Name: Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Odkryj technologię arkusza komórkowego do tworzenia modelu raka wątrobowokomórkowego in vivo u szczurów nude. Ta metoda umożliwia badanie wpływu mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój nowotworu i testowanie terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować personelowi Laboratorium Chirurgii Eksperymentalnej i Zwierząt w College of Medicine, King Saud University, za współpracę i wsparcie - szczególnie Hussainowi Almukhayzimowi i Hishamowi Aloudahowi. Autorzy pragną również podziękować zespołowi medialnemu Uniwersytetu Króla Sauda bin Abdul-Aziza za przygotowanie materiału wizualnego, a w szczególności Muathowi bin Ghannamowi i Abdulwahabowi Alsulamiemu.

Protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etycznego Uniwersytetu Króla Sauda w zakresie opieki nad zwierzętami. Zabiegi chirurgiczne, środki znieczulające i inne leki stosowane u zwierząt są zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Króla Sauda. Wszystkie prace eksperymentalne wykonywane są przez odpowiednio przeszkolony personel.
1. Budowa arkusza komórkowego
<ol>
	<li>Posmaruj szalki hodowlane (3,5-centymetrowe szalki hodowlane reagujące na temperaturę) nierozcieńczoną płodową surowicą bydlęcą (FBS) i upewnij się, że pokryły całą powierzchnię naczynia. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny dla oderwania arkusza komórek, ponieważ wspomaga wzrost komórek w monowarstwie i zapobiega agregacji komórek.</li>
	<li>Inkubować szalki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza.</li>
	<li>Usuń nadmiar FBS z powlekanych naczyń i pozostaw naczynia do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować trzy zawiesiny komórek: 1 x 106 komórek HepG2, 1 x 106 komórek HepG2 z BMMSC i 1 x 106 komórek HepG2 z UCMSC (w stosunku 4:1 zarówno dla BMMSC, jak i UCMSC).</li>
	<li>Wysiew odpowiednią zawiesinę komórkową do każdego oznakowanego naczynia.</li>
	<li>Zawiesić wszystkie komórki w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95 % powietrza.</li>
</ol>
2. Oderwanie arkusza komórkowego
<ol>
	<li>Przy 100% zbiegu komórek wyjmij naczynia z inkubatora w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inkubować szalkę z arkuszem komórek HepG2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, podczas gdy szalki z arkuszy komórek HepG2/BMMSC i HepG2/UCMSC przez 30 - 40 minut w temperaturze 20 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2 i 95% powietrza. 
	UWAGA: Arkusz komórek wykonany tylko z HepG2 jest delikatny; obniżenie temperatury do 20 °C powoduje uszkodzenia struktury blachy.</li>
</ol>
3. Wykonanie zabiegu chirurgicznego
Uwaga: Podczas czasu inkubacji do oderwania arkusza komórkowego, rozpocznij procedurę na zwierzętach.
<ol>
	<li>Instrukcja przygotowania obszaru operacyjnego
	<ol>
		<li>Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy przeprowadzać w sterylnym, oddzielnym miejscu w laboratorium, takim jak kaptur, komora laminarna lub aseptyczny sala operacyjna. Upewnij się, że wszystkie powierzchnie obszaru operacyjnego są nieporowate, uszczelnione, trwałe i nadające się do dezynfekcji.</li>
		<li>Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuchy, rękawice, maski na twarz oraz pokrowce na głowę i buty.</li>
		<li>Na początku operacji należy używać narzędzi chirurgicznych, które są czyste i wysterylizowane (poprzez autoklawowanie; nasączony trzpień pod wysokim ciśnieniem).</li>
		<li>Zmieniaj rękawiczki między szczurami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
	<ol>
		<li>Użyj nagich szczurów w wieku od 8 do 12 tygodni.</li>
		<li>Stwórz znieczulenie do wstrzykiwań dla szczurów.
		<ol>
			<li>Aby przygotować roztwór znieczulający, ketaminę-ksylazynę, zmieszać 2 ml ketaminy, 1 ml ksylazyny (w stężeniu 20 mg/ml) i 1 ml sterylnej soli fizjologicznej (np. 0,9% chlorku sodu) w sterylnej fiolce do pobierania surowicy o pojemności 10 ml i dobrze wstrząsnąć przed użyciem.</li>
			<li>Aby zastosować znieczulenie, wstrzyknąć dootrzewnowo 0,2 ml roztworu ketaminy-ksylazyny na 100 g masy ciała szczura. 
			UWAGA: Całkowita dawka roztworu wynosi 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń widoczny brud/zanieczyszczenia z pola operacyjnego.</li>
		<li>Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału (przyciśnięcie opuszki stopy do obu tylnych stóp). 
		UWAGA: Jeśli uszczypnięcie opuszki stopy powoduje reakcję, powtórz dawkę 0,05 ml/100 g (mniej więcej co 30 minut), a następnie ponownie sprawdź głębokość znieczulenia.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny dwuetapowym peelingiem z użyciem jodu powidonu/izopropanolu.</li>
		<li>Przykryj szczura sterylną serwetą, aby uniknąć zanieczyszczenia nacięcia.</li>
		<li>Wstrzyknąć szczurom podskórnie buprenorfinę (0,01 - 0,05 mg/kg)8 przed wykonaniem nacięcia.</li>
		<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj od 7 do 10 cm nacięcia między skórami a leżącymi pod nimi mięśniami, aby odsłonić wątrobę.
		<ol>
			<li>Oddziel mięsień brzucha od skóry płaską tylną krawędzią skalpela.</li>
			<li>Ostrożnie dźgnij linea alba za pomocą skalpela i przedłuż cięcie ostrymi nożyczkami.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeszczep arkusza komórkowego
Uwaga: Przeszczep komórek jest wykonywany na wątrobie.
<ol>
	<li>Zbierz arkusz komórek z naczynia hodowlanego.
	<ol>
		<li>Delikatnie postukaj naczyniem hodowlanym o ławkę, aby oderwać arkusz od jego powierzchni.</li>
		<li>Oddziel arkusz komórek od powierzchni naczynia, zeskrobując krawędź arkusza w półkolu za pomocą sterylnej końcówki pipety.</li>
		<li>Delikatnie wyjmij całą pożywkę z naczynia hodowlanego.</li>
		<li>Upewnij się, że arkusz jest nienaruszony i bez żadnych uszkodzeń, w przeciwnym razie nie można go użyć (Rysunek 1). 
		UWAGA: Powstałe arkusze mogą być wykrywane bezpośrednio przez oko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sterylną membranę (bibułę filtracyjną), aby pobrać arkusz komórek z naczynia.
	<ol>
		<li>Najpierw namocz membranę zwykłą solą fizjologiczną. Następnie usuń nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnego wacika.</li>
		<li>Umieść mokrą membranę na arkuszu komórek, unikając zagnieceń i pęcherzyków powietrza między membraną a arkuszem komórek.</li>
		<li>Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej na membranę i arkusz komórek, aby łatwiej je zebrać. 
		Uwaga: Aby uniknąć zerwania arkusza komórek, nie używaj zimnej soli fizjologicznej i podnoś membranę i arkusz komórek za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Pozostaw membranę na kilka sekund, aby upewnić się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do membrany, a następnie zbierz go.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wątrobę do przeszczepu arkusza komórek.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że powierzchnia wątroby jest sucha, delikatnie stukając w nią sterylnym wacikiem.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść membranę z arkuszem komórek na pojedynczym płacie wątroby szczura.</li>
		<li>Dodaj kilka kropli sterylnej soli fizjologicznej i delikatnie dociśnij membranę, aby oderwać od niej arkusz komórek.</li>
		<li>Odczekaj 5 minut przed ostrożnym zdjęciem membrany. 
		UWAGA: Ma to na celu upewnienie się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do wątroby.</li>
		<li>Na koniec zamknij leżące poniżej mięśnie i nacięcia skóry za pomocą nylonowych szwów 5-0.</li>
		<li>Zdezynfekować obszar operacyjny za pomocą powidonu-jodu. 
		Uwaga: <silna klasa="xfig">Rysunek 2 pokazuje schemat procedury przeszczepu arkusza komórkowego na wątrobie nagiego szczura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Bezpośrednio po operacji należy umieścić szczura indywidualnie, aby uniknąć kanibalizmu lub uduszenia, i regularnie go monitorować (co najmniej co 15 minut), aż będzie przytomny i w pełni zdolny do poruszania się.</li>
	<li>Następnie oceniaj szczury codziennie przez 5 - 14 dni, co najmniej 5 dni po operacji, aby upewnić się, że nie ma żadnych komplikacji. Podczas codziennej oceny upewnij się, że spełnione są następujące warunki.
	<ol>
		<li>Rana jest zamknięta, a szwy nienaruszone, bez nadmiernego ucisku.</li>
		<li>W miejscu nacięcia nie ma oznak infekcji, takich jak ciepło, nadmierny obrzęk czy ropna wydzielina.</li>
		<li>Nie ma żadnych objawów związanych z bólem, takich jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, utrata masy ciała, odwodnienie, zwijanie skóry lub szybki i otwarty oddech w ustach. Aby opanować umiarkowany lub silny ból pooperacyjny, jeśli występuje, należy wstrzykiwać szczurom podskórnie buprenorfinę (0,01 - 0,05 mg / kg) co 6 - 8 godzin 9 przez minimum 48 - 72 godziny po operacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza przeszczepionego obszaru
<ol>
	<li>Miesiąc po przeszczepie należy skaryfikować szczura i pobrać przeszczepiony obszar do analizy histologicznej i immunohistochemicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088(2010).</li>
<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
<li>Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats">https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats</a> (2017).</li>
<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
<li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).</li>
<li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reports%22%5BJournal%5D)">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li>
<li>Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+in+vivo+cancer+model+using+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering.</a> Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szeroko zakrojona liczba badań poświęcona jest opracowaniu odpowiedniego przedklinicznego modelu zwierzęcego in vivo , który przypomina ludzkie nowotwory. Obecnie główne podejścia stosowane do tworzenia zwierzęcych modeli nowotworów obejmują inżynierię genetyczną i przeszczepianie komórek11. Genetycznie modyfikowane modele zwierzęce są dobrymi narzędziami do identyfikacji i walidacji docelowych genów, a także do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw toksyczności wywołan...

HCC to pierwotny rak wątroby, który jest znacząco związany ze złym rokowaniem. Rocznie u prawie pół miliona nowych pacjentów diagnozuje się HCC, co stanowi 85% pacjentów z rakiem wątroby na całym świecie1. Hepatokarcynogeneza nie jest chorobą występującą w jednej postaci; Jest to raczej zbiór chorób, które mają różne cechy histopatologiczne oraz zmienność genetyczną i genomową, a także zróżnicowane wyniki prognostyczne <klasa SUP="xref">1. Dlatego głównymi wyzwaniami w opracowaniu skutecznej strategii terapeutycznej HCC są ograniczona wiedza na temat biologii HCC oraz brak odpowiedniego eksperymentalnego modelu zwierzęcego, który mógłby pomóc w zrozumieniu tej złożonej choroby. Model zwierzęcy in vivo, który naśladuje ludzkiego raka, jest niezbędny do selekcji genów kandydujących i identyfikacji markerów prognostycznych/predykcyjnych związanych z indukcją raka, a także do badania różnych czynników, które mogą wpływać na reakcje raka na środki terapeutyczne.
Badania in vitro nad rakiem nadal wiążą się z poważnymi ograniczeniami. Wynika to z faktu, że komórki nowotworowe tracą wiele ze swoich cech in vivo, gdy są utrzymywane w hodowli. Zmiany, które zachodzą w komórkach in vitro, wynikają z braku fizjologii całej tkanki w warunkach ex vivo. Interakcja rakowa między komórkami (zrębowa, immunologiczna, naczyniowa, nabłonkowa itp.) w mikrośrodowisku guza ma ogromny wpływ na charakterystykę komórek rakowych2. Mikrośrodowisko guza może zmieniać ekspresję genów/białek komórek nowotworowych i cechy fenotypowe, a także potencjały angiogenetyczne i przerzutowe. W dwuwymiarowym (2-D) systemie hodowli in vitro brakuje również odpowiedniej macierzy tkankowej, która jest niezbędna do regulacji progresji nowotworu. W związku z tym, ze względu na te ograniczenia, modele in vivo powinny być zawsze wykorzystywane do wspierania wstępnych wyników modeli in vitro. W tym badaniu wykorzystujemy technologię arkuszy komórkowych do opracowania modelu zwierzęcego in vivo, który wyjaśnia cały proces biologiczny leżący u podstaw HCC.
Ponad dziesięć lat temu, laboratorium Okano stworzyło nowatorską metodę inżynierii tkankowej opartą na technologii arkuszy komórkowych3. Technika ta wykorzystuje termoczułe tworzywo hodowlane, aby umożliwić odwracalną adhezję/odklejanie komórek poprzez kontrolowanie hydrofobowości powierzchni. Metoda ta pozwala na delikatne zbieranie hodowanych komórek w nienaruszonym formacie trójwymiarowym (3D) (tj. arkuszu komórek), z dobrze zachowaną macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i interakcjami międzykomórkowymi. Technika arkusza komórkowego wymaga wstępnego powlekania szalek hodowlanych reagującym na temperaturę polimerowym poli(N-izopropylolakrylamidem) (Am), który jest dostępny na rynku i gotowy do użycia. W temperaturze poniżej 20 °C polimery Am ulegają uwodnieniu i rozpuszczają się w roztworach wodnych, natomiast w wyższej temperaturze (37 °C) polimery ulegają odwodnieniu i przekształcają się w mętny osad. Polimer zawiera hydrofilowe łańcuchy amidowe i hydrofobowe łańcuchy boczne (grupy izopropylowe). W wysokich temperaturach ruch Browna cząsteczek wody jest zintensyfikowany, podczas gdy w niskiej temperaturze cząsteczki wody otaczające grupy izopropylowe struktury uwodnionej rozpadają się i grupy hydrofobowego agregatu izopropylowego na skutek oddziaływań hydrofobowych. W związku z tym cały łańcuch polimeru agreguje się i wytrąca 4.
W prezentowanym badaniu, technika ta została wykorzystana do opracowania modelu zwierzęcego HCC przy użyciu trzech różnych arkuszy komórek. Pierwszy zastosowany arkusz składa się wyłącznie z komórek linii komórkowej HCC, podczas gdy pozostałe dwa arkusze składają się z kombinacji komórek linii komórkowej HCC i MSC pochodzących z dwóch różnych źródeł: MSC szpiku kostnego (BMMSC) i MSC rdzenia pępowinowego (UCMSC). MSCs to niehematopoetyczne komórki zrębowe, które są zdolne do różnicowania pochodnych wewnątrzkomórkowych linii mezenchymalnej, w tym adipocytów, osteocytów, chondrocytów i miocytów5. Powodem, dla którego wykorzystujemy te komórki podczas tworzenia arkusza komórek rakowych, jest niespójne raportowanie wpływu MSCs na nowotwory. Zasugerowano, że MSCs mogą mieć dwa różne fenotypy: "MSC1", fenotyp prozapalny i "MSC2", fenotyp immunosupresyjny6. MSCs wyrażają receptory toll-podobne (TLR). Pobudzanie TLR4 MSCs zwiększa wydzielanie przez nie czynników prozapalnych, podczas gdy torowanie TLR3 zwiększa wydzielanie czynników immunosupresyjnych6. Badanie in vitro tych dwóch fenotypów wykazało, że kokultura MSC1 z liniami komórek rakowych osłabiała wzrost komórek rakowych, podczas gdy kohodowla MSC2 miała odwrotny efekt7. Oznacza to, że MSCs mogą być pronowotworowe lub przeciwnowotworowe, w zależności od ich fenotypu. W związku z tym, oprócz opracowania modelu zwierzęcego HCC przy użyciu technologii arkuszy komórkowych, chcemy zbadać wpływ przeszczepów MSC na rozwój guza oraz to, czy użycie tych komórek wzmocni, czy ograniczy rozwój tego modelu.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna&nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa HepG2</td><td>ATCC, USA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa MSCs ludzkiego szpiku kostnego</td><td>PromoCell, USA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>ludzka tkanka pępowinowa MSCs</td><td>PromoCell, USA&nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 50%</td><td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 2%</td><td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alfadyna&reg; &nbsp; rozwiązanie.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazówki:&nbsp; </mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowa probówka wirówkowa PP o wysokiej czystości</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>3,5 cm sterylne szalki do hodowli UpCell z bibułą filtracyjną (membraną)</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; l &nbsp; Końcówki do pipet&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowa procedura serwety</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; Pipeta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus, zmienna objętość</td><td>Eppendorf&reg; &nbsp; Badania&reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator kultur tkankowych 20 &deg; C, 5% CO2</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia chirurgiczne i nagie szczury:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> skalpel&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Szew nylonowy&nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilament, Lancet</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawki tuberkulinowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Nagie szczury&nbsp;</td><td>Rzeka</td><td></td><td></td> Karola</tr></tbody></table>

badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Model zwierzęcy in vivo, który naśladuje ludzkiego raka, może mieć różne zastosowania, które dostarczają istotnych informacji klinicznych. Obecnie stosowane techniki opracowywania modeli nowotworów in vivo mają znaczne ograniczenia. Dlatego w tym badaniu dążymy do wdrożenia technologii arkuszy komórkowych w celu opracowania modelu raka in vivo. Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest z powodzeniem rozwijany u nagich szczurów przy użyciu arkuszy komórkowych utworzonych z komórek linii komórkowej HCC. Arkusze komórek rakowych są generowane w wyniku adhezji wewnątrzkomórkowej i tworzenia struktury warstwowej, kontrolowanej przez macierz zewnątrzkomórkową. Pozwala to na przeszczepienie arkusza HCC do wątroby i stworzenie modelu zwierzęcego z guzem w ciągu miesiąca. Ponadto badana jest rola mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w rozwoju tego modelu nowotworu. Oprócz arkusza linii komórkowej HCC tworzone są kolejne dwa arkusze komórek: arkusz komórek HCC i MSC szpiku kostnego (BMMSC) oraz arkusz komórek HCC i MSC pępowiny (UCMSC). Arkusze, które zawierają kombinację zarówno komórek HCC, jak i MSC, są również zdolne do wytworzenia zwierzęcia z nowotworem. Jednak dodanie MSCs zmniejsza rozmiar powstałego guza, a ten niekorzystny wpływ na rozwój guza różni się w zależności od źródła zastosowanych MSCs. Wskazuje to, że arkusz komórek wykonany z niektórych podtypów MSC może być wykorzystany w leczeniu i kontroli nowotworu.

Tumorogenność przeszczepionych arkuszy komórkowych u szczurów:
Miesiąc po transplantacji we wszystkich arkuszach komórek przeszczepionych do wątrób szczurów rozwinęły się guzy (Rysunek 3). Średnia wielkość guzów powstałych z arkuszy komórek HepG2, HepG2/BMMSC oraz HepG2/UCMSC wynosiła odpowiednio 4,5 cm, 4 cm i 2,5 cm10.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Tutaj prezentujemy protokół do opracowania modelu raka in vivo przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Taki model może być bardzo przydatny do oceny terapii przeciwnowotworowych.

Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Witam, nazywam się dr Alaa Alshareeda z Międzynarodowego Centrum Badań Medycznych im. Króla Abdullaha na Wydziale Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej. Dzisiaj będziemy demonstrować wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój raka wątrobowokomórkowego na modelu szczurzym za pomocą technologii arkuszy komórkowych. Cześć, nazywam się Abdullah Almubarak.Pracuję w Chirurgii Eksperymentalnej i Laboratorium Zwierząt na Uniwersytecie Króla Sauda. Używamy nagiego szczura, aby uniknąć odrzucenia po przeszczepieniu arkusza komórek. Ten diagram przedstawia procedurę przeszczepu arkusza komórkowego na nagich szczurach.W tym badaniu zostaną wykorzystane nagie szczury w wieku od 8 do 12 tygodni. Najpierw zetnij szczury i wykonaj od siedmiu do dziesięciu centymetrów nacięcia między skórą a leżącymi pod nią mięśniami za pomocą skalpela, aby odsłonić wątrobę. Aby przenieść arkusz komórek, użyj sterylnej membrany.Umieść membranę na arkuszu komórek, aby ją zebrać. Następnie umieść arkusz komórek z błoną na jednym płacie wątroby. Konstrukcja arkusza komórkowego.Przed wysianiem komórek pokryj 3,5-centymetrowe szalki hodowlane UpCell reagującymi na temperaturę nierozcieńczonymi FBS. Powlekanie naczyń FBS wspomaga wzrost komórek w warstwie błony i zapobiega degradacji komórek. Upewnij się, że pokryłeś całą powierzchnię naczyń.Inkubuj naczynia przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Następnego dnia usuń nadmiar FBS i pozostaw naczynia do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Wysiewaj co najmniej milion komórek rakowych HepG2 samodzielnie lub w korozji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi do pożywki hodowlanej DMEM.Pożywka uzupełniona o 10% FBS i 1% penicylinę-streptomycynę. Stosunek komórek nowotworowych do mezenchymalnych komórek macierzystych w tym badaniu wynosi 4:1. Po dodaniu komórek delikatnie potrząśnij naczyniami.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Oderwanie arkusza komórki. Przy 100% zbiegu komórek wyjmij naczynia z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Teraz inkubuj arkusz komórek rakowych HepG2 przez godzinę w temperaturze pokojowej, podczas gdy inkubuj HepG2 współhodowany z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi przez 30 do 40 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla w 95% powietrzu. W czasie inkubacji w celu oderwania arkusza komórkowego należy rozpocząć procedurę na zwierzętach. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Króla Sauda.Wykonanie zabiegu chirurgicznego. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału. Zdezynfekuj obszar operacji jodem.Teraz nałóż drugi peeling z jodem. Przykryj zwierzę wysterylizowaną serwetą, aby uniknąć zanieczyszczenia nacięcia. Za pomocą wysterylizowanego skalpela wykonaj nacięcie między skórą a leżącymi pod nią mięśniami, o wielkości około siedmiu do dziesięciu centymetrów, aby odsłonić wątrobę.Oddziel mięsień brzucha od skóry płaską tylną krawędzią skalpela. Ostrożnie dźgnij linea alba za pomocą skalpela i przedłuż cięcie ostrymi nożyczkami. Przeszczep arkusza komórkowego na wątrobie szczura.Delikatnie postukaj naczyniem hodowlanym o ławkę, aby oderwać arkusz od jego powierzchni. Oddziel arkusz komórek od powierzchni naczynia, zeskrobując krawędzie arkusza w półkolu. Teraz delikatnie usuń całą pożywkę hodowlaną z naczynia.Upewnij się, że arkusz jest nienaruszony i bez żadnych uszkodzeń, w przeciwnym razie nie można go użyć. Przygotuj sterylną błonę do zbioru i przenieś arkusz komórek. Dlatego najpierw namocz membranę zwykłą solą fizjologiczną, a następnie usuń nadmiar soli fizjologicznej sterylnym wacikiem.Umieść mokrą membranę na arkuszu komórek, unikając pęcherzyków powietrza między membraną a arkuszem komórek. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej na membranę i arkusz komórek, aby zebrać materiał. Pozostaw membranę na kilka sekund, aby upewnić się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do membrany, a następnie zbierz go.Teraz przygotuj wątrobę do przeszczepu. Upewnij się, że powierzchnia wątroby jest sucha. Umieść błonę z arkuszem komórek na pojedynczym płacie wątroby szczura.Dodaj kilka kropli wysterylizowanej soli fizjologicznej, aby oderwać arkusz komórek od membrany. Odczekaj pięć minut przed ostrożnym usunięciem membrany. Arkusz komórek można zobaczyć przymocowany do wątroby w tym filmie.Na koniec zamknij leżące poniżej mięśnie i nacięcia skóry za pomocą pięciu nylonowych szwów. Po zamknięciu nacięcia należy zdezynfekować obszar operowany betadyną. Czas od znieczulenia do głowy w górę jest zmienny, ale zwykle wynosi od pięciu do 20 minut.Ten rysunek pokazuje rozwinięty guz na wątrobie szczura po miesiącu od przeszczepu arkusza komórek HepG2. W tym przypadku guz rozwinął się po przeszczepieniu komórek nowotworowych HepG2 wytworzonych w arkuszu komórek i mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Podczas gdy ten pokazuje, najmniejszy rozwinięty guz na wątrobie szczura po przeszczepieniu arkusza komórkowego wykonanego z komórek rakowych HepG2 i mezenchymalnej komórki macierzystej struny pępowinowej, ten rysunek pokazuje barwienie H i E wątroby szczura po miesiącu od przeszczepu arkusza komórek.Gdzie A reprezentuje normalne komórki wątroby szczura, a B pokazuje rakowe komórki wątroby szczura. Konkluzja. Więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie rozwinąć model raka wątrobowokomórkowego na nagim szczurze przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Dziękuję za oglądanie.

exploring-potential-mesenchymal-stem-cell-sheet-on-development

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Przedstawiono przygotowanie i przeszczep arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) na niedostatecznie zszyte zespolenia jelita grubego w modelu szczurzym. To nowatorskie zastosowanie pokazuje, że arkusze ASC mogą zmniejszyć nieszczelność zespolenia jelita grubego.

Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

Ten artykuł dostarcza efektywnej i wykonalnej metody tworzenia wielowarstwowych arkuszy komórek macierzystych o korzystnych właściwościach komórek macierzystych.

Budowa wielowarstwowego arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych z systemem dynamicznej hodowli 3D

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Choroby wątroby są wywoływane przez wiele przyczyn, które sprzyjają zwłóknieniu lub marskości wątroby. Przeszczep to jedyna opcja na odzyskanie zdrowia. Biorąc jednak pod uwagę niedobór narządów nadających się do przeszczepu, należy zbadać alternatywne rozwiązania. Nasze badania proponują wszczepienie rusztowań kolagenowych w tkance wątroby z modelu zwierzęcego.

Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Odkryj technologię arkusza komórkowego do tworzenia modelu raka wątrobowokomórkowego in vivo u szczurów nude. Ta metoda umożliwia badanie wpływu mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój nowotworu i testowanie terapii przeciwnowotworowych.

Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo

Przeglądaj więcej filmów