Wolumetryczna metoda ilościowego oznaczania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego
28 lipca 2018
Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, która pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję drzewa naczyniowo-mózgowego u myszy po mikrotomografii komputerowej i określeniu objętości całych segmentów naczynia, które mogą być użyte do ilościowego określenia skurczu naczyń mózgowych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie skurczu naczyń mózgowych u myszy po indukcji krwotoku podpajęczynówkowego. Osiąga się to poprzez poddanie zwierzęcia perfuzji przezsercowej i odlewu wewnątrznaczyniowemu przy użyciu nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich środka odlewniczego. Kolejnym krokiem jest uzyskanie danych obrazowych w przekroju poprzecznym, poprzez poddanie mózgu tomografii mikrokomputerowej.
Następnie przetwarzany jest obraz i dane. Oprogramowanie Miro służy do wirtualnej rekonstrukcji wewnątrzczaszkowego drzewa naczyniowego i obliczania objętości zdefiniowanych segmentów naczyń, które stanowią obiektywną miarę do ilościowego określenia skurczu naczynia. Krwotok podpajęczynówkowy jest wywoływany u myszy przez wewnątrznaczyniową perforację włókien w znieczuleniu izofluranem.
Lewa tętnica szyjna zewnętrzna jest preparowana chirurgicznie. Następnie włókno jest wprowadzane do tętnicy szyjnej zewnętrznej i przesuwa się wewnątrz czaszki przez tętnicę szyjną wewnętrzną, która jest perforowana w tętnicy szyjnej t, wywołując krwotok podpajęczynówkowy. Wzrost ciśnienia wewnątrzczaszkowego jest traktowany jako wskaźnik udanej perforacji wewnątrznaczyniowej.
Aby przeanalizować skurcz naczyń krwionośnych, wywołaj znieczulenie. Kontynuuj dopiero po osiągnięciu wystarczającego poziomu znieczulenia, co potwierdza brak reakcji na bodźce bólowe. Wykonaj perfuzję przezsercową przy użyciu następujących roztworów.
Fizjologiczny roztwór soli zawierający fizjologiczne stężenia sodu, potasu, wapnia i magnezu o pH siedmiu punktów czterech. A następnie 4% roztwór PFA. Rozpocznij obfitowanie roztworem numer jeden przez dwie minuty i kontynuuj z roztworem numer dwa przez cztery minuty.
Zaparzaj roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj pompy sterowanej ciśnieniem o zmiennej szybkości perfuzji do perfuzji przy stałym ciśnieniu 70 milimetrów słupa rtęci. Unikaj utraty ciśnienia podczas przełączania z rozwiązania pierwszego na rozwiązanie drugie. Po perfuzji z obydwoma roztworami kontynuować perfuzję przez 20 minut w temperaturze pokojowej z nieprzepuszczającym promieni rentgenowskich środkiem odlewniczym ze stałą szybkością dwóch mililitrów na minutę.
Trzymać próbkę do utwardzenia materiału odlewczego nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Usuń mózg i przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 4% roztworze PFA do momentu uzyskania mikro-setisiny. Umieść mózg w środku plastikowej rurki za pomocą anatomicznych kleszczy.
Wybierz rurkę o nieco większej średnicy niż próbka, aby upewnić się, że obiekt nie porusza się podczas akwizycji obrazu. Użyj gazy, aby zamknąć rurkę. Przymocuj plastikową rurkę za pomocą mikrosilnika krokowego komputerowego systemu pozycjonowania sterowanego sterowaniem w kabinie rentgenowskiej, w której obiekt jest obracany wokół swojej osi poziomej.
Wyrównaj próbkę w polu view pod radiografią rentgenowską. Aby osiągnąć maksymalne powiększenie, umieść obiekt jak najbliżej źródła promieniowania rentgenowskiego i zmaksymalizuj odległość od detektora tak daleko, jak to możliwe. Użyj protokołu akwizycji obrazu krok i zrób zdjęcie z następującymi parametrami skanowania.
Ustaw czas ekspozycji na jedną sekundę dla każdej projekcji i użyj napięcia lampy 80 kilowoltów, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu. Ustaw liczbę projekcji na 1 000 dla jednego obrotu. Do rekonstrukcji surowych danych należy użyć algorytmu odwzorowania wstecznego z filtrem, co implikuje filtr Sheppa-Logana z macierzą 1 024 wokseli sześciennych.
Importuj dane dicom do oprogramowania Miro za pomocą funkcji import. Wizualizuj drzewo naczyń za pomocą funkcji vol-run. Wybierz próg wizualizacji, aby duże tętnice mózgowe były przedstawione w ostrych konturach.
Ważne jest, aby używać tego samego progu wizualizacji dla wszystkich zestawów danych należących do serii eksperymentalnej. Wirtualnie rozwarstwić podstawowe tętnice mózgowe Koła Willisa, z objętością funkcji dodaną przez otoczenie naczyń kurą. Następnie wirtualnie przeanalizuj segment naczynia, który ma być analizowany.
Dlatego obróć trójwymiarowy model drzewa naczyniowego, aby precyzyjnie oddzielić wszystkie małe gałęzie od głównej tętnicy. Dla celów dalszej analizy konieczne jest usunięcie wszystkich statków z wyjątkiem segmentu statku, który ma być poddany analizie. Zastosuj funkcję auto skeleton z progiem ustawionym na próg wizualizacji, która generuje centralny wykres przestrzenny oparty na linii.
Następnie zastosuj funkcyjny wykres przestrzenny do zestawu linii, aby utworzyć zestaw linii. Podziel zestaw linii na pojedyncze podsegmenty, ręcznie wybierając pojedyncze podsegmenty za pomocą kursora i klikając przycisk podziel. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla obliczenia objętości poszczególnych podsegmentów.
Użyj wiersza funkcyjnego ustawionego na wykres przestrzenny, aby ponownie utworzyć wykres przestrzenny. Statystyka wykresu przestrzennego funkcji służy do określania długości, objętości i średnicy każdego podsegmentu. Do wizualizacji oznaczonej kolorami, przedstawiającej przebieg średnicy naczynia, należy skorzystać z funkcji wykresu przestrzennego.
Ustaw kolorowanie segmentów na grubość, która jest skorelowana ze średnicą naczynia. Ważne jest, aby wybrać tę samą mapę kolorów dla wszystkich zestawów danych należących do serii eksperymentalnej. Dodaj długości podsegmentów, aby określić, które podsegmenty mają zostać uwzględnione w dalszej analizie.
W niniejszym badaniu oceniliśmy odcinek naczynia składający się z jednego milimetra tętnicy szyjnej wewnętrznej, proksymalnego tętnicy szyjnej t i dwóch punktów pięciu milimetrów tętnicy mózgowej dystalnej tętnicy szyjnej t. Następnie dodaj objętości, aby określić objętość naczynia w zdefiniowanym segmencie naczynia. Aby ocenić dokładność wirtualnej rekonstrukcji drzewa naczyniowego, przeprowadziliśmy porównanie średnic naczyń wyznaczonych na podstawie średnic naczyń wyznaczonych mikroskopowo i na podstawie wirtualnych rekonstrukcji 3D w dwóch anatomicznie zdefiniowanych punktach w dziesięciu próbkach mózgu.
Do mikroskopowego wyznaczania średnic naczyń za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości, narzędzia do kalibracji oprogramowania, stosowanych skal mikrometrycznych, nie stwierdzono istotnych różnic między średnicami wyznaczonymi mikroskopowo i wirtualnie. Wskazuje na dokładną wirtualną rekonstrukcję anatomii naczyń wewnątrzczaszkowych. Aby określić ilościowo podstawowy skurcz mózgu, określiliśmy objętość predefiniowanego reprezentatywnego trzypunktowego pięciomilimetrowego segmentu naczynia, składającego się z jednego milimetra IC8 i dwóch punktów pięciomilimetrowych MCA po lewej stronie.
W próbkach mózgu od SAH i zwierząt pozorowanych. Objętość naczynia była znacznie mniejsza w SAH w porównaniu z pozorowanym, co wskazuje na skurcz naczyń mózgowych. Średnice naczyń były również znacznie niższe w SAH w porównaniu z pozorowanym.
Wirtualna rekonstrukcja uzyskana za pomocą przedstawionej tutaj metody dokładnie odzwierciedla anatomię naczyń krwionośnych. Można badać całe segmenty naczyń, przypuszczalnie przedstawiając bardziej obiektywny parametr do ilościowego określenia skurczu naczyń niż określenie średnic naczyń w jednym punkcie. Ocena wolumetryczna prowadzi do większych różnic między naczyniami naczyniospastycznymi i nienaczynioskurczowymi w porównaniu z oceną samych średnic naczyń.
Overview
To badanie przedstawia metodę 3D rekonstrukcji drzewa krążenia mózgowego u myszy z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej w celu ilościowego określenia wazospasmu mózgowego po krwotoku podpajęczynówkowym. Technika łączy perfuzję przez serce, endowaskularne odlewanie i zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu zmierzenia objętości naczyń.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Badania nad układem krążenia mózgowego
- Techniki obrazowania
Tło
- Wazospasm mózgowy jest krytycznym powikłaniem po krwotoku podpajęczynówkowym.
- Rozumienie reakcji naczyniowych jest niezbędne do opracowania strategii terapeutycznych.
- Rekonstrukcja 3D może zapewnić wgląd w zmiany naczyniowe i ilościowo określić nasilenie wazospasmu.
- Obecne metody mogą brakować precyzji w pomiarach zmian naczyń po urazie.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej techniki ilościowego określania wazospasmu mózgowego u myszy.
- Poprawa rozumienia zmian w układzie krążenia mózgowego po krwotoku podpajęczynówkowym.
- Ułatwienie obiektywnej oceny morfologii i funkcji naczyń.
Zastosowanie metod
- Badanie wykorzystało mikrotomografię komputerową do obrazowania układu krążenia mózgowego.
- Myszy były poddane endowaskularnemu odlewaniom po wywołanym krwotoku podpajęczynówkowym.
- Kluczowe kroki obejmowały perfuzję przez serce z roztworami fizjologicznymi i radioopacującymi środkami do odlewu.
- Obrazy i dane były przetwarzane za pomocą oprogramowania Miro w celu wizualizacji i analizy struktur naczyń.
- Dokładne pomiary średnic naczyń były porównywane między mikroskopową a wirtualną rekonstrukcją.
Główne wyniki
- Metoda pozwoliła na precyzyjną 3D rekonstrukcję śródczaszkowego drzewa naczyniowego.
- Nie stwierdzono istotnej różnicy w pomiarach średnic naczyń między metodami mikroskopową a wirtualną, co wskazuje na wysoką dokładność.
- Analiza segmentów naczyń dostarczyła obiektywnych wskaźników do oceny nasilenia wazospasmu.
- Badanie podkreśliło znaczenie standaryzowanych progów obrazowania dla spójności między zbiorami danych.
Wnioski
- To badanie prezentuje nową, dokładną metodę oceny wazospasmu mózgowego w modelach mysich.
- Poprawia możliwości ilościowego określania zmian naczyniowych po urazie krwotocznym.
- Wyniki mają znaczące implikacje dla zrozumienia dynamiki układu krążenia mózgowego i opracowywania nowych podejść terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vasospasm in preclinical models remains a critical challenge in stroke drug development, where objective vascular metrics are needed to de-risk mechanistic hypotheses and support go/no-go decisions. This volumetric method provides a reproducible, imaging-based readout that enhances predictive confidence in target validation by moving beyond single-point diameter measurements to integrated vessel segment analysis. Its application in murine SAH models enables standardized assessment of vascular pathology, supporting translational continuity from discovery through preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing objective volumetric metrics of cerebral vasospasm as a pathophysiological endpoint.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate 3D reconstruction of the cerebrovascular tree, reducing reliance on indirect or single-point measurements.
- Predictive Value: Enhances target confidence by quantifying vascular changes across entire vessel segments, improving correlation with functional outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative vessel volume outputs that enable reliable comparison between experimental conditions in vasospasm models.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow combining transcardiac perfusion, endovascular casting, and micro-CT imaging for consistent vascular phenotyping.
- Scalability: Facilitates platform reuse across studies by maintaining fixed visualization thresholds and segmentation protocols for longitudinal or comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase vascular quantification to preclinical validation by providing a disease-relevant system that mirrors clinical vasospasm pathology.
- Mechanistic De-risking: Enables objective assessment of vasospasm severity, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Predictive Confidence: Volumetric evaluation demonstrates greater sensitivity to vasospastic changes than diameter-only metrics, improving the predictive value of preclinical findings.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and vascular phenotype validation in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying vasospasm as a measurable biological response to subarachnoid hemorrhage.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative vascular outputs with high reproducibility, enabling reliable compound or genotype comparisons.
- Analytics: Provides volumetric, length, and diameter measurements from spatial graph statistics, offering multidimensional readouts for condition comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by delivering disease-relevant vascular metrics that can inform biomarker-aligned efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized vascular quantification platform applicable across multiple cerebrovascular injury models beyond SAH.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through objective, volumetric quantification of cerebral vasospasm.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fixed imaging thresholds, perfusion protocols, and semi-automated 3D reconstruction workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in vasospasm modeling, lowering late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on robust preclinical vascular phenotype data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, perfusion techniques, and micro-CT operation for successful vascular casting and imaging.
- Depends on access to microcomputed tomography systems and 3D visualization software (e.g., Miro) for image acquisition and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of visualization thresholds and segmentation protocols to ensure consistency across experimental groups.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different vessel segments or model systems, validated through diameter-based accuracy checks.
- Limited by the ex vivo nature of the assay, which captures endpoint vascular morphology but not real-time dynamic vasospasm progression.
