Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Ogólnym celem tej procedury jest usprawnienie oceny bezpieczeństwa protez siatkówki. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie powierzchni optymalnie utrwalonego enukleowanego oka barwnikami tkankowymi w celu wskazania położenia implantowanej elektrody. W drugim kroku macierz elektrod zostaje usunięta, a tkanka oka jest rozcinana na paski.

Następnie paski stabilizuje się w agarze, a potem zatapia w parafinie. W ostatnim kroku wyznaczone obszary zainteresowania są cięte i osadzane na szkiełkach przedmiotowych w celu przeprowadzenia barwienia. Ostatecznie stan zdrowia obszarów implantowanych sąsiadujących z każdą elektrodą można ocenić za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym oraz immunofluorescencji.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość zminimalizowania artefaktów związanych z utrwalaniem oraz delaminacji, przy jednoczesnym precyzyjnym śledzeniu obszarów tkanki przylegającej do elektrody w dużych próbkach. Może ona być również wykorzystywana do oceny bezpieczeństwa nowych implantów w innych chorobach oczu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ siatkówka jest podatna na delaminację, a manipulacja próbkami wymaga wysokiego poziomu zręczności.

Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ znakowanie i manipulowanie kruchą tkanką są trudne do opanowania. Przed niniejszym badaniem, po implantacji macierzy elektrod nadchordalnych, oczy były przetwarzane z użyciem nieoptymalnej techniki, co zaznaczono gwiazdką. Ten pierwszy obraz przedstawia reprezentatywny przekrój ortogonalny przez jamę macierzy elektrod.

Należy zauważyć, że siatkówka jest oddzielona od zewnętrznych tkanek oka. Jest to szczególnie widoczne pod obszarem implantacji, co wskazuje grot strzałki. Należy również odnotować, że nie jest możliwe określenie, która część siatkówki przylegała do poszczególnych elektrod macierzy.

Przy tym większym powiększeniu w warstwach siatkówki widocznych jest kilka regularnych artefaktów związanych z uwalnianiem, wskazanych grotami strzałek, a także znaczne oddzielenie od warstwy torpedo, czyli warstwy refleksyjnej w oku kota. Przy dalszym powiększeniu można zauważyć, że zewnętrzne segmenty fotoreceptorów, jak również nabłonek barwnikowy, pozostają jednak nienaruszone, co sugeruje, że wcześniej zaobserwowane oddzielenia są efektami ubocznymi procesu przetwarzania, a nie wynikiem urazu in vivo lub patologii. W związku z tym wdrożono następującą technikę, aby zminimalizować te artefakty związane z utrwalaniem oraz delaminację.

Po nukleacji i utrwaleniu oczu należy wyjąć wszczepioną gałkę oczną z etanolu i ostrożnie odciąć nadmiar tkanki, w tym spojówkę i torebkę ścięgna. Nerw wzrokowy należy przyciąć do długości od 2 do 3 mm. Macierz elektrod jest widoczna przez półprzezroczystą twardówkę.

Następnie za pomocą pędzla z cienkim włosiem ostrożnie nanieś na tkankę barwniki histologiczne, aby oznaczyć elektrody zgodnie z wcześniej ustalonym kodem kolorystycznym, dbając o to, by nie rozmazać barwnika. Można nanieść dodatkowe oznaczenia barwnikiem w celu wyznaczenia punktów zainteresowania lub ułatwienia wyrównania przekrojów.

Tutaj elektrody maksymalnie stymulowane zostały oznaczone kolorem zielonym. Pozostałe aktywne elektrody zostały oznaczone kolorem czerwonym. Elektrody powrotne o większej średnicy zostały zabarwione na żółto, a wszelkie dodatkowe prowadnice lub znaczniki anatomiczne zostały oznaczone niebieskim barwnikiem.

Po pięciu minutach suszenia na powietrzu, umieść gałkę oczną ponownie w 70% etanolu, aby odwodnić barwnik. Następnie, po odcięciu nadmiaru tkanki z nieimplantowanej gałki kontrolnej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, wykorzystaj osiem szwów nylonowych założonych podczas etapu nukleacji i fiksacji, aby ustawić oko kontrolne i oko z implantem w lustrzanym odbiciu. Następnie nałóż silikonowy szablon o wymiarach identycznych jak macierz elektrod w miejscu lustrzanie odpowiadającym położeniu macierzy w oku z implantem w oku kontrolnym.

Następnie oznakuj gałkę oczną kontrolną w sposób przedstawiony powyżej, tak aby każde miejsce implantacji elektrody miało parę kontrolną w anatomicznie porównywalnej lokalizacji. Następnie usuń matrycę implantów z oka, a potem usuń przednią część oka, w tym rogówkę, tęczówkę i soczewkę. Następnie usuń ciało szkliste z pozostałej części gałki ocznej.

Następnie należy przeprowadzić dysekcję wszczepionego oka, dzieląc je na kilka pasków o grubości 2 mm. Każdy z nich powinien zawierać podzbiór obszarów oznaczonych matrycą. Orientację pasków należy dobrać tak, aby ułatwić ocenę różnych aspektów odpowiedzi tkankowej na implant; należy starannie udokumentować położenie oznaczeń matrycy na próbkach do późniejszego wykorzystania.

Następnie umieść pasek stroną, która ma zostać odcięta jako pierwsza, skierowaną w dół w płytkiej warstwie upłynnionego agaru. Po zastygnięciu agaru wytnij próbkę i umieść ją w kasecie tkankowej wspartej piankowymi wkładkami. Po wypreparowaniu i zatopieniu oka kontrolnego, umieść kasety w neutralnie buforowanym forminie i poddaj je nocnemu przetwarzaniu przy użyciu standardowej zautomatyzowanej 12-godzinnej techniki zatapiania w parafinie.

Następnego dnia zatopioną w parafinie przetworzoną tkankę umieść tak, aby strona przeznaczona do pierwszego cięcia była skierowana w dół. Następnie wykonaj od parafiny bloków skrawki o grubości 5 µm. Potem nanieś skrawki z każdego z barwionych obszarów na szkiełka przedmiotowe.

W celu zlokalizowania obszaru DY należy regularnie sprawdzać preparaty pod mikroskopem. Obszary bezpośrednio sąsiadujące z każdą zabarwioną plamką twardówki będą tymi, które znajdowały się w najbliższej odległości od odpowiadującej im elektrody z matrycy. Na koniec należy zabarwić przekroje zgodnie z potrzebami.

Wysoka rozpiętość tonalna (HDR). Przedstawiono makrofotografie enukleowanego oka kota z implantowaną macierzą elektrod nadtwardówkowych in situ po utrwaleniu w utrwalaczu Davidsona i przed usunięciem macierzy. Przezroczysta twardówka umożliwia wizualizację poszczególnych elektrod w macierzy.

Jak wskazano grotem strzałki, elektrody są oznaczone zgodnie z określonym schematem kolorystycznym barwników. Oznaczenia te, naniesione w regularnych odstępach od punktów anatomicznych, służą do zachowania spójności pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Po usunięciu matrycy elektrod oko jest ręcznie sekcjonowane na paski próbek.

Groty strzałek wskazują dwa z miejsc sąsiadujących z elektrodą na twardówce. Linia przerywana oznacza płaszczyznę cięcia w tym reprezentatywnym przekroju uzyskanym z wycinka próbki z poprzedniej ryciny; ogólny kształt paska próbki został zachowany przy minimalnych artefaktach tkankowych wynikających z różnic w utrwaleniu. Oba oznaczenia barwnikiem są nadal widoczne na twardówce, co wskazują groty strzałek.

Choć barwnik zielony okazał się bardziej trwały niż czerwony, lokalizacja barwnika wskazuje położenie elektrody. W związku z tym można ocenić sąsiadującą tkankę siatkówki pod kątem ewentualnych uszkodzeń wywołanych stymulacją elektryczną; jak widać przy tym powiększeniu, warstwy siatkówki sąsiadujące z zielonym barwnikiem widocznym na poprzednim obrazie nie uległy faktycznie odwarstwieniu, a morfologia siatkówki została tutaj zachowana. Na tym pierwszym obrazie przedstawiono reprezentatywne barwienia specjalne oraz immunohistochemię przekrojów tkanki siatkówki przygotowanych zgodnie z niniejszym protokołem.

Hematyna zabarwiła jądra komórkowe na niebiesko, natomiast eozyna zabarwiła cytoplazmę komórek, kolagen i tkankę podporową na różne odcienie różu. Na tym obrazie luxol fast blue zabarwił mielinę na niebiesko. Kontrastowe barwienie fioletem krystalicznym zostało wykorzystane do identyfikacji komórek zwojowych poprzez zabarwienie ciał Nissla na niebiesko oraz uwydatnienie otaczających je komórek satelitarnych. W tym przekroju traktowanym metodą Massona, roztwór kwasu karminowego zabarwił włókna mięśniowe na czerwono, podczas gdy anilinowy błękit zabarwił kolagen.

W tym przypadku twardówka w tym przekroju, barwiona metodą okresowego kwasu i Schiffa (PAS), wykazuje fioletowe zabarwienie komponentów glikoproteinowych błony podstawnej oraz elementów tkanki łącznej, natomiast jądra komórkowe, podbarwione hematoksyliną, są niebieskie. Przedstawiony na obrazie przekrój podtwardówkowy został poddany barwieniu błękitem pruskim Pearla w miejscu krwawienia. Powstanie hemosyderyny z degradacji erytrocytów oraz uwalnianie kompleksów żelaza spowodowało uzyskanie fioletowego koloru.

Dodatek czerwieni neutralnej zabarwił lizosomy na czerwono na tym obrazie, natomiast przeciwciała przeciwko syntetazie glutaminy zostały zabarwione na zielono. Ten enzym degradujący neuroprzekaźniki, występujący w komórkach Müllera, rozciąga się w obu kierunkach – od ciał komórek Müllera w warstwie ziarnistej wewnętrznej do wypustek końcowych komórek Müllera tworzących wewnętrzną błonę ograniczającą. Barwienie białka neurofilamentowego, tego ciężkiego łańcucha białka cytoszkieletowego, wykazano w kolorze zielonym w somie oraz wypustkach komórkowych; białko neurofilamentowe tworzy wiązania krzyżowe z innymi neurofilamentami w celu utrzymania struktury neuronów.

Komórki zwojowe i ich aksony można zaobserwować w warstwie komórek zwojowych oraz warstwie włókien nerwowych, podczas gdy aksony komórek poziomych znajdujących się na zewnętrznej granicy wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kota są widoczne na zielono. Na tym końcowym obrazie przedstawiono kwasowy białko włókienka glejowe – to białko cytoszkieletowe, widoczne na czerwono, proliferuje w komórkach Müllera i astrocytach podczas gliozy i można je zauważyć wzdłuż warstwy włókien nerwowych, przy czym komórki Müllera tworzą cienkie wypustki przechodzące z wewnętrznych do zewnętrznych warstw siatkówki. Przeciwbarwienie DPI na niebiesko umożliwia wizualizację warstw siatkówki.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wizualizować przebieg pracy w trzech wymiarach i regularnie brać pod uwagę orientację próbek na każdym etapie postępowania. Po zakończeniu tej procedury można zastosować wszystkie metody histologiczne w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące bezpieczeństwa po etapie opracowania. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się rozwojem bionicznego oka do oceny długoterminowych, bezpiecznych poziomów stymulacji dla pacjentów niewidomych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać bezpieczeństwo bionicznego implantu oka.