Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzenia i regeneracji nerwów obwodowych, takie jak: jaka jest morfometria nerwu obwodowego, ile jest obecnych aksonów, jaki jest stan mielinizacji i czy obecna jest tkanka zwłóknieniowa? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wizualizację cech nerwu w wysokiej rozdzielczości. Zacznij od umieszczenia znieczulonego szczura w pozycji leżącej na maty sekcyjnej.

Umieść stożek nosowy, aby utrzymać znieczulenie za pomocą 1-2% izofluranu. Aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, przetestuj zwierzęta pod kątem wycofania pedału i odruchów powiekowych tylnych łap. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy zgolić włosy na kończynach tylnych i wysterylizować ogolone obszary 70% etanolem.

Zbadaj palpacyjnie kość udową, aby określić właściwe miejsce nacięcia. Kość udowa znajduje się tuż obok najbardziej dostępnego segmentu nerwu kulszowego. Po wykonaniu dwu- lub trzycentymetrowego nacięcia w skórze wzdłuż kończyny tylnej od kolana do krętarza większego, zlokalizuj płaszczyznę między mięśniem dwugłowym uda a mięśniem pośladkowym maksymalnym

Następnie użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby oddzielić leżącą pod spodem powięź i odsłonić od dwóch do trzech centymetrów leżącego poniżej nerwu kulszowego. Użyj retraktora, aby poszerzyć odstęp między dwoma mięśniami. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek do tęczówki ostrożnie oddziel nerw od otaczającej tkanki łącznej, bardzo uważając, aby nie uciskać ani nie przecinać nerwu.

Następnie przykryj odsłonięty nerw utrwalaczem Trumpa i pozostaw na 10 minut. W razie potrzeby umieść gazę pod tylną nogą, aby poprawić kąt, aby można było dodać więcej utrwalacza do ubytku. Usuń utrwalacz po 10 minutach i powtórz ten krok jeszcze dwa razy.

Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć nerw kulszowy z obu stron za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych, uważając, aby nie rozciągnąć ani nie uszczypnąć nerwu. Natychmiast umieść skrawki nerwowe w 15 ml probówkach zawierających utrwalacz Trumpa i utrwalaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień, zmieniając utrwalacz co 48 godzin. Po utrwaleniu ostrożnie usuń pozostały tłuszcz i tkankę łączną z nerwu i użyj ostrego skalpela, aby przeciąć nerw na segmenty o długości około pięciu milimetrów.

Segmenty nerwowe można rozdzielić na różne oznakowane rurki. Zanurz segmenty nerwowe w świeżo przygotowanym 2% tetratlenku osmu na dwie godziny. Za pomocą zestawu do zatapiania żywicy epoksydowej przygotuj ostateczną mieszankę do zatapiania.

Wymieszaj podłoże do zatapiania epoksydu z roztworem DDSA i wymieszaj podłoże do osadzania epoksydowego z roztworem NMA. Mieszaj oba roztwory przez co najmniej 20 minut za pomocą mieszadła magnetycznego. Bezpośrednio przed użyciem połączyć akcelerator DPM z roztworem B, a następnie połączyć go z roztworem A w taki sposób, aby końcowa proporcja akceleratora wynosiła od jednego punktu pięć do 2% całkowitej objętości.

Przenieś segmenty nerwowe do jednego punktu pięciomililitrowych probówek i po umyciu PBS rozpocznij proces odwadniania, zastępując PBS rosnącym stężeniem acetonu i wody destylowanej przez 10 minut, a następnie w 100% acetonie trzy razy po 10 minut każdy. Jednym z krytycznych etapów jest odwodnienie tkanek. Woda i żywica nie będą wchodzić w interakcje, więc woda pozostała w tkance nie zostanie przeniknięta przez żywicę, pozostawiając w przekroju pozbawionym właściwości histologicznych.

W celu infiltracji żywicą najpierw umieść segmenty nerwowe w mieszaninie jeden do jednego mieszaniny osadzającej i 100% acetonu na 30 minut. Po 30 minutach przenieś segmenty do mieszanki dwa do jednego mieszanki do zatapiania i 100% acetonu na 30 minut. Umieść węzły nerwowe w foremkach do zatapiania gumy silikonowej i delikatnie dodaj żywicę na nerwy, upewniając się, że pokryłeś cały segment nerwowy, unikając pęcherzyków powietrza.

Pozostaw żywicę do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza na noc. Umieść blok żywicy z osadzonym nerwem w uchwycie ultramikrotomu trapezową stroną skierowaną do góry. Podczas oglądania przez ultramikrotomowy obiektyw użyj jednosiecznego ostrza, aby przyciąć nadmiar żywicy otaczającej tkankę nerwową.

Nie należy penetrować podłużnej powierzchni odcinka nerwowego, który można rozpoznać po ciemnym zabarwieniu tetratlenkiem osmu. Za pomocą zwykłego szklanego noża na ultramikrotomie wykonaj wiele przekrojów, aby odsłonić jednolitą powierzchnię przekroju nerwu. Gdy to zrobisz, przełącz się na nóż do szkła z łodzią wypełnioną wodą destylowaną o temperaturze pokojowej i dostosuj ultramikrotom do jednego do dwóch mikronów, aby ciąć cienkie sekcje.

Użyj metalowej pętli, aby przenieść pływające cienkie sekcje ze szklanej łodzi z nożem do kropli dejonizowanej wody na szklanym szkiełku. Kolejnym krytycznym krokiem jest przeniesienie cienkiego przekroju z noża szklanego na szkiełko. Te cienkie sekcje są bardzo delikatne i mogą się łamać lub składać.

Po pokrojeniu na sekcje wysusz sekcje na szkiełkach, kilkakrotnie przesuwając szkiełko nad płomieniem, uważając, aby nie przegrzać sekcji. Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni, jeśli nie zostaną natychmiast zabarwione błękitem toluidynowym. Aby zabarwić odcinki nerwowe, użyj plastikowej pipety lub mikropipetera, aby dodać kroplę roztworu błękitu toluidynowego na wierzch odcinków nerwowych.

Po 20 do 30 sekundach spłucz cały nadmiar roztworu błękitu toluidynowego, delikatnie zanurzając szkiełka w słoiku z wodą dejonizowaną, powtarzając trzy do czterech razy, aż skrawki będą czyste. Suszyć szkiełka przez co najmniej 15 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu dodaj zwykłą pożywkę montażową i przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym.

Na koniec zbadaj zamontowane sekcje pod mikroskopem świetlnym. Soczewka zanurzeniowa z olejkiem 100X jest zalecana do szczegółowych obrazów w celu obliczenia współczynników g. Wycinki nerwu kulszowego zatopione w podłożu żywicznym i zabarwione błękitem toluidynowym pokazywały wyraźne obrazy o optymalnej rozdzielczości przy rosnącym powiększeniu od 10X do 20X, 40X i 60X.

Metoda ta zachowuje strukturę nerwu i pozwala na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu, co ułatwia pomiar kilku parametrów, takich jak współczynnik g, czyli stosunek średnicy aksonu, wskazywany przez strzałkę oznaczoną B, do całkowitej średnicy włókna, oznaczonej jako A. Różne czynniki mogą prowadzić do mniej niż optymalnych odcinków nerwów obwodowych, w tym obecność pęknięć w przekroju z powodu niewłaściwego obchodzenia się z nerwem. W sekcji mogą również wystąpić z powodu niewystarczającego odwodnienia. Innym możliwym błędem w procedurze jest składanie skrawków, któremu można zaradzić za pomocą pętli zaszczepiających do przenoszenia sekcji na szkiełko

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak kwantyfikacja aksonów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jaki jest stopień regeneracji nerwu regeneracyjnego? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać od jednego do dwóch mikronowych odcinków nerwów obwodowych w celu oceny morfometrii nerwów.