Name: Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Naucz się techniki przetwarzania oczu z protezą siatkówki do lokalnej analizy histopatologicznej. Metoda minimalizuje artefakty utrwalania i umożliwia dokładną ocenę zdrowia tkanek przyległych do elektrod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować: Pani Alexii Saunders i Pani Michelle McPhedran za pomoc eksperymentalną; Pani Helen Feng za wykonanie elektrod; Dr Penny Allen i Dr. Jonathan Yeoh za pomoc chirurgiczną; Personel Centrum Badań Biologicznych Królewskiego Wiktoriańskiego Szpitala Okulistycznego i Usznego zajmujący się opieką nad zwierzętami; Prof. Rob Shepherd za ogólne wskazówki w całym tekście; oraz dr Bryony Nayagam i panu Ronaldowi Leungowi za krytyczne uwagi na temat szkicu manuskryptu.
Ta praca została wykonana w Instytucie Bioniki i Szpitalu św. Wincentego w Melbourne. Finansowanie zostało zapewnione przez Fundację Iana Pottera, John T Reid Charitable Trusts oraz Australijską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Special Research Initiative in Bionic Vision Science and Technology dla Bionic Vision Australia (BVA). Instytut Bioniki docenia wsparcie, jakie otrzymuje od rządu stanu Wiktoria w ramach Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej.

1. Wyłuszczenie i postfiksacja
Ten protokół zakłada, że podmiotowi wszczepiono jednostronnie układ elektrod nadnaczyniówkowych.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory postfix w szklanych butelkach Schott.
	<ol class="lalpha">
		<li>Roztwór utrwalający Davidsona, 2x 100 ml
		<ul>
			<li>2 ml formaliny (37% formaldehydu)</li>
			<li>10 ml lodowatego kwasu octowego (99,7%)</li>
			<li>35 ml etanolu (98%)</li>
			<li>53 ml wody destylowanej</li>
		</ul>
		</li>
		<li>50% etanol, 2x 100 ml</li>
		<li>70% etanol, 2x 100 ml</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja przezsercowa pacjenta z ciepłą (37 °C) heparynizowaną solą fizjologiczną, a następnie zimną (4 °C) neutralną buforowaną formaliną (10%).</li>
	<li>Zawiąż szwy w górnym rąbku (lub miejscu oddalonym od układu nadnaczyniówkowego) obu oczu - w linii z mięśniem prostym, aby służyły jako punkt orientacyjny.</li>
	<li>Wyłuszczenie oczu, zachowując wszelkie zewnętrzne przewody z wszczepionego oka.</li>
	<li>Umieścić każde oko w 100 ml roztworu utrwalającego Davidsona i pozostawić do utrwalenia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 18 - 36 godzinach w utrwalaczu Davidsona przenieś do 50% etanolu (temperatura pokojowa) na 6 - 8 godzin, a następnie na koniec do 70% etanolu (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Próbki przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C i przechowywać do czasu rozbioru próbek.</li>
</ol>
Nienaruszone i ciśnieniowe gałki oczne były przechowywane w ten sposób przez okres do 3 miesięcy bez negatywnego wpływu na wynikową histologię.
2. Identyfikacja i mapowanie tkanek
Powyższy protokół fiksacji (krok 1) sprawił, że twardówka stała się przezroczysta, a matryca jest teraz widoczna - łącznie z poszczególnymi miejscami elektrod (Rysunek 3).
<ol>
	<li>Wyjmij wszczepioną kulę z etanolu i ostrożnie odetnij nadmiar tkanki, w tym spojówkę i torebkę Tenona. Przyciąć nerw wzrokowy do długości 2-3 mm (ryc. 3A).</li>
	<li>Korzystając ze schematu histologicznego znakowania barwnika, oznacz elektrody predefiniowanym kodem kolorystycznym, uważając, aby nie rozmazać barwnika.</li>
</ol>
<ul>
	<li>Wybraliśmy dostępny na rynku zestaw specjalistycznych barwników histologicznych (patrz załącznik). Niewielkie ilości barwnika ostrożnie nanoszono pędzlem z cienką końcówką (rozmiar Roymac 00) na chusteczkę i pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu do 5 minut.</li>
	<li>Dla naszych celów wybraliśmy: zielony dla elektrod czynnych, które były (były) stymulowane maksymalnie, na poziomach ponadprogowych, na czas trwania badania; czerwony dla innych elektrod aktywnych; żółty dla elektrod powrotnych o większej średnicy; i niebieski dla dodatkowych prowadnic i/lub anatomicznych oznaczeń odległości (rysunki 3B i 3C).</li>
	<li>Może być konieczne wykonanie kilku prób i błędów, aby znaleźć barwnik, który jest stabilny na kolejnych etapach. Na przykład na rysunku 4 widać, że zielony barwnik był bardziej sprężysty niż czerwony. Rozcieńczenie barwnika w 70% etanolu pomaga poprawić penetrację lipidów i powlekanie tkanek.</li>
	<li>Przydatne jest naszkicowanie lub sfotografowanie barwionego globu do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ul>
<ol start="3">
	<li>Wróć do 70% etanolu, aby odwodnić barwnik.</li>
	<li>Powtórz krok 2.1 dla niewszczepionej kuli kontrolnej.</li>
	<li>Używając szwów z kroku 1.3, wyrównaj ucho kontrolne i wszczepione oko jako parę lustrzaną.</li>
	<li>Umieść silikonowy szablon (o tych samych wymiarach co układ elektrod) w lustrzanym miejscu na oku kontrolnym, tak jak implant znajduje się na wszczepionym oku (przy czym półprzezroczysta twardówka i oznaczenia barwnika z kroku 2.2 umożliwiają gotową wizualizację pozycji implantowanej matrycy).</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.2 i 2.3 dla oka kontrolnego, tak aby każde miejsce implantacji elektrody miało parę kontrolną w anatomicznie porównywalnym (tj. odpowiedniku dopasowanym lustrzanie).</li>
</ol>
3. Sekcja i osadzanie
<ol>
	<li>Usuń matrycę implantu z oka i usuń przednią część oka (w tym rogówkę, tęczówkę i soczewkę). Usunąć płyn szklisty z pozostałej muszli ocznej (komory tylnej).</li>
	<li>Rozciąć wszczepione oko na wiele reprezentatywnych pasków (o grubości ~ 2 mm), z których każdy zawiera podzbiór obszarów oznaczonych barwnikiem (ryc. 3D). Należy pamiętać, że orientacja pasków powinna być tak dobrana, aby pomóc w ocenie różnych aspektów odpowiedzi tkanek na implant7.</li>
</ol>
Przydatne jest, na przyszłość, aby zapisać, które obszary barwnika są obecne na każdym pasku i ich względne lokalizacje (i kolory).
<ol start="3">
	<li>Umieść pasek na boku w płytkiej kałuży skroplonego agaru (4%; 80 - 90 °C) stroną do przecięcia skierowaną do dołu (Rysunek 3E).</li>
	<li>Gdy agar stwardnieje, przeciąć próbkę i umieścić w kasecie na chusteczki wspartej na wkładkach piankowych (ryc. 3F).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.3 dla kontrolnego oka - uważając, aby przeciąć paski dopasowane do lustra.</li>
	<li>Wszystkie kasety są przetwarzane za pomocą standardowej (zautomatyzowanej techniki przetwarzania parafiny w nocy).</li>
	<li>Przetworzoną tkankę zanurzyć w parafinie stroną do przecięcia skierowaną do dołu.</li>
</ol>
4. Cięcie i barwienie
<ol>
	<li>Pociąć bloki parafiny na odcinki o grubości 5 μm, regularnie nawiązując do uwag z kroków 2 i 3.</li>
	<li>Zbierz sekcje z każdego z barwionych regionów i zamontuj na zjeżdżalniach.</li>
</ol>
Obszar bezpośrednio przylegający do każdego barwionego miejsca twardówki może być teraz z pewnością oceniony, że znajdował się najbliżej odpowiadającej mu elektrody w matrycy (Rysunek 4).
<ol start="3">
	<li>Zabarwić lub wykonać immunofluorescencję zgodnie z życzeniem. Przykładowe barwienia i immunohistochemia pokazane na rysunku 5 to: H&E; Luxol szybki niebieski (LFB); fiolet kresylowy; Trójchromowy niebieski Massona; kwas periodyczny schiff (PAS); Pruska niebieska plama Perlsa; syntetaza antyglutaminowa (GS); białko anty-neurofilamentowe (NF); kwaśne białko fibrylarne przeciwglejowe (GFAP) i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI).</li>
	<li>Bejce standardowe i specjalne wykonano zgodnie z opisem:
	<ol>
		<li>Barwienie H&E zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem dostarczonym przez matrycę kąpielową Leica multistainer ST5020 (Leica Biosystems).</li>
		<li>LFB i fiolet krezylowy (zmodyfikowany z 11):
		<ol>
			<li>Odwoskować w 3 przemianach ksylenu (3x 2 min) i 2 przemianach etanolu (100%, 100%) (2x 1 min) i spłukać w wodzie z kranu (45 sek).</li>
			<li>Uwodnić sekcje do 95% etanolu.</li>
			<li>Umieścić w roztworze LFB 11 w temperaturze 37-42 °C (przez noc).</li>
			<li>Spłucz nadmiar plamy 70% etanolem.</li>
			<li>Spłucz w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Umieścić w rozcieńczonym węglanie litu (8%) (kilka sekund).</li>
			<li>Różnicować w 70% etanolu (kilka sekund).</li>
			<li>Spłucz w wodzie destylowanej.</li>
			<li>W razie potrzeby powtarzaj kroki od 4.4.2.6 do 4.4.2.8, aż tło stanie się bezbarwne.</li>
			<li>Umieścić w roztworze roboczym octanu fioletu krezylowego w temperaturze 37 °C (10 min).</li>
			<li>Nie myć w wodzie.</li>
			<li>Odwodnić w 3 przemianach alkoholu bezwodnego (1x 30 sek., 2x 20 sek.) i 3 przemianach ksylenu (1x 1 min 30 sek., 2x 1 min).</li>
			<li>Mocowanie i szkiełko nakrywkowe z filtrem DPX.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trójchromowy niebieski Massona (zmodyfikowany z 11):
		<ol>
			<li>Odwoskować zgodnie z 4.4.2.1.</li>
			<li>Doprowadź sekcje do wody (2 min).</li>
			<li>Wybarwić jądra za pomocą hematoksyliny żelaza Weigerta (2 min).</li>
			<li>Umyć w wodzie z kranu, spłukać w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Zabarwienie w roztworze szkarłatnej fuksyny kwasu biebrycha (5 min).</li>
			<li>Spłucz w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Różnicować w kwasie fosfomolibdynowo-fosfatungsowym, aż kolagen stanie się bladoróżowy (6 min).</li>
			<li>Spłucz w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Barwienie przeciwstawne w błękicie anilinowym (1 min).</li>
			<li>Dobrze umyć w 1% kwasie octowym (1 min).</li>
			<li>Odwodnić, zamontować i nakryć szkiełko nakrywkowe zgodnie z 4.4.2.12 i 4.4.2.13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PAS (zmodyfikowany z 11):
		<ol>
			<li>Odwoskować zgodnie z 4.4.2.1.</li>
			<li>Utlenić w 1% kwasie okresowym (15 min).</li>
			<li>Umyć pod bieżącą wodą, a następnie wodą destylowaną.</li>
			<li>Zabarwieć w odczynniku Schiffa (15 min).</li>
			<li>Umyć w wodzie (5 min).</li>
			<li>Barwienie przeciwstawne hematoksyliną Harrisa (1 min).</li>
			<li>Umyj krótko w wodzie z kranu.</li>
			<li>Rozróżnić w 0,5% kwaśnym alkoholu (1 zanurzenie).</li>
			<li>Dobrze umyj w wodzie z kranu.</li>
			<li>Niebieski w wodzie z kranu Scotta (1 min).</li>
			<li>Dobrze umyć w wodzie.</li>
			<li>Odwodnić, zamontować i nakryć szkiełko nakrywkowe zgodnie z 4.4.2.12 i 4.4.2.13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pruska niebieska plama Perlsa opisana w 11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono szczegółowo w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Odwoskować zgodnie z 4.4.2.1.</li>
		<li>Spłucz w wodzie destylowanej (2x 5 min).</li>
		<li>Pobrać antygen przy użyciu 0,01% buforu cytrynianowego o pH 6 w temperaturze 75 - 80 °C (20 min) i pozostawić do ostygnięcia w 0,01% roztworze buforowym cytrynianu (20 min).</li>
		<li>Przemyć skrawki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (2x 5 min).</li>
		<li>Przeniknąć błonę komórkową w roztworze buforowym do przemywania (10 min).</li>
		<li>Inkubować w roztworze bloku surowicy (2 godziny).</li>
		<li>Inkubować skrawki w pojedynczym przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym w rozcieńczalniku przeciwciał (10% normalna surowica kozia/0,1% Triton X-100/PBS) (przez noc w lodówce). Miano każdego zastosowanego przeciwciała pierwszorzędowego przedstawiono w Tabeli 1.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji przemyć sekcje w roztworze buforowym do przemywania (5x 3 min). Od tego momentu utrzymuj sekcje w ciemności.</li>
		<li>Inkubować skrawki w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym przy mianie 1:500 przez określony czas (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1).</li>
		<li>Przemyć sekcje w roztworze buforowym do przemywania (3x 5 min).</li>
		<li>Inkubacja sekcji w DAPI (1:25 000 / PBS) (30 min).</li>
		<li>Przemyć sekcje w roztworze buforowym do przemywania (3x 5 min).</li>
		<li>Montaż i szkiełko nakrywkowe za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Próbki testowe i próbki kontrolne są gotowe do porównania parami.

<ol><li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li>
<li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li>
<li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li>
<li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li>
<li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li>
<li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li>
<li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis%3A+evaluation+of+implantation+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li>
<li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson%27s+fluid%3A+comparison+with+Bouin%27s+fluid+and+conventional+Davidson%27s+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li>
<li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li>
<li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+whole+eyes%3A+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+JD+%22Theory+and+practice+of+histological+techniques%22">Theory and practice of histological techniques</a>. , 6, Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Troubleshooting+histology+stains%22">Troubleshooting histology stains</a>. , Churchill Livingstone. (1998).</li>
<li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li>
<li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons%3A+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li>
<li>Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li>
<li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li>
<li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li>
<li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+%28EPI-RET%29+with+an+IOL-type+receiver+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li>
<li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li>
<li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li>
<li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li>
<li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials%3A+successful+long-term+implantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li>
<li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li>
<li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li>
<li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li>
<li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li>
<li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li>
<li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+of+a+Wide-Field+Suprachoroidal+Retinal+Pros%22">Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis</a>. , The University of Melbourne. (2012).</li>
<li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).</li>
<li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model%5BTitle%5D)+AND+%22in+Vision+and+Ophthalmology+Annual+Meeting.%2C+Vol.+4928%2FA327%22%5BJournal%5D)">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).</li>
<li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina%3A+effects+of+electrode+return+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009(2012).</li>
<li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li>
<li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li>
<li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBron%2C+AJ+%22Wolff%27s+anatomy+of+the+eye+and+orbit%22">Wolff's anatomy of the eye and orbit</a>. , Arnold. (2001).</li>
<li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li>
<li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ocena bezpieczeństwa implantu jest podstawowym czynnikiem branym pod uwagę w badaniach przedklinicznych. Zanim proteza siatkówki będzie mogła zostać wszczepiona ludziom, konieczne jest sprawdzenie, czy nie spowoduje ona żadnych szkód. Wymaga to oceny zarówno biokompatybilności implantu 17-23 , jak i wszelkich potencjalnych uszkodzeń, które mogą być spowodowane przewlekłą stymulacją elektryczną 24-26. Doświadczenie z podobnymi protezami neuronowymi, takimi jak implant ślimakowy, daje wgląd w szeroki zakres stymulacji i parametrów fizycznych, które nie powodują uszkodzenia tkanek 27. Jednak siatkówka ma inną charakterystykę niż inne miejsca implantacji, a zatem nie można założyć precyzyjnych granic bezpieczeństwa (takich jak maksymalna gęstość ładunku) na podstawie wcześniejszych badań w innych systemach. Gęstości ładunków są najwyższe w miejscach elektrod aktywnych, co odpowiada największemu potencjałowi uszkodzenia. W związku z tym metoda lokalizacji tkanki bezpośrednio przylegającej do poszczególnych elektrod aktywnych znacznie zwiększyłaby użyteczność tych badań. Tkanka przylegająca do określonych obszarów implantu może być również podświetlona w celu dokładniejszego przyjrzenia się. To ukierunkowane podejście pozwala na analizę mniejszej liczby sekcji, przy jednoczesnym zachowaniu pewności, że "najgorszy scenariusz" został zbadany.
Opisana tutaj metoda lokalizacji barwnika twardówki została gruntownie przetestowana przy użyciu ręcznie kształtowanych i formowanych układów elektrod silikon/Pt 28-30. Był używany z cienkowarstwowymi matrycami poliamidowymi 7,31 , a także cienkowarstwowymi matrycami silikonowymi/Pt 32. W niektórych badaniach protez siatkówki stosowano elektrody w kształcie "kuli" z implantacją śródtwardówkową 33. Obecna technika powinna być skuteczna w ocenie tego typu układów elektrod. Kocie oczy z cienką twardówką (grubość na tylnym biegunie 90 - 200 μm) pozwalały na wizualizację poszczególnych elektrod w układzie. Jednak nawet jeśli poszczególne elektrody nie były widoczne, ich położenie można było łatwo wywnioskować za pomocą silikonowego szablonu, gdy widoczny jest kontur matrycy (podobnie jak w kroku 2.6).
Mapowanie barwnika ogranicza potrzebę uzyskiwania nieistotnych skrawków tkanki, ponieważ uzyskuje się tylko skrawki z obecnym barwnikiem. Możliwość dokładnego określenia położenia elektrody nie tylko pozwala na odpowiednią analizę histopatologiczną i większą moc statystyczną, ale ma duży wpływ na zarządzanie czasem i kosztami poprzez zmniejszenie ilości używanych szkiełek i ostrzy, a także kosztów pracy. Użycie barwnika, który jest przylegający i może wytrzymać przetwarzanie tkanki, a jednocześnie jest widoczny w niebarwionych skrawkach tkanek, jest ważnym wstępnym czynnikiem. Wiedza na temat lokalizacji barwnika i orientacji tkanki podczas preparowania i podczas zatapiania wspomaga proces cięcia. Obejmuje to prawidłową orientację bloku w celu uzyskania sekcji, która nie jest ukośnie cięta i daje pełne odwzorowanie tkanki. Dlatego ważne jest, aby osoba wykonująca cięcie była obecna w czasie nakładania barwnika, rozcinania i zatapiania.
Ogólny protokół jest odporny na drobne zmiany, szczególnie w zakresie czasów fiksacji. Jednak etapy sekcji oka i znakowania barwnika są delikatnymi procedurami, które korzystają z dobrej zręczności manualnej, aby uniknąć uszkodzenia próbki. Podczas gdy utrwalacz Davidsona okazał się skuteczny w zmniejszaniu sztucznego odwarstwienia siatkówki w pobliżu implantu, nie zapobiega bezpośrednim uszkodzeniom mechanicznym podczas sekcji. Utrwalacz Davidsona nie był łatwo kompatybilny z niektórymi specjalnymi procedurami histologicznymi i immunohistochemicznymi. W związku z tym zaistniała potrzeba modyfikacji/optymalizacji tych kroków, jak opisano powyżej. Dokonywano stopniowych zmian czasów barwienia i stężeń, aż do osiągnięcia optymalnego wyniku - więcej szczegółów można znaleźć w materiałach uzupełniających.
Kwantyfikacja histologii siatkówki pozostaje problematyczna. Siatkówka jest niejednorodna i zarówno grubość, jak i gęstość komórek zmieniają się wraz ze wzrostem odległości od obszaru centralnego wynosi 34,35. W związku z tym sąsiednie tkanki w obrębie wszczepionego oka nie mogą być używane do porównań, a zamiast tego stosuje się oko kontrolne. Dopasowanie parami każdej sekcji z okiem kontrolnym daje nam potężniejsze statystyczne porównanie zmian patologicznych; Wyniki skuteczności i bezpieczeństwa protez siatkówki są lepiej oceniane, gdy porównuje się inne oczy u pacjenta 36. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować cięcie ukośne, ponieważ wpłynęłoby to na ocenę ilościową.
Podsumowując, opisane powyżej metody znacznie poprawiły naszą analizę histopatologiczną, co z kolei doprowadziło do bardziej efektywnego przebiegu badań przedklinicznych. Wyniki badań przedklinicznych z wykorzystaniem tych metod bezpośrednio doprowadziły do badania klinicznego, w którym 3 pacjentom z RP bezpiecznie wszczepiono protezy siatkówki nadnaczyniówkowej. Metody te są istotne zarówno w przypadku stymulatorów siatkówki, jak i innych implantów ocznych, w przypadku których należy ocenić patologiczną odpowiedź na długotrwałą implantację. Metoda ta przyniosła cenne korzyści w zakresie utrzymania cytoarchitektury i rejestracji patologii w obszarach zainteresowania na implancie. Chociaż nie zostało to specjalnie przetestowane, modyfikacja tych procedur może być stosowana u innych gatunków i w innych miejscach anatomicznych, szczególnie tam, gdzie matryca jest wszczepiana powierzchownie.

Protezy siatkówki mogą wkrótce stać się użytecznymi interwencjami klinicznymi w leczeniu różnych form ciężkiej utraty wzroku. Niektóre stany, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP), powodują rozległe zwyrodnienie fotoreceptorów w oku; Są to komórki odpowiedzialne za przekształcanie światła w sygnały neuronowe. Jednak niektóre komórki w innych warstwach siatkówki pozostają i są potencjalnymi celami stymulacji elektrycznej za pomocą protezy siatkówki 1. Wczesne wyniki badań klinicznych na ludziach są obiecujące dla układów elektrod wszczepianych w 2,3 nasiatkówkówce, 4,5 i śródtwardówkowej 6. Urządzenia te są wykonane z różnych materiałów o różnych kształtach, ale wszystkie wykorzystują impulsy elektryczne do aktywacji pozostałych żywotnych neuronów siatkówki w celu tworzenia percepcji wzrokowych.
Nasza szersza grupa (Bionic Vision Australia) opracowała implant siatkówki, który przeszedł do klinicznego badania pilotażowego z udziałem 3 pacjentów RP, którym wszczepiono matryce elektrod nadnaczyniówkowych (Numer badania klinicznego: NCT01603576). Rycina 1A przedstawia ten nadnaczyniówkowy prototyp protezy siatkówki.
Bezpieczeństwo pacjenta jest najważniejsze w badaniach klinicznych, dlatego też, przed rozpoczęciem badań na ludziach, przeprowadziliśmy obszerne badania ostre i przewlekłe w modelach przedklinicznych (Rysunek 1B). Oceny histopatologiczne były niezbędne do udoskonalenia procedur chirurgicznych, iteracji projektu elektrody i ostatecznie ustalenia bezpieczeństwa implantu. Aby utrzymać wydajny przebieg pracy zgodny ze standardowymi praktykami patologii klinicznej, zastosowano technikę zatapiania parafiny. Pożądane było również zastosowanie procedur barwienia porównywalnych ze standardami klinicznymi, takich jak hematoksylina i eozyna (H&E), które są chętnie interpretowane przez patologów. Zależało nam również na technice, którą można by dostosować do analiz immunohistochemicznych, aby ułatwić dalszą ocenę komórkową tkanek.
Biokompatybilność materiałów implantów oraz bezpieczeństwo przewlekłej stymulacji elektrycznej muszą być dokładnie ocenione. Ważne jest, aby móc zbadać histopatologię tkanki oka przylegającej do poszczególnych elektrod stymulujących w obrębie matrycy. Jednak matryce musiały zostać usunięte przed przetworzeniem próbek, aby można je było przetestować, a także dlatego, że ich metalowe elementy nie mogły być łatwo podzielone na sekcje. W związku z tym nasze ustalone przygotowanie tkanek nie pozwalało na lokalizację i mapowanie tkanki w odniesieniu do wszczepionych elektrod 7. Oprócz braku metody lokalizacji tkanki, standardowe techniki utrwalania i przetwarzania na bazie formaldehydu skutkowały rozległymi artefaktami i odklejeniem siatkówki z powodu zróżnicowanego kurczenia się różnych warstw oka (ryc. 2). Ze względu na niejednorodność siatkówki trudno było dokonać miarodajnych porównań z tkanką kontrolną, szczególnie w przypadku pomiarów ilościowych. Te połączone ograniczenia komplikowały dokładną ocenę potencjalnych szkód spowodowanych przez nasze wszczepione matryce.
Tutaj prezentujemy nowatorskie techniki pokonywania tych ograniczeń. Zmodyfikowaliśmy specjalistyczne techniki fiksacji i przetwarzania oka 8-10, aby zachować zgodność z histologią opartą na parafinie. Zmodyfikowaliśmy standardowe barwienia histologiczne i immunohistochemiczne, aby uzyskać porównywalne wyniki, w oparciu o informacje zwrotne od patologów klinicznych. Po uczynieniu tkanki twardówki przezroczystą przezroczystą zastosowano kod kolorystyczny na bazie barwnika, aby oznaczyć tkankę oka przylegającą do każdej pojedynczej elektrody, przed usunięciem matrycy z przestrzeni nadnaczyniówkowej. Oznaczając układ elektrod i poszczególne miejsca elektrod, można było dokładnie pobrać próbki z obszarów sąsiadujących z elektrodami. Dopasowane próbki można pobrać z oka kontrolnego, aby ułatwić porównania parami.

<table><tbody><tr><td>System znakowania Davidson</td><td>Bradley Products</td><td>1163-4 - czerwony 1163-5 - niebieski 1163-2 - żółty 1163-1- zielony</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwglejowe fibrylarne kwasowe białkowe</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td>1:1500, inkubacja przez noc</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało syntetazy antyglutaminowej</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>1:100 inkubacja przez noc</td></tr><tr><td>Monoklonalne mysie przeciwciało antyneurofilamentowe 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0142</td><td>1:100 inkubacja przez noc</td></tr><tr><td>4',6-diamindino-2-fenyloindol, dilactate (dilactate)</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>1:25,000 30 min inkubacja</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysia IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Superfrost 90&deg; żółty</td><td>Grale Scientific</td><td>SF41299</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe FLEX IHC</td><td>DAKO</td><td>K802021-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-królicza IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td><td>Life Technologies</td><td>PCN5000</td><td>10% surowica/0,1% Triton X-100/PBS</td></tr><<tr>td colspan="4"> <silny>niestandardowy roztwór Preparat do specjalnych plam 1% Wodny roztwór podstawowy fioletu krezylowego <ul> <li>Fiolet krezylowy 1 g</li> <li>Woda destylowana 100 ml</li> </ul> Roztwór roboczy octanu fioletu krezylowego <ul> <li>1% wodny roztwór podstawowy fioletu krezylowego 9 ml</li> <li>Woda destylowana 51 ml</li> <li>10% kwas octowy 0,5 ml</li> </ul> Biebrich Szkarłatny kwas Fuksin Solution <ul> <li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li> <li>1% acid fuksyna 10 ml</li> <li>Glacial octowy kwas 1 ml</li> </ul> Roztwór kwasu fosfomolibdenowo-fosfogundowego <ul> <li>Kwas fosfomolibdenowy 2,5 g</li> <li>Kwas fosfowolframowy 2,5 g</li> <li>Woda destylowana 100 ml</li> </ul> Roztwór błękitu anilinowego <ul> <li>Błękit anilinowy 2,5 g</li> <li>Lodowcowy kwas octowy 2 g</li> <li>Woda destylowana 100 ml</li> </ul> Roztwory do immunohistochemii Roztwór buforowy do płukania <ul> <li>0,1% Triton X-100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)</li> </ul> Roztwór bloku surowicy <ul> <li>10% normalna surowica kozia/0,1% Triton X-100 w PBS</li> </ul> MATERIAŁ UZUPEŁNIAJĄCY Luxol Fast Blue Celem barwienia Luxol Fast Blue (LFB) była identyfikacja komórek zwojowych w warstwie komórek zwojowych za pomocą przeciwbarwienia fioletu krezylowego. Podczas gdy LFB barwi mielinę, barwnik fioletu krezylowego wiąże się z substancjami Nissl w neuronach, składającymi się z szorstkiej retikulum endoplazmatycznego i rybosomów. Liczne komórki siatkówki zawierają substancję Nissl, w tym komórki amakrynowe. Komórki te zwykle znajdują się w wewnętrznej warstwie granicznej wewnętrznej warstwy jądrowej, ale przemieszczone komórki amakrynowe można znaleźć w warstwie komórek zwojowych. Barwienie substancji Nissl jest pomocne w odróżnianiu dużych, silnie wybarwionych komórek zwojowych od mniejszych przemieszczonych komórek amakrynowych. Aby pomóc w wizualizacji tych komórek, zmodyfikowaliśmy protokół roztworu roboczego fioletu krezylowego, zwiększając objętość roztworu podstawowego fioletu krezylowego w roztworze roboczym. Zwiększaliśmy objętość w krokach co 1,0 ml z 6,0 ml do 9,0 ml, co z kolei zmniejszyło objętość wody destylowanej. Oceniając łatwość wizualizacji i identyfikacji komórek zwojowych, optymalne barwienie uzyskano przy użyciu 9 ml dodatkowego roztworu podstawowego fioletu krezylowego i 51 ml wody destylowanej. Fiolet krezylowy jest barwnikiem zasadowym, chociaż do barwienia substancji Nissl należy go stosować w roztworze kwaśnym, dlatego objętość kwasu octowego pozostała niezmieniona na poziomie 0,5 ml. Periodic Acid Schiff Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) zostało wykonane w celu podkreślenia polisacharydy, zwłaszcza glikogen, znajdujący się w błonach podstawnych i ścianach komórkowych grzybów, wskazujący na infekcję grzybiczą. Proces barwienia PAS polega na utlenianiu grup hydroksylowych w polisacharydach za pomocą kwasu periodycznego, w wyniku czego powstają grupy aldehydowe. Zastosowanie odczynnika Schiffa wiąże się z grupami aldehydowymi, wytwarzając purpurowy kolor z barwieniem przeciwstawnym hematoksyliny, wytwarzając fioletowe jądra komórkowe. Nasze preparaty wykazały słabe zabarwienie na wewnętrznej błonie ograniczającej. Może to być spowodowane obecnymi polisacharydami, ponieważ nie wszystkie polisacharydy można utlenić w standardowych ramach czasowych, zwłaszcza te zawierające polisacharydy anionowe. W związku z tym wydłużyliśmy czas trwania etapu utleniania z 10 minut do 12, 15 i 20 minut. Odkryliśmy, że 15-minutowy etap utleniania był najbardziej skuteczny w barwieniu PAS. Masson' s Trichrome Blue Zasada działania trichromowego niebieskiego barwnika Massona polega na barwieniu kolagenu i mięśni, co w naszych szkiełkach siatkówkowych może być wykorzystane do wskazania wzrostu tkanki kolagenowej, co może wskazywać na zwłóknienie spowodowane urazem. Ta plama jest wrażliwa na techniki utrwalania, więc potrzebne były zmiany, aby uzyskać optymalne barwienie. Proces tego barwienia polega na początkowym zabarwieniu cytoplazmy i włókien mięśniowych na czerwono za pomocą kwaśnego barwnika Biebrich szkarłatno-kwasowo-fuksynowego. Różnicowanie kwasem fosfomolibdenowym/fosfowolframowym konkuruje z czerwonym barwnikiem we włóknach kolagenowych. W twardówce twardówki duże cząsteczki kwasu fosfomolibdenowego / fosfowolframowego są w stanie przeniknąć do luźnej tkanki łącznej, w przeciwieństwie do gęstych włókien mięśniowych, które są przepuszczalne tylko dla małych cząsteczek. Następnie stosuje się niebieski barwnik anilinowy w celu zastąpienia kwasu we włóknach kolagenowych, wytwarzając twardówkę barwioną na niebiesko. Aby zoptymalizować to zabarwienie w skrawkach siatkówki, czas barwienia barwnikiem szkarłatno-fuksynowym Biebricha został skrócony, aby uzyskać równowagę między niebieskim i czerwonym barwnikiem. Stosowanie utrwalacza Davidsona wymagało również wydłużonego czasu różnicowania w celu usunięcia czerwonego barwnika z kolagenu. Próbowaliśmy różnicowania po 5, 6, 8 i 10 minutach, a optymalne wyniki uzyskano po 6 minutach. Różnicowanie różni się również w zależności od grubości i cięcia gładkich odcinków, przy czym prawdopodobnie wymagane jest różnicowanie większe niż 6 minut. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Poliklonalny, gatunkiem żywiciela jest królik, ma masę cząsteczkową 50 kDa. Antygen GFAP jest włóknem pośrednim znajdującym się w cytoplazmie (cytoplazmie astrocytów i M&uuml; komórek Llera w siatkówce), antygen składa się z 428 aminokwasów i ma masę cząsteczkową 49512 Da. Neurofilament-200 przeciwciało Monoklonalne, gatunkiem gospodarza jest mysz, klon N52, izotyp IgG1, rozpoznaje ufosforylowane i nieufosforylowane formy ciężkich neurofilamentów o masie cząsteczkowej 200 kDa. Przeciwciało zwiąże się z epitopem w domenie ogonowej neurofilamentu. Przeciwciało będzie barwić neurofilamenty w neuronalnej perikarya, dendrytach i aksonach. Przeciwciało syntetazy glutaminy (GS) Monoklonalny, klon GS-6, gatunkiem gospodarza jest mysz, ma masę cząsteczkową 45 kDa i izotyp przeciwciała IgG2a. Antygen GS znajduje się w cytoplazmie komórki (cytoplazma M&uuml; komórek w siatkówce), antygen ma 373 aminokwasy i masę cząsteczkową 42 064 Da. </td></tr></tbody></table>

techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Wraz z niedawnym rozwojem protez siatkówki, ważne jest opracowanie wiarygodnych technik oceny bezpieczeństwa tych urządzeń w badaniach przedklinicznych. Jednak standardowe utrwalanie, przygotowanie i zautomatyzowane procedury histologiczne nie są idealne. W tym miejscu opisujemy nowe procedury oceny stanu siatkówki bezpośrednio przylegającej do implantu. Protezy siatkówki wyposażone są w układy elektrod stykające się z tkanką oka. Dotychczasowe metody nie były w stanie przestrzennie zlokalizować tkanki oka przylegającej do poszczególnych elektrod w układzie. Ponadto standardowe przetwarzanie histologiczne często powoduje poważne odwarstwienie warstw siatkówki podczas oceny wszczepionych oczu. W związku z tym trudno było ocenić miejscowe uszkodzenia, jeśli występują, spowodowane implantacją i stymulacją wszczepionego układu elektrod. Dlatego opracowaliśmy metodę identyfikacji i lokalizacji tkanki oka przylegającej do wszczepionych elektrod za pomocą (oznaczonego kolorami) schematu znakowania barwnikiem i zmodyfikowaliśmy technikę fiksacji oka, aby zminimalizować sztuczne odwarstwienie siatkówki. Metoda ta sprawiła również, że twardówka stała się przezroczysta, co umożliwiło lokalizację poszczególnych elektrod i określonych części implantu. Na koniec zastosowaliśmy dopasowaną kontrolę, aby zwiększyć moc ocen histopatologicznych. Podsumowując, metoda ta umożliwia rzetelną i skuteczną dyskryminację oraz ocenę cytoarchitektury siatkówki w oku z implantem.

Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny przekrój uzyskany poprzez wycięcie próbki pokazanej na Rysunku 3. Przekrój wykonano przy grubości 5 μm i zabarwiono metodą H&amp;E zgodnie z opisanymi powyżej protokołami. Ogólny kształt paska próbki został zachowany przy minimalnych artefaktach różnicowych tkanek (Rysunek 4A). Oba oznaczenia barwnikowe były widoczne na twardówce, przy czym zielony barwnik okazał się bardziej trwały niż czerwony (Rysunek 4B). Warstwy siatkówki nie uległy sztucznemu odwarstwieniu, a morfologia siatkówki została zachowana (Rysunek 4C). Tkanka siatkówki sąsiadująca z oznaczeniami barwnikowymi, która odpowiada położeniu elektrod w macierzy, może zostać łatwo zidentyfikowana.
Rysunek 5 przedstawia reprezentacyjne barwienia specjalne i badania immunohistochemiczne w przekrojach tkanek przygotowanych zgodnie z niniejszym protokołem. Szczegółowe informacje na temat konkretnych barwień oraz wprowadzonych modyfikacji w ich zastosowaniu znajdują się w opisie do Rysunku 5 oraz w materiałach uzupełniających. Po wprowadzeniu modyfikacji barwienia te oraz badania immunohistochemiczne były równoważne uznanym standardom – co zostało zweryfikowane przez patomorfologów.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ przeciwciała pierwszorzędowego i miano (w nawiasie)</td>
			<td>GFAP (1:1500)</td>
			<td>NF200 (1:100)</td>
			<td>GS (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ przeciwciała wtórnego i miano (w nawiasie)</td>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas inkubacji przeciwciała wtórnego</td>
			<td>1 godz.</td>
			<td>2 godz.</td>
			<td>45 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Typ przeciwciał, miano i czas trwania znakowania.
<img alt="Projekt urządzenia mikroprzepływowego, układ eksperymentalny; elastyczne kanały, analiza przepływu, metoda badawcza." src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Prototyp macierzy elektrod nadchrzewkowych. A) Makrofotografia formowanej macierzy klasy klinicznej. B) Fotomikrografia ręcznie wykonanej macierzy przedklinicznej.
<img alt="Przekrój histologiczny struktury tętnicy, schemat przekroju poprzecznego ukazujący warstwy naczyniowe, szczegóły komórkowe." src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Poprzednia histologia siatkówki. Do przygotowania tych sekcji barwionych H&amp;E oka z implantowaną macierzą elektrod nadrzporewkółkowej zastosowano standardowe metody histologiczne. A) Przekrój prostopadły przez jamę macierzy elektrod (oznaczoną gwiazdką). Siatkówka jest oddzielona od zewnętrznych tkanek oka. Jest to szczególnie widoczne poniżej obszaru implantacji (strzałka). Niemożliwe jest określenie, która część siatkówki przylegała do poszczególnych elektrod macierzy. Pasek skali = 1 mm. B) Większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką na panelu A. W warstwach siatkówki widoczne są liczne, regularnie rozmieszczone artefakty (strzałki), a także znaczne oddzielenie od warstwy tapetum (warstwy odblaskowej w oczach kotów). Pasek skali = 100 μm. C) Większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką na panelu B. Strzałka wskazuje zewnętrzne segmenty fotoreceptorów oraz nabłonek pigmentowy, które pozostały nienaruszone, co sugeruje, że oddzielenie było artefaktem powstałym podczas preparatyki, a nie wynikiem urazu lub patologii in vivo. Pasek skali = 20 μm.
<img alt="Przecinanie i analiza skorupy ślimaka; obrazy A-C pokazują orientację skorupy; D pokazuje ścieżkę cięcia; E, F przedstawiają zatopione przekroje do mikroskopii." src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Lokalizacja i sekcja tkanki sąsiadującej z elektrodą. A-D) Makrofotografie o wysokiej rozpiętości tonalnej enukleowanego oka z macierzą elektrod nadchłonoidalną in situ. A) Po utrwaleniu fiksatywem Davidsona, a przed usunięciem macierzy, półprzezroczysta twardówka umożliwia wizualizację poszczególnych elektrod w macierzy (pojedynczy przykład wskazany strzałką). B) Elektrody są oznaczone barwnikiem o określonym kolorze. C) Oznaczenia barwnikiem w regularnych odstępach od punktów orientacyjnych anatomicznych są wykorzystywane w celu zachowania spójności między eksperymentami. D) Po usunięciu macierzy oko jest sekcjonowane ręcznie na paski próbek. Kolorowe strzałki wskazują dwa z obszarów sąsiadujących z elektrodami na twardówce. Żółta przerywana linia wskazuje płaszczyznę cięcia. E) Makrofotografia paska próbki zatopionej w bloku agaru. F) Makrofotografia paska próbki zatopionej w agarze z panelu E, wyciętego i umieszczonego w kasecie do zatapiania, wspartej przez gąbkowe wkłady do biopsji, aby zminimalizować przemieszczanie się przekroju podczas procesowania.
<img alt="Histological microscopy image detailing retinal layer structure and tissue morphology analysis." src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Nowa histologia siatkówki. powyższy pasek z próbką (z Rysunek 3D), zawierający otwór na elektrodę, został zatopiony w parafinie i pocięty na przekroje o grubości 5 μm i barwione H&amp;E. A) Obszary barwione na zielono i czerwono (wskazane strzałkami, tak jak w Rysunek 3D) są widoczne w przekroju wykonanym na poziomie żółtej przerywanej linii w Rycina 3DSkala = 1,000 μmSiatkówka nie jest odwarstwiona ani pod kieszenią matrycy, ani w innych obszarach. B) Zaznaczony obszar z panelu A z widocznymi czerwonym i zielonym barwnikiem wskazanymi strzałkami oraz nienaruszoną siatkówką w całym obszarze. Pasek skali = 500 μm. C) Obszar zaznaczony ramką na panelu B, przedstawiająca nienaruszoną, przytwierdzoną siatkówkę sąsiadującą z zielonym barwnikiem. Pasek skali = 50 μmWiedząc, że lokalizacja barwnika wskazuje położenie elektrody, możemy z pewnością ocenić sąsiadującą tkankę siatkówki pod kątem ewentualnych uszkodzeń spowodowanych stymulacją elektryczną.
<img alt="Obrazy z mikroskopii histologicznej i fluorescencyjnej z przekrojów tkankowych; analiza struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Przykłady zmodyfikowanej cytohistochemii siatkówki z wykorzystaniem barwień specjalnych i immunofluorescencji. Zastosowanie fiksaty Davidsona, w przeciwieństwie do standardowych technik fiksacji formaliną, wymagało wprowadzenia zmian w zwykłych protokołach barwienia, zgodnie z opisem w głównym tekście protokołu. Patolodzy potwierdzili, że modyfikacje te doprowadziły do uzyskania równoważnego barwienia. A) H&amp;E; hematoksylina barwi jądra komórkowe na fioletowo, podczas gdy eozyna barwi cytoplazmę komórek, kolagen i tkankę podporową na różne odcienie różu. B) LFB barwi mielinę na niebiesko, natomiast przeciwbarwienie kresylowym fioletem może być wykorzystane do identyfikacji komórek zwojowych poprzez zabarwienie ciałek Nissla w perykaryonie na niebiesko oraz uwidocznienie komórek satelitarnych otaczających komórki. C) Triczromia Massona (niebieska); roztwór szkarłatu Biebricha i fuksyny kwasowej barwi włókna mięśniowe na czerwono, podczas gdy błękit anilinowy barwi kolagen, w tym przypadku twardówkę, na niebiesko. D) PAS; komponenty glikoproteinowe błony podstawnej i komponenty tkanki łącznej są barwione na fioletowo, podczas gdy hematoksylina barwi jądra komórkowe na fioletowo. E) Perls' Prussian blue; w miejscu krwotoku tworzenie się hemosyderyny z rozkładu czerwonych krwinek i uwalnianie kompleksów żelaza daje kolor fioletowy, natomiast dodatek barwnika czerwieni neutralnej barwi lizosomy na czerwono. F) GS; ten enzym degradujący neuroprzekaźniki, występujący w komórkach Müllera 13 (zielony), rozciąga się w obu kierunkach, z ciałami komórek Müllera w wewnętrznej warstwie jądrowej i stopami komórek Müllera tworzącymi wewnętrzną błonę ograniczającą. G) NF-200; to cytoszkieletowe białko łańcucha ciężkiego (zielone), występujące w somach komórkowych i wypustkach, tworzy sieci z innymi neurofilamentami w celu utrzymania struktury neuronów 14,15. Komórki zwojowe i ich aksony są widoczne w warstwie komórek zwojowych i warstwie włókien nerwowych, natomiast uwidoczniono również aksony komórek horyzontalnych zlokalizowanych na zewnętrznej krawędzi wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kota. Przeciwbarwienie DAPI (niebieskie) umożliwia wizualizację warstw siatkówki. H) GFAP; to białko cytoszkieletowe (czerwone), które proliferuje w komórkach Müllera i astrocytach podczas gliozy 16, wyściela warstwę włókien nerwowych, a komórki Müllera tworzą cienkie wypustki przechodzące od wewnętrznych do zewnętrznych warstw siatkówki. Przeciwbarwienie DAPI (niebieskie) pozwala na wizualizację warstw siatkówki. Pasek skali = 50 μm na wszystkich panelach. Wewnętrzna część siatkówki znajduje się na górze każdego obrazu; zewnętrzna część siatkówki znajduje się na dole każdego obrazu, z wyjątkiem panelu E, który przedstawia reakcję podtwardówkową.

Techniki wizualizacji cytoarchitektury siatkówki bezpośrednio przylegającej do pojedynczych elektrod w stymulatorze siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Ogólnym celem tej procedury jest usprawnienie oceny bezpieczeństwa protez siatkówki. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie powierzchni optymalnie utrwalonego enukleowanego oka barwnikami tkankowymi w celu wskazania położenia implantowanej elektrody. W drugim kroku macierz elektrod zostaje usunięta, a tkanka oka jest rozcinana na paski.Następnie paski stabilizuje się w agarze, a potem zatapia w parafinie. W ostatnim kroku wyznaczone obszary zainteresowania są cięte i osadzane na szkiełkach przedmiotowych w celu przeprowadzenia barwienia. Ostatecznie stan zdrowia obszarów implantowanych sąsiadujących z każdą elektrodą można ocenić za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym oraz immunofluorescencji.Główną zaletą tej techniki jest możliwość zminimalizowania artefaktów związanych z utrwalaniem oraz delaminacji, przy jednoczesnym precyzyjnym śledzeniu obszarów tkanki przylegającej do elektrody w dużych próbkach. Może ona być również wykorzystywana do oceny bezpieczeństwa nowych implantów w innych chorobach oczu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ siatkówka jest podatna na delaminację, a manipulacja próbkami wymaga wysokiego poziomu zręczności.Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ znakowanie i manipulowanie kruchą tkanką są trudne do opanowania. Przed niniejszym badaniem, po implantacji macierzy elektrod nadchordalnych, oczy były przetwarzane z użyciem nieoptymalnej techniki, co zaznaczono gwiazdką. Ten pierwszy obraz przedstawia reprezentatywny przekrój ortogonalny przez jamę macierzy elektrod.Należy zauważyć, że siatkówka jest oddzielona od zewnętrznych tkanek oka. Jest to szczególnie widoczne pod obszarem implantacji, co wskazuje grot strzałki. Należy również odnotować, że nie jest możliwe określenie, która część siatkówki przylegała do poszczególnych elektrod macierzy.Przy tym większym powiększeniu w warstwach siatkówki widocznych jest kilka regularnych artefaktów związanych z uwalnianiem, wskazanych grotami strzałek, a także znaczne oddzielenie od warstwy torpedo, czyli warstwy refleksyjnej w oku kota. Przy dalszym powiększeniu można zauważyć, że zewnętrzne segmenty fotoreceptorów, jak również nabłonek barwnikowy, pozostają jednak nienaruszone, co sugeruje, że wcześniej zaobserwowane oddzielenia są efektami ubocznymi procesu przetwarzania, a nie wynikiem urazu in vivo lub patologii. W związku z tym wdrożono następującą technikę, aby zminimalizować te artefakty związane z utrwalaniem oraz delaminację.Po nukleacji i utrwaleniu oczu należy wyjąć wszczepioną gałkę oczną z etanolu i ostrożnie odciąć nadmiar tkanki, w tym spojówkę i torebkę ścięgna. Nerw wzrokowy należy przyciąć do długości od 2 do 3 mm. Macierz elektrod jest widoczna przez półprzezroczystą twardówkę.Następnie za pomocą pędzla z cienkim włosiem ostrożnie nanieś na tkankę barwniki histologiczne, aby oznaczyć elektrody zgodnie z wcześniej ustalonym kodem kolorystycznym, dbając o to, by nie rozmazać barwnika. Można nanieść dodatkowe oznaczenia barwnikiem w celu wyznaczenia punktów zainteresowania lub ułatwienia wyrównania przekrojów.Tutaj elektrody maksymalnie stymulowane zostały oznaczone kolorem zielonym. Pozostałe aktywne elektrody zostały oznaczone kolorem czerwonym. Elektrody powrotne o większej średnicy zostały zabarwione na żółto, a wszelkie dodatkowe prowadnice lub znaczniki anatomiczne zostały oznaczone niebieskim barwnikiem.Po pięciu minutach suszenia na powietrzu, umieść gałkę oczną ponownie w 70% etanolu, aby odwodnić barwnik. Następnie, po odcięciu nadmiaru tkanki z nieimplantowanej gałki kontrolnej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, wykorzystaj osiem szwów nylonowych założonych podczas etapu nukleacji i fiksacji, aby ustawić oko kontrolne i oko z implantem w lustrzanym odbiciu. Następnie nałóż silikonowy szablon o wymiarach identycznych jak macierz elektrod w miejscu lustrzanie odpowiadającym położeniu macierzy w oku z implantem w oku kontrolnym.Następnie oznakuj gałkę oczną kontrolną w sposób przedstawiony powyżej, tak aby każde miejsce implantacji elektrody miało parę kontrolną w anatomicznie porównywalnej lokalizacji. Następnie usuń matrycę implantów z oka, a potem usuń przednią część oka, w tym rogówkę, tęczówkę i soczewkę. Następnie usuń ciało szkliste z pozostałej części gałki ocznej.Następnie należy przeprowadzić dysekcję wszczepionego oka, dzieląc je na kilka pasków o grubości 2 mm. Każdy z nich powinien zawierać podzbiór obszarów oznaczonych matrycą. Orientację pasków należy dobrać tak, aby ułatwić ocenę różnych aspektów odpowiedzi tkankowej na implant; należy starannie udokumentować położenie oznaczeń matrycy na próbkach do późniejszego wykorzystania.Następnie umieść pasek stroną, która ma zostać odcięta jako pierwsza, skierowaną w dół w płytkiej warstwie upłynnionego agaru. Po zastygnięciu agaru wytnij próbkę i umieść ją w kasecie tkankowej wspartej piankowymi wkładkami. Po wypreparowaniu i zatopieniu oka kontrolnego, umieść kasety w neutralnie buforowanym forminie i poddaj je nocnemu przetwarzaniu przy użyciu standardowej zautomatyzowanej 12-godzinnej techniki zatapiania w parafinie.Następnego dnia zatopioną w parafinie przetworzoną tkankę umieść tak, aby strona przeznaczona do pierwszego cięcia była skierowana w dół. Następnie wykonaj od parafiny bloków skrawki o grubości 5 µm. Potem nanieś skrawki z każdego z barwionych obszarów na szkiełka przedmiotowe.W celu zlokalizowania obszaru DY należy regularnie sprawdzać preparaty pod mikroskopem. Obszary bezpośrednio sąsiadujące z każdą zabarwioną plamką twardówki będą tymi, które znajdowały się w najbliższej odległości od odpowiadującej im elektrody z matrycy. Na koniec należy zabarwić przekroje zgodnie z potrzebami.Wysoka rozpiętość tonalna (HDR). Przedstawiono makrofotografie enukleowanego oka kota z implantowaną macierzą elektrod nadtwardówkowych in situ po utrwaleniu w utrwalaczu Davidsona i przed usunięciem macierzy. Przezroczysta twardówka umożliwia wizualizację poszczególnych elektrod w macierzy.Jak wskazano grotem strzałki, elektrody są oznaczone zgodnie z określonym schematem kolorystycznym barwników. Oznaczenia te, naniesione w regularnych odstępach od punktów anatomicznych, służą do zachowania spójności pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Po usunięciu matrycy elektrod oko jest ręcznie sekcjonowane na paski próbek.Groty strzałek wskazują dwa z miejsc sąsiadujących z elektrodą na twardówce. Linia przerywana oznacza płaszczyznę cięcia w tym reprezentatywnym przekroju uzyskanym z wycinka próbki z poprzedniej ryciny; ogólny kształt paska próbki został zachowany przy minimalnych artefaktach tkankowych wynikających z różnic w utrwaleniu. Oba oznaczenia barwnikiem są nadal widoczne na twardówce, co wskazują groty strzałek.Choć barwnik zielony okazał się bardziej trwały niż czerwony, lokalizacja barwnika wskazuje położenie elektrody. W związku z tym można ocenić sąsiadującą tkankę siatkówki pod kątem ewentualnych uszkodzeń wywołanych stymulacją elektryczną; jak widać przy tym powiększeniu, warstwy siatkówki sąsiadujące z zielonym barwnikiem widocznym na poprzednim obrazie nie uległy faktycznie odwarstwieniu, a morfologia siatkówki została tutaj zachowana. Na tym pierwszym obrazie przedstawiono reprezentatywne barwienia specjalne oraz immunohistochemię przekrojów tkanki siatkówki przygotowanych zgodnie z niniejszym protokołem.Hematyna zabarwiła jądra komórkowe na niebiesko, natomiast eozyna zabarwiła cytoplazmę komórek, kolagen i tkankę podporową na różne odcienie różu. Na tym obrazie luxol fast blue zabarwił mielinę na niebiesko. Kontrastowe barwienie fioletem krystalicznym zostało wykorzystane do identyfikacji komórek zwojowych poprzez zabarwienie ciał Nissla na niebiesko oraz uwydatnienie otaczających je komórek satelitarnych. W tym przekroju traktowanym metodą Massona, roztwór kwasu karminowego zabarwił włókna mięśniowe na czerwono, podczas gdy anilinowy błękit zabarwił kolagen.W tym przypadku twardówka w tym przekroju, barwiona metodą okresowego kwasu i Schiffa (PAS), wykazuje fioletowe zabarwienie komponentów glikoproteinowych błony podstawnej oraz elementów tkanki łącznej, natomiast jądra komórkowe, podbarwione hematoksyliną, są niebieskie. Przedstawiony na obrazie przekrój podtwardówkowy został poddany barwieniu błękitem pruskim Pearla w miejscu krwawienia. Powstanie hemosyderyny z degradacji erytrocytów oraz uwalnianie kompleksów żelaza spowodowało uzyskanie fioletowego koloru.Dodatek czerwieni neutralnej zabarwił lizosomy na czerwono na tym obrazie, natomiast przeciwciała przeciwko syntetazie glutaminy zostały zabarwione na zielono. Ten enzym degradujący neuroprzekaźniki, występujący w komórkach Müllera, rozciąga się w obu kierunkach – od ciał komórek Müllera w warstwie ziarnistej wewnętrznej do wypustek końcowych komórek Müllera tworzących wewnętrzną błonę ograniczającą. Barwienie białka neurofilamentowego, tego ciężkiego łańcucha białka cytoszkieletowego, wykazano w kolorze zielonym w somie oraz wypustkach komórkowych; białko neurofilamentowe tworzy wiązania krzyżowe z innymi neurofilamentami w celu utrzymania struktury neuronów.Komórki zwojowe i ich aksony można zaobserwować w warstwie komórek zwojowych oraz warstwie włókien nerwowych, podczas gdy aksony komórek poziomych znajdujących się na zewnętrznej granicy wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kota są widoczne na zielono. Na tym końcowym obrazie przedstawiono kwasowy białko włókienka glejowe – to białko cytoszkieletowe, widoczne na czerwono, proliferuje w komórkach Müllera i astrocytach podczas gliozy i można je zauważyć wzdłuż warstwy włókien nerwowych, przy czym komórki Müllera tworzą cienkie wypustki przechodzące z wewnętrznych do zewnętrznych warstw siatkówki. Przeciwbarwienie DPI na niebiesko umożliwia wizualizację warstw siatkówki.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wizualizować przebieg pracy w trzech wymiarach i regularnie brać pod uwagę orientację próbek na każdym etapie postępowania. Po zakończeniu tej procedury można zastosować wszystkie metody histologiczne w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące bezpieczeństwa po etapie opracowania. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się rozwojem bionicznego oka do oceny długoterminowych, bezpiecznych poziomów stymulacji dla pacjentów niewidomych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać bezpieczeństwo bionicznego implantu oka.

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Techniki przetwarzania oczu z implantowanymi protezami siatkówki dla zlokalizowanej analizy histopatologicznej

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Tutaj opisujemy techniki histologiczne wizualizacji tkanki oka bezpośrednio przylegającej do metalowej protezy nasiatkówkowej i siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Naucz się techniki przetwarzania oczu z protezą siatkówki do lokalnej analizy histopatologicznej. Metoda minimalizuje artefakty utrwalania i umożliwia dokładną ocenę zdrowia tkanek przyległych do elektrod.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Przeglądaj więcej filmów