sprawdzoną, tanią powtarzalną metodologię wykrywania i mapowania przestrzennego peptydów, generowanych z utrwalonych w formalinie zamrożonych (FFF) i utrwalonych w formalinie fragmentów tkanek zatopionych w parafinie (FFPE). Ta metodologia nie wymaga ani nie opiera się na żadnym specjalistycznym oprzyrządowaniu3. W szczególności zajmujemy się wieloma aspektami specjalistycznego przygotowywania próbek niezbędnych do analizy peptydów; Kroki, takie jak pobieranie antygenu < klasa sup = "xref">16 i powlekanie matrycy. Nasz protokół wykorzystuje również niedrogi sprzęt i odczynniki, dzięki czemu ta metodologia jest dostępna dla szerszej społeczności, która w przeciwnym razie nie byłaby w stanie pozwolić sobie na alternatywną aparaturę robotyczną17.
Powód opracowania metody ręcznego przygotowania próbki był dwojaki: Po pierwsze, użycie sublimatora tworzy spójną i jednorodną powłokę kryształów matrycy o długości ~1 μm18, co jest nieosiągalne przy użyciu bardziej powszechnych technik natryskiwania. Po drugie, stosunkowo niewielkie koszty instalacji: całkowity koszt niestandardowej aparatury wyniósł <1500 AUD. Zauważamy, że jeśli chodzi o opłacalność, cena za próbkę jest znacznie niższa, gdy nie ma maszyn zrobotyzowanych. Stosowanie sublimacji było już wcześniej zgłaszane, jednak zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, metodologie krok po kroku, które opisują ten proces i przygotowanie próbki, nie zostały zgłoszone ani opisane w literaturze.
Ten protokół ma na celu pomoc badaczom, którzy mają dostęp do spektrometru masowego MALDI i którzy są zainteresowani generowaniem informacji przestrzennych w odniesieniu do interesującej nas biocząsteczki19. W istocie, MALDI MSI jest formą histologicznego badania przesiewowego, które nie opiera się na przeciwciałach ani stains2.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Do przygotowania i przekroju tkanki.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z tlenkiem indu i cyny</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Do przygotowania i przekroju tkanki.</td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Do przygotowania i przekroju tkanki.</td></tr><tr><td>Szybkowar</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Do przygotowania i przekroju tkanki.</td></tr><tr><td>Sublimator</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Do zabiegu sublimacji. Podobny w konstrukcji do CG-3038, jednak został wykonany na zamówienie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kąpiel piaskowa</td><td>NA</td><td>NA Do</td><td>zabiegu sublimacji. Drobnej jakości piasek rzeczny trzymany w złożonej folii aluminiowej pochodzącej z zewnątrz, nie od żadnej konkretnej firmy</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Do procedury sublimacji.</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>NA</td><td>NA Do</td><td>procedury sublimacji. Pozyskiwany jako część zamienna ze starego spektrometru masowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Zimna wymrażarka</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>Do procedury sublimacji.</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>Do zabiegu sublimacji.</td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td><td>Do zabiegu sublimacji.</td></tr><tr><td>37 &stopnie; C inkubator</td><td>NA</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>Do procedury sublimacji. Nie dotyczy, inkubator jest niesterylny i ma ponad 30 lat&nbsp;</td></tr><tr><td>Bibuła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Do procedury sublimacji.</td></tr><tr><td>Nitroceluloza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Do mycia szkiełek. Wyprodukowano w laboratorium z 95% etanolu magazynowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Do mycia szkiełek.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8,8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Do rozszczepienia proteolitycznego. Proszek wykonany do 1M, a następnie zrównoważenie z 32% HCl do PH 8,8</td></tr><tr><td>Milli Q Ultra-Pure Water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Do rozszczepienia proteolitycznego. Oczyszczanie wykonywane w domu przez oryginalny system oczyszczania wody</td></tr><tr><td>Birwęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Do rozszczepienia proteolitycznego.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Do rozszczepienia proteolitycznego.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Do rekrystalizacji.</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Do rekrystalizacji.</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Do rekrystalizacji.</td></tr></tbody></table>

optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Zastosowanie matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej, obrazowania spektrometrią mas (MALDI MSI) szybko się rozszerzyło, ponieważ technika ta analizuje wiele biomolekuł, od leków i lipidów po N-glikany. Chociaż istnieją różne techniki przygotowania próbek, wykrywanie peptydów z tkanek zakonserwowanych formaldehydem pozostaje jednym z najtrudniejszych wyzwań dla tego typu analizy spektrometrii mas. Z tego powodu stworzyliśmy i zoptymalizowaliśmy solidną metodologię, która zachowuje informacje przestrzenne zawarte w próbce, jednocześnie pozyskując największą liczbę peptydów jonizowalnych. Naszym celem było również osiągnięcie tego w opłacalny i prosty sposób, eliminując w ten sposób potencjalne błędy systematyczne lub błędy przygotowania, które mogą wystąpić w przypadku korzystania z automatycznego oprzyrządowania. Efektem końcowym jest powtarzalny i niedrogi protokół.

Przy prawidłowym zastosowaniu protokół ten pozwala uzyskać obrazy, które wyraźnie przedstawiają morfologię makroskopową tkanki, bez żadnych zarysowań ani innych deformacji (Rysunek 1). Idealną walidacją prawidłowo przeprowadzonego przygotowania próbki jest możliwość rozróżnienia różnych struktur fizycznych poprzez zmianę obserwowanej cząsteczki (Rysunek 2).
Dobrym sposo...

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne przygotowanie próbki tkanki do obrazowania metodą peptydowej spektrometrii mas. Metoda ta pozwala początkującym użytkownikom spektrometrii mas na opracowanie własnych przepływów pracy związanych ze spektrometrią mas do obrazowania bez konieczności przechodzenia przez długotrwałe ustalenia empiryczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna, prosta do wdrożenia i wykorzystuje opłacalne metodologie.Aby przygotować szkiełka pokryte nitrocelulozą, należy odpipetować 40 mikrolitrów ciekłej nitrocelulozy na jedną krawędź szkiełka mikroskopowego z przewodzącego tlenku indu i cyny. Używając zwykłego szkiełka mikroskopowego, przeciągnij nitrocelulozę pod napięciem powierzchniowym po szkiełku, aby uzyskać równomierną cienkowarstwową powłokę. Pozostaw nitrocelulozę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 sekund, a następnie przechowuj, aż będzie potrzebna, w temperaturze pokojowej.Następnie stwórz niestandardowe komory parowe, wycinając kawałek grubej bibuły wystarczająco duży, aby zmieścił się w dolnej połowie standardowej plastikowej szalki Petriego. Wytnij papier, aby pozostawić prostokątny pasek na środku o tym s

optimal-preparation-formalin-fixed-samples-for-peptide-based-matrix

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Unieśmiertelnione linie komórek rakowych mogą być hodowane jako hodowle komórek 3D, co jest cennym modelem dla badań biologicznych. Protokół ten opisuje obrazowanie hodowli komórkowych 3D za pomocą spektrometrii mas, w tym ulepszenia platformy przygotowania próbek. Celem tego protokołu jest poinstruowanie użytkowników, jak przygotować hodowle komórek 3D do analizy obrazowania metodą spektrometrii mas.

Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

Ten protokół miał na celu opisanie szczegółowych wytycznych dotyczących przygotowania sekcji próbek twardych nasion o niskiej zawartości wody do analizy MALDI-IMS, utrzymania pierwotnego rozkładu i obfitości analitów oraz zapewnienia wysokiej jakości sygnału i rozdzielczości przestrzennej.

Przygotowanie twardych nasion palmy do analizy spektrometrii mas metodą desorpcji laserowej/jonizacji wspomaganej matrycowo

Naucz się przygotowywać próbki tkanek utrwalonych formaliną do obrazowania spektrometrii mas peptydów. Ta metoda sublimacji jest prosta, powtarzalna i ekonomiczna, umożliwiając początkującym badaczom samodzielne tworzenie workflow.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów (Wideo) | JoVE Journal

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Przeglądaj więcej filmów