Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo
11 września 2018
Tutaj prezentujemy protokół do opracowania modelu raka in vivo przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Taki model może być bardzo przydatny do oceny terapii przeciwnowotworowych.
Witam, nazywam się dr Alaa Alshareeda z Międzynarodowego Centrum Badań Medycznych im. Króla Abdullaha na Wydziale Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej. Dzisiaj będziemy demonstrować wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój raka wątrobowokomórkowego na modelu szczurzym za pomocą technologii arkuszy komórkowych. Cześć, nazywam się Abdullah Almubarak.
Pracuję w Chirurgii Eksperymentalnej i Laboratorium Zwierząt na Uniwersytecie Króla Sauda. Używamy nagiego szczura, aby uniknąć odrzucenia po przeszczepieniu arkusza komórek. Ten diagram przedstawia procedurę przeszczepu arkusza komórkowego na nagich szczurach.
W tym badaniu zostaną wykorzystane nagie szczury w wieku od 8 do 12 tygodni. Najpierw zetnij szczury i wykonaj od siedmiu do dziesięciu centymetrów nacięcia między skórą a leżącymi pod nią mięśniami za pomocą skalpela, aby odsłonić wątrobę. Aby przenieść arkusz komórek, użyj sterylnej membrany.
Umieść membranę na arkuszu komórek, aby ją zebrać. Następnie umieść arkusz komórek z błoną na jednym płacie wątroby. Konstrukcja arkusza komórkowego.
Przed wysianiem komórek pokryj 3,5-centymetrowe szalki hodowlane UpCell reagującymi na temperaturę nierozcieńczonymi FBS. Powlekanie naczyń FBS wspomaga wzrost komórek w warstwie błony i zapobiega degradacji komórek. Upewnij się, że pokryłeś całą powierzchnię naczyń.
Inkubuj naczynia przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Następnego dnia usuń nadmiar FBS i pozostaw naczynia do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Wysiewaj co najmniej milion komórek rakowych HepG2 samodzielnie lub w korozji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi do pożywki hodowlanej DMEM.
Pożywka uzupełniona o 10% FBS i 1% penicylinę-streptomycynę. Stosunek komórek nowotworowych do mezenchymalnych komórek macierzystych w tym badaniu wynosi 4:1. Po dodaniu komórek delikatnie potrząśnij naczyniami.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Oderwanie arkusza komórki. Przy 100% zbiegu komórek wyjmij naczynia z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Teraz inkubuj arkusz komórek rakowych HepG2 przez godzinę w temperaturze pokojowej, podczas gdy inkubuj HepG2 współhodowany z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi przez 30 do 40 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla w 95% powietrzu. W czasie inkubacji w celu oderwania arkusza komórkowego należy rozpocząć procedurę na zwierzętach. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Króla Sauda.
Wykonanie zabiegu chirurgicznego. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału. Zdezynfekuj obszar operacji jodem.
Teraz nałóż drugi peeling z jodem. Przykryj zwierzę wysterylizowaną serwetą, aby uniknąć zanieczyszczenia nacięcia. Za pomocą wysterylizowanego skalpela wykonaj nacięcie między skórą a leżącymi pod nią mięśniami, o wielkości około siedmiu do dziesięciu centymetrów, aby odsłonić wątrobę.
Oddziel mięsień brzucha od skóry płaską tylną krawędzią skalpela. Ostrożnie dźgnij linea alba za pomocą skalpela i przedłuż cięcie ostrymi nożyczkami. Przeszczep arkusza komórkowego na wątrobie szczura.
Delikatnie postukaj naczyniem hodowlanym o ławkę, aby oderwać arkusz od jego powierzchni. Oddziel arkusz komórek od powierzchni naczynia, zeskrobując krawędzie arkusza w półkolu. Teraz delikatnie usuń całą pożywkę hodowlaną z naczynia.
Upewnij się, że arkusz jest nienaruszony i bez żadnych uszkodzeń, w przeciwnym razie nie można go użyć. Przygotuj sterylną błonę do zbioru i przenieś arkusz komórek. Dlatego najpierw namocz membranę zwykłą solą fizjologiczną, a następnie usuń nadmiar soli fizjologicznej sterylnym wacikiem.
Umieść mokrą membranę na arkuszu komórek, unikając pęcherzyków powietrza między membraną a arkuszem komórek. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej na membranę i arkusz komórek, aby zebrać materiał. Pozostaw membranę na kilka sekund, aby upewnić się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do membrany, a następnie zbierz go.
Teraz przygotuj wątrobę do przeszczepu. Upewnij się, że powierzchnia wątroby jest sucha. Umieść błonę z arkuszem komórek na pojedynczym płacie wątroby szczura.
Dodaj kilka kropli wysterylizowanej soli fizjologicznej, aby oderwać arkusz komórek od membrany. Odczekaj pięć minut przed ostrożnym usunięciem membrany. Arkusz komórek można zobaczyć przymocowany do wątroby w tym filmie.
Na koniec zamknij leżące poniżej mięśnie i nacięcia skóry za pomocą pięciu nylonowych szwów. Po zamknięciu nacięcia należy zdezynfekować obszar operowany betadyną. Czas od znieczulenia do głowy w górę jest zmienny, ale zwykle wynosi od pięciu do 20 minut.
Ten rysunek pokazuje rozwinięty guz na wątrobie szczura po miesiącu od przeszczepu arkusza komórek HepG2. W tym przypadku guz rozwinął się po przeszczepieniu komórek nowotworowych HepG2 wytworzonych w arkuszu komórek i mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Podczas gdy ten pokazuje, najmniejszy rozwinięty guz na wątrobie szczura po przeszczepieniu arkusza komórkowego wykonanego z komórek rakowych HepG2 i mezenchymalnej komórki macierzystej struny pępowinowej, ten rysunek pokazuje barwienie H i E wątroby szczura po miesiącu od przeszczepu arkusza komórek.
Gdzie A reprezentuje normalne komórki wątroby szczura, a B pokazuje rakowe komórki wątroby szczura. Konkluzja. Więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie rozwinąć model raka wątrobowokomórkowego na nagim szczurze przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Dziękuję za oglądanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół opracowania modelu nowotworu in vivo z wykorzystaniem technologii arkuszy komórkowych. Model ten został zaprojektowany w celu skutecznej oceny terapeutyków przeciwnowotworowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Rak wątrobowokomórkowy jest częstym typem raka wątroby.
- Mezenchymalne komórki macierzyste wykazują potencjalne działanie terapeutyczne w leczeniu nowotworów.
- Technologia arkuszy komórkowych umożliwia skuteczny przeszczep komórek.
- Szczury nude są wykorzystywane w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepionych komórek.
Cel badania
- Wykazanie wpływu mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój raka hepatokomórkowego.
- Wykorzystanie technologii arkuszy komórkowych do opracowania modelu nowotworu.
- Zapewnienie wiarygodnej metody testowania terapii przeciwnowotworowych.
Zastosowane metody
- Transplantacja arkuszy komórkowych w modelach szczurów nago (nude rats).
- Ocena rozwoju nowotworu po transplantacji.
- Wykorzystanie schematów do zilustrowania procedury transplantacji.
- Współpraca między instytucjami badawczymi w celu przeprowadzenia kompleksowej analizy.
Główne wyniki
- Pomocna transplantacja arkuszy komórkowych u szczurów nago\.
- Obserwacja wpływu mezenchymalnych komórek macierzystych na rozwój nowotworu\.
- Ustanowienie wiarygodnego modelu raka in vivo\.
- Potencjał do dalszego testowania terapeutyków przeciwnowotworowych\.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do modelowania nowotworów.
- Technologia arkuszy komórkowych wykazuje potencjał w zastosowaniach terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu oceny leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technologia arkuszy komórkowych umożliwia tworzenie powtarzalnych modeli in vivo raka hepatokomórkowego (HCC), wspierając analizę mechanistyczną w celu minimalizacji ryzyka oraz walidację celów terapeutycznych w procesach rozwoju leków onkologicznych. Integracja mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) w tych modelach zapewnia platformę do badania oddziaływań między guzem a zrąbem oraz ich wpływu na wzrost nowotworu. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną podczas oceny kandydatów w badaniach przedklinicznych i pozwala na podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Ułatwia walidację funkcjonalną ścieżek tumorigennych w fizjologicznie istotnym modelu zwierzęcym.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację efektów poszczególnych subtypów MSC na progresję HCC.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez modelowanie oddziaływań między guzem a mikrośrodowiskiem.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowaną platformę in vivo do oceny modulacji wzrostu guza przez komponenty komórkowe.
- Zapewnia powtarzalny harmonogram tworzenia guzów, co umożliwia ilościową ocenę efektów interwencji.
- Umożliwia opracowanie testów do pomiaru wielkości guza oraz zmian histopatologicznych po transplantacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelowaniem istotnym dla przebiegu choroby poprzez odtworzenie cech ludzkiego HCC u szczurów z niedoborem odporności.
- Wspiera poszukiwanie biomarkerów translacyjnych poprzez histologiczną i morfologiczną ocenę nowotworu.
- Umożliwia podejmowanie przedklinicznych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie wpływu MSC na rozwój nowotworu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model HCC oparty na arkuszach komórkowych wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka związanego z kandydatami przed inwestycjami w późniejszych etapach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie interakcji między MSC a guzami oraz modulację szlaków sygnałowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalny test in vivo do oceny potencjału tumorigenicznego oraz efektów interwencji.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wielkości guza i punktów końcowych histopatologicznych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną poprzez modelowanie klinicznie istotnej biologii nowotworów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę, którą można dostosować do różnych typów komórek i składników zrębu w szerszych zastosowaniach onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad biologią nowotworów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie in vivo i wspiera powtarzalność wyników między zespołami badawczymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym rozwijanie projektów onkologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wyjaśnienie roli MSC w progresji nowotworu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, chirurgii zwierząt oraz analizie histopatologicznej.
- Wymaga dostępu do naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę oraz immunodeficyjnych modeli zwierzęcych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania arkuszy komórkowych i transplantacji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych typów nowotworów lub źródeł komórek zrębowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia modelu obejmują odpowiedzi specyficzne dla gatunku oraz skalowalność w przypadku przesiewu wysokoprzepustowego.
