Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne przygotowanie próbki tkanki do obrazowania metodą peptydowej spektrometrii mas. Metoda ta pozwala początkującym użytkownikom spektrometrii mas na opracowanie własnych przepływów pracy związanych ze spektrometrią mas do obrazowania bez konieczności przechodzenia przez długotrwałe ustalenia empiryczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna, prosta do wdrożenia i wykorzystuje opłacalne metodologie.

Aby przygotować szkiełka pokryte nitrocelulozą, należy odpipetować 40 mikrolitrów ciekłej nitrocelulozy na jedną krawędź szkiełka mikroskopowego z przewodzącego tlenku indu i cyny. Używając zwykłego szkiełka mikroskopowego, przeciągnij nitrocelulozę pod napięciem powierzchniowym po szkiełku, aby uzyskać równomierną cienkowarstwową powłokę. Pozostaw nitrocelulozę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 sekund, a następnie przechowuj, aż będzie potrzebna, w temperaturze pokojowej.

Następnie stwórz niestandardowe komory parowe, wycinając kawałek grubej bibuły wystarczająco duży, aby zmieścił się w dolnej połowie standardowej plastikowej szalki Petriego. Wytnij papier, aby pozostawić prostokątny pasek na środku o tym samym rozmiarze, co szkiełko mikroskopowe. Pozostaw wystarczająco dużo nadmiaru, aby papier zachował swoją pozycję na szalce Petriego.

W przypadku tkanki FFPE należy zamontować sekcje na wstępnie powlekanych szkiełkach ITO z nitrocelulozy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie, aby usunąć resztki parafiny na dwie minuty. Przemyć odparafizowane próbki, zanurzając szkiełka w serii rozpuszczalników o stopniowanej objętości składającej się z roztworu wodnego etanolu o stężeniu 70% objętości, a następnie 100% etanolu, przez 30 sekund.

Następnie zanurz szkiełka w płynie Carnoya na dwie minuty. Na koniec zanurz szkiełka w serii 100% etanolu, ultraczystej wody i ponownie 100% etanolu na 30 sekund. Załaduj szkiełka do plastikowego pudełka na szkiełka, które jest wypełnione do góry 20-milimolowym tris HCO.

Zamknij pudełko i umieść je w łaźni wodnej zawierającej 500 mililitrów wody, tak aby pudełko dotykało dna wanny. Następnie podgrzewaj pudełko przez 15 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza w szybkowarze, który może osiągnąć ciśnienie robocze 70 kilopaskalów. Wyjmij szkiełka, pozwól im ostygnąć i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze otoczenia przez 15 minut.

Po hydrolizie pokryj próbki 10 mikrolitrami roztworu trypsyny w ultraczystej wodzie, najpierw pipetując 10 mikrolitrów roztworu na krawędź sekcji tkanki. Następnie, za pomocą tej samej końcówki pipety, przeciągnij kroplę po całej powierzchni tkanki pod napięciem powierzchniowym. Po pozostawieniu próbek do wyschnięcia w temperaturze otoczenia, zamontuj je w górnej części wcześniej skonstruowanej komory parowej za pomocą taśmy autoklawu na obu krawędziach szkiełka.

Ostrożnie odpipetować 600 mikrolitrów roztworu zawierającego objętość jeden do jednego dla objętościowej mieszaniny 100% acetonitrylu i 50 milimolowego wodorowęglanu amonu na palec bibuły w dolnej części szalki Petriego, aż palec będzie wydawał się równomiernie mokry. Pipetowanie jest niezwykle ważne, ponieważ nieprawidłowe pipetowanie spowoduje delokalizację analoidów matrycowych i powierzchniowych, co zniszczy informacje przestrzenne zawarte w próbce. Umieść górną połowę komory parowej na dolnej połowie, upewniając się, że palec papierowy i szkiełko próbki są idealnie wyrównane, a następnie uszczelnij komorę wokół równika folią parafinową.

Pozostaw próbkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić całkowite roztrawienie. Po strawieniu pozostaw szkiełko z próbką na pięciocyfrowej wadze mikroanalitycznej. Zamontuj szkiełko na palcu chłodzącym aparatu sublimacyjnego i zabezpiecz go taśmą miedzianą w taki sam sposób, jak opisano dla komory parowej.

Umieść 300 miligramów matrycy CHCA na szklanej szalce Petriego na dnie komory i rozprowadź ją równomiernie, aby utworzyć cienką warstwę kryształów matrycy. Zmontuj sublimator. I zabezpiecz dwie połówki zaciskiem podkowia.

Zmontowaną jednostkę zawieś od 15 do 20 centymetrów nad łaźnią piaskową, podgrzaną do 220 stopni Celsjusza, umieszczając ją w metalowym pierścieniu połączonym ze stojakiem retortowym. Podłącz komorę do źródła podciśnienia, włącz podciśnienie i pozwól mu ustabilizować się do około 25 militorów na pięć minut. Zapakuj palec chłodzący do góry lodem i dodaj 50 mililitrów wody.

Pozwól urządzeniu osiąść przez kolejne pięć minut, zanim przejdziesz dalej. Opuść komorę na powierzchnię stojaka, upewniając się, że piasek całkowicie styka się z dnem komory. Pozostaw na 45 minut, aby uzyskać idealną powłokę 0,22 miligrama na centymetr kwadratowy.

Po 45 minutach wyjmij komorę z kąpieli piaskowej, podnosząc metalowy pierścień i odpowietrz komorę. Po sublimacji zamontuj szkiełko do próbki w górnej części wcześniej zbudowanej komory parowej, tak jak poprzednio. Ostrożnie odpipetować 600 mikrolitrów roztworu zawierającego objętość jeden do jednego do objętości mieszaniny acetonitrylu i kwasu trifluorooctowego w wodzie na bibułę w dolnej części szalki Petriego, aby zapewnić równomierną powłokę.

Następnie zmontuj komorę, upewniając się, że zakładka papieru i szkiełko mikroskopu są idealnie wyrównane. Pozostaw komorę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Zeskanuj slajd w skanerze płaskim, aby utworzyć obraz cyfrowy.

Załaduj próbkę do spektrometru mas, a następnie przeanalizuj ją za pomocą odpowiedniej platformy oprogramowania. Na koniec przeanalizuj próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj prawidłowo przetworzoną próbkę tkanki, która została zobrazowana z prędkością 50 mikronów i wykazuje dobrą makrostrukturę oraz wyraźną różnicę między istotą białą a szarą.

Pomyślnie porównane próbki wykażą wyraźne zróżnicowanie w różnych lokalizacjach tkanek. Tutaj występuje wyraźny obszar regulacji w górę peptydu reprezentowany przez stosunek masy do ładunku wynoszący 1 085 w obszarze istoty białej, reprezentowanym przez obszary białe. Z kolei ta nieprawidłowo przygotowana próbka pokazuje poziom delokalizacji na dużą skalę.

Wzorce cząsteczek obecnych w trzech panelach wyraźnie pokazują, że nie ma jasnej definicji między regionami biologicznymi lub różnicami w obfitości wyświetlanych cząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobry pomysł na to, jak przygotować własne próbki do analizy obrazowania peptydów. Przy odpowiedniej procedurze metoda ta może być wykonana w ciągu ośmiu godzin w ciągu dwóch dni, co pozwala na etap trawienia przez noc.

Przygotowując tę metodologię, ważne jest, aby zachować ostrożność na każdym etapie. Wszelkie fizyczne uszkodzenia, które mają miejsce w tkance, zniszczą informacje przestrzenne zawarte w próbce. Pomysł na tę metodologię wpadł nam, kiedy po raz pierwszy rozpoczęliśmy nasze własne badania przestrzeni kosmicznej IMS i zdaliśmy sobie sprawę, że nie ma innych ostatecznych metodologii, które zostały opublikowane.

Przy niewielkich modyfikacjach nasza metodologia może być stosowana do analizy białek, peptydów, lipidów i innych małych cząsteczek. Po tej procedurze można następnie zastosować inne techniki histologiczne, takie jak immunofluorescencja oraz barwienie hematoksyliną i eozyną, aby uzyskać punkt odniesienia dla danych spektrometrii mas obrazowania. Podczas pracy z potencjalnie wybuchowymi chemikaliami, takimi jak ciekła nitroceluloza, ważne jest zachowanie prawidłowych procedur bezpieczeństwa.

Minimalizacja objętości roboczej i natychmiastowa utylizacja odpadów jest niezwykle ważna.