Name: Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Naucz się barwienia błękitem toluidynowym cienkich skrawków nerwów obwodowych zatopionych w żywicy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę morfologii, liczenia aksonów i oceny stopnia mielinizacji w badaniach nad regeneracją nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jenkins Microscopy Facility na Uniwersytecie Wyoming za pomoc, a członkom laboratorium Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang i Subash Dhunghana, za pomoc w opiece nad zwierzętami. Publikacja ta była możliwa dzięki Nagrodzie Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) przyznanej przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach grantu # 2P20GM103432.

Dorosłe szczury Sprague Dawley zostały wykorzystane w tym projekcie, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wyoming.
1. Chirurgia i unieruchomienie nerwów in vivo
UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
UWAGA: Utrwalanie nerwów in vivo służy do zachowania tkanki i zmniejszenia degradacji strukturalnej, która może wystąpić między śmiercią a pobraniem nerwów. Utrwalanie tkanek in vivo jest standardową praktyką przygotowania tkanki układu nerwowego do histologii, gdzie perfuzja jest często prekursorem tego. Umiejscowienie i wielkość nerwów obwodowych pozwalały na utrwalenie in situ. Nie zalecamy pobierania i utrwalania tkanek po eutanazji ze względu na możliwość degradacji tkanek.
<ol>
	<li>Przygotuj szczura do znieczulenia ogólnego, umieszczając go w komorze indukcyjnej z 2-3% izofluranem, a następnie umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej na maty preparacyjnej i utrzymuj poziom 1-2% izofluranu za pomocą znieczulającego stożka nosowego. Aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, badaj zwierzęta pod kątem wycofania pedału na tylnych łapach i sprawdź, czy nie ma odruchów powiekowych w oczach, dotykając przyśrodkowej kości oko. 
	UWAGA: Dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy jest powszechnie stosowaną alternatywą dla wziewnego izofluranu.</li>
	<li>Aby odsłonić nerw kulszowy, ogol włosy tylnych kończyn i oczyść ogolone obszary 70% etanolem. Za pomocą skalpela lub nożyczek wykonaj 2-3 cm nacięcie w skórze wzdłuż kończyny tylnej od kolana do krętarza większego, gdzie badanie palpacyjne kości udowej za pomocą sterylnego skalpela zapewnia prawidłowe miejsce nacięcia. Kość udowa znajduje się tuż obok najbardziej dostępnego odcinka nerwu kulszowego. Mimo że jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie, należy zachować sterylne techniki.</li>
	<li>Po wykonaniu nacięcia skóry zlokalizuj płaszczyznę między mięśniem dwugłowym uda a mięśniem pośladkowym wielkim i za pomocą nożyczek do mikrodysekcji oddziel leżącą pod spodem powięź i odsłoń 2-3 cm podskórnego nerwu kulszowego. Aby odsłonić wyraźny odcinek nerwu kulszowego, użyj retraktora, aby poszerzyć odstęp między dwoma mięśniami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek do tęczówki ostrożnie oddziel nerw od otaczającej tkanki łącznej, uważając, aby nie uciskać ani nie przecinać nerwu.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość utrwalacza Trumpa (4% formaldehydu, 1% aldehydu glutarowego w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) z 1,16 g NaH2PO4·H2O na 100 ml) do jamy zawierającej odsłonięty nerw, aby przykryć nerw i odstawić na 10 minut. W razie potrzeby umieść gazę pod tylną nogą, aby poprawić kąt, aby można było dodać więcej utrwalacza do ubytku. Usuń utrwalacz po 10 minutach i powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przeciąć nerw z obu stron za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych, uważając, aby nie rozciągnąć ani nie uszczypnąć nerwu kulszowego, a następnie natychmiast umieścić skrawki nerwowe w 15 ml probówkach zawierających utrwalacz Trumpa w temperaturze 4 °C na tydzień, zmieniając utrwalacz co 48 godzin.</li>
	<li>Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki podczas żadnej części zabiegu chirurgicznego. Po usunięciu nerwu poddaj zwierzęta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu.</li>
</ol>
2. Leczenie tetratlenkiem osmu i zatapianie żywicy
<ol>
	<li>Po utrwaleniu ostrożnie usuń pozostały tłuszcz i tkankę łączną z nerwu i użyj ostrego skalpela, aby przeciąć nerw na segmenty o długości około 5 mm (segmenty nerwowe można oddzielić i oznaczyć w różnych rurkach). Przygotuj świeży 2% tetratlenek osmu rozcieńczony w roztworze utrwalającym Trumpa i trzymaj w szklanej probówce. Zanurz segmenty nerwowe w 2% tetratlenku osmu na 2 godziny, który może znajdować się w plastikowych rurkach przez ten krótki okres czasu. 
	UWAGA: Niektóre plastikowe rurki reagują z tetratlenkiem osmu, powodując ciemnienie roztworu, dlatego nie zaleca się długotrwałego przechowywania tetratlenku osmu w plastikowych probówkach.</li>
	<li>Za pomocą zestawu do osadzania epoksydowego przygotuj ostateczną formułę zatapiania:
	<ol>
		<li>Zmieszać pożywkę do zatapiania epoksydowej z roztworem DDSA (bezwodnik dodecenylobursztynowy; mieszanina A) i wymieszać pożywkę do zatapiania epoksydowej z roztworem NMA (bezwodnik metylonodyczny; mieszanina B). Pozwól obu mieszaninom A i B mieszać się przez co najmniej 20 minut, mieszając mieszadłem magnetycznym.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem wymieszać mieszaninę A i B i dodać akcelerator DPM-30 (2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol) w proporcji 1,5 do 2,0% całkowitej objętości mieszaniny. Należy pamiętać, że roztwór DPM-30 powinien być dokładnie odmierzony, aby zapobiec ciemnieniu i kruchości bloku. Wszystkie chemikalia żywiczne są toksyczne; Zachowaj szczególną ostrożność, aby zapobiec kontaktowi ze skórą lub wdychaniu się.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając probówek o pojemności 1,5 ml, umyj segmenty nerwowe PBS i rozpocznij proces odwadniania, umieszczając segmenty nerwowe w różnych kanałach acetonu/wody destylowanej: 30%, 60%, 90% stężeń przez 10 minut każdy, a następnie w 100% acetonie 3 razy po 10 minut. Należy pamiętać, że etanol może być użyty zamiast acetonu.</li>
	<li>W celu infiltracji żywicy umieść segmenty nerwowe w mieszaninie 1 części końcowej mieszaniny do zatapiania i 1 części 100% acetonu na 30 minut, następnie w mieszaninie 2 części końcowej mieszaniny do zatapiania i 1 części 100% acetonu na 30 minut, a na koniec umieść segmenty nerwowe w końcowej mieszaninie do zatapiania na 30 minut.</li>
	<li>Segmenty nerwowe wkładamy do foremek do zatapiania z gumy silikonowej (użyliśmy 106 mm długości x 71 mm szerokości x 7 mm głębokości; rozmiar bloku 11 mm długości x 6 mm szerokości x 3 mm głębokości). Delikatnie dodaj żywicę na wierzchu nerwów, upewniając się, że zakrywasz całe segmenty nerwowe i unikasz tworzenia pęcherzyków powietrza. Pozostaw formę zawierającą segmenty nerwowe z żywicą do polimeryzacji w temperaturze 60 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Cięcie za pomocą ultramikrotomu
<ol>
	<li>Przygotuj szklane noże za pomocą maszynki do produkcji noży do szkła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i zrób szklane noże za pomocą łódek(<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), które służą do zbierania odcinków nerwowych unoszących się na wodzie destylowanej.</li>
	<li>Umieść osadzone w żywicy bloki nerwowe w uchwycie ultramikrotomu trapezową stroną skierowaną do góry. Za pomocą ultramikrotomu przyciąć nadmiar żywicy otaczającej tkankę nerwową i sprawić, by blok był skierowany w stronę trapezu i jak najbliżej podłużnej powierzchni nerwu za pomocą jednosiecznego ostrza, takiego jak żyletka. Nie należy penetrować podłużnej powierzchni segmentu nerwowego, który można rozpoznać po ciemnym zabarwieniu tetratlenkiem osmu. 
	UWAGA: Przycinanie nadmiaru żywicy zmniejszy obszar żywicy do podziału na sekcje oraz poprawi wydajność ostrza i cięcia w kolejnych krokach.</li>
	<li>Za pomocą ultramikrotomu wykonaj wiele przekrojów wystarczających do odsłonięcia jednolitej powierzchni przekroju poprzecznego tkanki nerwowej za pomocą zwykłego szklanego noża. Gdy to zrobisz, przełącz się na nóż do szkła, którego łódka jest wypełniona wodą destylowaną o temperaturze pokojowej i dostosuj ultramikrotom do 1-2 μm, aby ciąć cienkie odcinki.</li>
	<li>Przenieś pływające cienkie sekcje ze szklanej łodzi z nożem do kropli dejonizowanej wody na szkiełku za pomocą metalowej pętli (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Wysuszyć szkiełka zawierające sekcje, przesuwając kilka razy przez płomień przez kilka sekund, uważając, aby nie przegrzać sekcji. Wysuszone odcinki należy natychmiast zabarwić błękitem toluidynowym lub przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni przed barwieniem. 
	UWAGA: Sekcje można również suszyć za pomocą podgrzewacza do płyt w temperaturze 60 °C przez 15 min. Powolny proces suszenia sprawia, że sekcje są gładkie.</li>
</ol>
4. Niebieskie barwienie toluidyny
<ol>
	<li>Przygotuj 1% roztwór błękitu toluidynowego, rozpuszczając 2 g boranu sodu w 100 ml wody dejonizowanej, następnie dodaj 1 g błękitu toluidynowego i mieszaj aż do rozpuszczenia. Przefiltrować roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej (wielkość porów: 11 μm) i przechowywać roztwór w nieprzezroczystej butelce w temperaturze pokojowej przez okres do dwóch tygodni.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety lub mikropipety dodaj kroplę roztworu błękitu toluidynowego na wierzch odcinków nerwowych i pozostaw na 20-30 sekund.</li>
	<li>Spłucz nadmiar roztworu błękitu toluidynowego, delikatnie zanurzając szkiełka w słoiku z wodą dejonizowaną i powtórz 3-4 razy, aż skrawki będą czyste. Szkiełka należy suszyć przez co najmniej 15 minut w temperaturze 60 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przykryć sekcje szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu zwykłego środka montażowego. Natychmiast sprawdź zamontowane szkiełka lub przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbadaj pod mikroskopem świetlnym. Soczewka immersyjna z olejkiem 100X jest zalecana do szczegółowych obrazów używanych do obliczania współczynników g.</li>
</ol>

<ol><li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development%3A+What+small+animal+models+can+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li>
<li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury%3A+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li>
<li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li>
<li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5%3A+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobioly%22%5BJournal%5D)">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li>
<li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue+and+Lugol%27s+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li>
<li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22A+manual+of+applied+techniques+for+biological+electron+microscopy%22">A manual of applied techniques for biological electron microscopy</a>. , Plenum. New York. 257(1993).</li>
<li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li>
<li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/joces/s3-105/69/99.full.pdf">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li>
<li>Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+Part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li>
<li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+nerve+biopsies%3A+A+practical+guide+for+neuropathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li>
<li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li>
<li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2004.27.3.161">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li>
<li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2007.30.1.27">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+stains%3A+A+literature+review+and+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Health+Science%22%5BJournal%5D)">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li>
<li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+and+nonporous+nerve+conduits%3A+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li>
<li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Badania struktur morfologicznych uszkodzenia i regeneracji nerwów obwodowych są częstymi przedmiotami badań13. W tym protokole opisujemy kroki w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów do kwantyfikacji danych histologicznych przy użyciu tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura osadzonej w blokach żywicy i wybarwionej błękitem toluidynowym. Technika ta zapewnia obraz morfologii nerwów, w którym regenerację nerwów można określić ilościowo, mierząc liczbę aksonów, stopień mielinizacji, obecność naciekaj...

Nerwy obwodowe rozciągają się po całym ciele, unerwiając docelowe tkanki za pomocą aksonów motorycznych lub czuciowych1. Wady nerwów obwodowych spowodowane zaburzeniami medycznymi i urazami stanowią poważny problem zdrowia publicznego i mają duże skutki ekonomiczne2,3. Pomimo postępów w ocenie wyników uszkodzeń nerwów obwodowych i zrozumieniu regeneracji nerwów, tradycyjne metody, takie jak histologia nerwów i techniki barwienia, są niezbędnymi narzędziami do jakościowej i ilościowej oceny zdrowia nerwów jako końcowego pomiaru wyniku w modelach zwierzęcych lub wyciętej tkance ludzkiej. Jest to często łączone z elektrofizjologicznymi pomiarami funkcji nerwów obwodowych, gdzie morfometria może ujawnić, dlaczego funkcjonalna regeneracja nerwów nastąpiła lub nie.
Barwienie niebieskim toluidyną półcienkich odcinków nerwów obwodowych zatopionych w żywicy to specjalistyczna metoda obrazowania mielinowych włókien nerwowych, zapewniająca wysokiej jakości i wyraźne szczegółowe obrazy struktur nerwowych4,5,6. Błękit toluidynowy jest kwasofilnym barwnikiem metachromatycznym, odkrytym przez Williama Henry'ego Perkina w 1856 roku7 i był używany w kilku zastosowaniach medycznych8. Zabarwione na niebiesko toluidyną odcinki nerwów obwodowych uzyskane z segmentów nerwowych zatopionych w żywicy pozwalają na wyraźną wizualizację struktur nerwowych. Wizualizacja struktury osłonki mielinowej może być wzbogacona przez zastosowanie tetratlenku osmu po utrwaleniu4,9. Tetroxide osmu jest toksycznym utleniaczem i utrwalaczem lipidów, który oddziałuje z podwójnymi wiązaniami w lipidach, co skutkuje wyraźnie zdefiniowanymi, bogatymi w lipidy osłonkami mielinowymi10. Jednak tetratlenek osmu jest toksyczny, drogi, wymaga dłuższej inkubacji segmentów nerwowych i nie zawsze jest stosowany.
Alternatywne metody przetwarzania i barwienia zostały opracowane do wizualizacji morfologii nerwów obwodowych; Parafina, sekcja kriogeniczna i cięcie nerwów zatopione w żywicy epoksydowej, a następnie barwienie błękitem toluidynowym lub roztworem fenylenodiaminy zostały wykorzystane do ilościowego określenia zmian morfologicznych regeneracji nerwów obwodowych 11,12. Każda z tych metod ma swoje zalety i dostarcza istotnych danych na temat liczby aksonów, grubości mieliny, średnicy aksonu i średnicy aksonu do średnicy włókna mielinizowanego (współczynnik g) 11,13,14,15.
Podstawową cechą zatapiania żywicy w tym protokole jest to, że ułatwia uzyskanie przekrojów o grubości 1-2 μm ze względu na twardość żywicy, przy jednoczesnym zachowaniu właściwości histologicznych nerwu. Te cienkie sekcje, w przeciwieństwie do odcinków o grubości 4-5 μm uzyskanych z zatapiania parafiny, zapewniają obwodowym skrawkom nerwów wyższą rozdzielczość, co pozwala na dokładniejsze określenie ilościowe mielinizacji aksonów, takie jak współczynnik g, którego nie można uzyskać z grubszych odcinków16. Podczas gdy cięcie kriogeniczne może być stosowane do uzyskiwania przekrojów 1-2 μm, z naszego doświadczenia wynika, że trudniej jest uzyskać przekroje bez licznych dużych pęknięć. Takie pęknięte odcinki mogą powodować niedokładne liczenie liczby aksonów i aspektów mielinizacji.
Oprócz barwienia niebieskim toluidyną17, metoda barwienia srebrem18 i trichromowe barwienie Massona4 mogą być również używane do pokazywania aksonów nerwowych. Jednak przy użyciu zatapiania żywicą środkowych odcinków nerwu szczura wybarwionych hematoksyliną i eozyną lub trichromem Massona wykazało słabe osłonki mielinowe i nierozpoznane struktury, podczas gdy barwienie błękitem toluidyny wykazało wyraźny obraz osłonki mielinowej i można je łatwo określić ilościowo4. Pomimo pewnych ograniczeń, barwienie nerwów obwodowych osadzonych w żywicy błękitem toluidynowym jest cenną techniką, która może być stosowana, gdy wymagane są obrazy morfologii nerwów o wysokiej rozdzielczości.
Główną wadą zatapiania żywicy jest to, że jest czasochłonne i nie pozwala na immunologiczne barwienie tej samej tkanki ze względu na trudność w odzyskaniu antygenu w porównaniu z technikami zaparzania parafiny i zamrożonych skrawków. W związku z tym generalnie nie jest możliwe wykorzystanie tej samej tkanki do barwienia immunologicznego, która jest przetwarzana poprzez zatapianie żywicy w celu barwienia błękitem toluidyny. Chociaż nie jest to tutaj stosowane, jeśli immunohistochemia jest pożądana w sekcjach osadzonych w żywicy, zastosowanie żywic zatapiających metakrylan glikolu pozwala na przeprowadzenie immunohistochemii na skrawkach tkanek, ale jest stosunkowo drogie19. Można to nieco złagodzić, przecinając nerw obwodowy na oddzielne segmenty, niektóre do zatapiania żywicy, a inne do barwienia immunologicznego bezpośrednio po utrwaleniu.
Proces barwienia nerwów obwodowych zanurzonych w żywicy na niebiesko toluidyny, podobnie jak w przypadku większości analiz histopatologicznych, można podzielić na pięć etapów, w tym utrwalanie, odwadnianie, osadzanie, cięcie i barwienie20. Naszym celem jest przedstawienie protokołu i praktycznych wskazówek dotyczących używania osadzonych w żywicy odcinków nerwu kulszowego szczura barwionych błękitem toluidynowym w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów.

<table><tbody><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat fosforanu sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do zatapiania żywicy epoksydowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Aby dostosować utrwalacz pH Trumpa</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tetratlenku osmu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprowadnice VWR, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do noży do szkła</td><td>Produkty RMC</td> Ultramikrotom <td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produkty RMC</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 ml mikrowirówki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 ml Szklana fiolka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td>Do przycinania bloku żywicy</td></tr><tr><td>Doskonała pętla</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70944</td><td>Do zbierania cienkich odcinków żywicy</td></tr><tr><td>Paski noża Ultra Glass 6,4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Piec</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 ml plastikowa pipeta</td><td>Zestaw mikrochirurgiczny Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Światowe instrumenty</td><td></td><td></td>precyzyjne</tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> fluorescencyjny Olympus <td>Podwójna kolorowa i monochromatyczna kamera CCD, DP80</td></tr></tbody></table>

barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Nerwy obwodowe rozciągają się po całym ciele, unerwiając docelowe tkanki za pomocą aksonów motorycznych lub czuciowych. Ze względu na powszechną dystrybucję, nerwy obwodowe są często uszkodzone z powodu urazu lub choroby. Ponieważ opracowano metody i strategie oceny uszkodzenia nerwów obwodowych w modelach zwierzęcych, funkcji i regeneracji, analiza morfometrii nerwu obwodowego stała się niezbędnym pomiarem końcowego wyniku. Barwienie niebieskim toluidynowym przekrojów czynnych nerwów uzyskane z odcinków nerwów zatopionych w żywicy jest powtarzalną metodą jakościowej i ilościowej oceny nerwów obwodowych, umożliwiającą wizualizację morfologii, liczby aksonów i stopnia mielinizacji. Ta technika, podobnie jak w przypadku wielu innych metod histologicznych, może być trudna do nauczenia się i opanowania przy użyciu standardowych pisemnych protokołów. Intencją niniejszej publikacji jest zatem zaakcentowanie pisemnych protokołów barwienia nerwów obwodowych błękitem toluidynowym za pomocą wideografii metody, przy użyciu nerwów kulszowych pobranych od szczurów. W tym protokole opisujemy unieruchomienie nerwów obwodowych in vivo i pobranie tkanki oraz po utrwaleniu 2% tetratlenkiem osmu, osadzenie nerwów w żywicy epoksydowej oraz ultramikrotomowe cięcie nerwów do grubości 1-2 μm. Skrawki nerwów są następnie przenoszone na szkiełko podstawowe i barwione błękitem toluidynowym, po czym są oceniane ilościowo i jakościowo. Przedstawiono przykłady najczęstszych problemów, a także kroki mające na celu ich złagodzenie.

Przekroje nerwów obwodowych zatopione w żywicy i barwione błękitem toluidynowym umożliwiają dokładną kwantyfikację danych histologicznych. Przegląd procedury przedstawiono na (Rysunku 2). Przekroje nerwów kulszowych zatopione w medium żywicznym i barwione błękitem toluidynowym ukazały wyraźne obrazy o optymalnej rozdzielczości (Rysunki 3). Uszkodzenia nerwu mogą powodować liczne zmiany w morfologicznych strukturach nerwowych, na przykład zmia...

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji drobnych struktur nerwów obwodowych poprzez uzyskanie i barwienie odcinków 1-2 μm błękitem toluidynowym

Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzenia i regeneracji nerwów obwodowych, takie jak: jaka jest morfometria nerwu obwodowego, ile jest obecnych aksonów, jaki jest stan mielinizacji i czy obecna jest tkanka zwłóknieniowa? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wizualizację cech nerwu w wysokiej rozdzielczości. Zacznij od umieszczenia znieczulonego szczura w pozycji leżącej na maty sekcyjnej.Umieść stożek nosowy, aby utrzymać znieczulenie za pomocą 1-2% izofluranu. Aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, przetestuj zwierzęta pod kątem wycofania pedału i odruchów powiekowych tylnych łap. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy zgolić włosy na kończynach tylnych i wysterylizować ogolone obszary 70% etanolem.Zbadaj palpacyjnie kość udową, aby określić właściwe miejsce nacięcia. Kość udowa znajduje się tuż obok najbardziej dostępnego segmentu nerwu kulszowego. Po wykonaniu dwu- lub trzycentymetrowego nacięcia w skórze wzdłuż kończyny tylnej od kolana do krętarza większego, zlokalizuj płaszczyznę między mięśniem dwugłowym uda a mięśniem pośladkowym maksymalnym.Następnie użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby oddzieli

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Ten film demonstruje technikę barwienia osadzonych w żywicy, leczonych tetratlenkiem osmu odcinków nerwów obwodowych szczurów za pomocą błękitu toluidynowego. Barwione skrawki nerwów pomagają uwidocznić drobne struktury nerwów obwodowych.

Barwienie niebieskim toluidyny odcinków nerwów obwodowych: technika barwienia mielinowanych włókien nerwowych w celu wizualizacji struktury nerwów obwodowych

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Techniki wizualizacji cytoarchitektury siatkówki bezpośrednio przylegającej do pojedynczych elektrod w stymulatorze siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Choroby demielinizacyjne mogą być modelowane u zwierząt poprzez ogniskowe zastosowanie lizolecytyny do OUN. Pojedyncze wstrzyknięcie lizolecytyny do rdzenia kręgowego myszy powoduje zmianę, która spontanicznie naprawia się w czasie. Celem jest zbadanie czynników zaangażowanych w de- i remielinizację oraz przetestowanie środków usprawniających naprawę.

Eksperymentalna demienizacja i remielinizacja mysiego rdzenia kręgowego przez ogniskowe wstrzyknięcie lizolecytyny

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Naucz się barwienia błękitem toluidynowym cienkich skrawków nerwów obwodowych zatopionych w żywicy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę morfologii, liczenia aksonów i oceny stopnia mielinizacji w badaniach nad regeneracją nerwów.

Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Przeglądaj więcej filmów