Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa oceny bezpieczeństwa protez siatkówki. Osiąga się to poprzez najpierw oznaczenie powierzchni optymalnie zamocowanego wyłuszczonego oka barwnikami tkankowymi, aby wskazać położenie wszczepionej elektrody. W drugim etapie układ elektrod jest usuwany, a tkanka oka jest preparowana na paski.

Następnie paski są stabilizowane w agarze i następnie zatapiane w parafinie. W ostatnim kroku zaznaczone obszary zainteresowania są dzielone na sekcje i zbierane na szkiełkach w celu barwienia. Ostatecznie stan zdrowia wszczepionych obszarów przylegających do każdej elektrody można ocenić za pomocą mikroskopii jasnego pola i immunofluorescencji.

Główną zaletą tej techniki jest to, że artefakty związane z fiksacją i rozwarstwienie mogą być zminimalizowane, a obszary tkanek przylegających do elektrod mogą być dokładnie śledzone w dużych próbkach. Może być również stosowany do oceny bezpieczeństwa nowych implantów w przypadku innych chorób oczu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z uzyskaniem przytomności, ponieważ siatkówka jest podatna na rozwarstwianie, a do obchodzenia się z próbkami wymagany jest wysoki poziom zręczności.

Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ znakowanie i obchodzenie się z delikatną tkanką jest trudne do nauczenia. Przed tym badaniem, po wszczepieniu implantu z układem elektrod nadnaczyniówkowych, oczy były wcześniej przetwarzane przy użyciu nieoptymalnej techniki, jak wskazuje gwiazda. Na pierwszym zdjęciu przedstawiono reprezentatywny przekrój ortogonalny przez wnękę matrycy elektrod.

Należy pamiętać, że siatkówka jest oderwana od zewnętrznej tkanki oka. Jest to szczególnie widoczne poniżej wszczepionego obszaru, jak wskazuje grot strzałki. Należy również zauważyć, że nie jest możliwe określenie, która część siatkówki przylegała do każdej pojedynczej elektrody matrycy.

W tym większym powiększeniu w warstwach siatkówki znajduje się kilka artefaktów opartych na regularnym uwalnianiu, na co wskazują groty strzał, a także duże oderwanie od warstwy torpedowej, warstwy odblaskowej w kocim oku. Po dalszym powiększeniu można zaobserwować, że zewnętrzne segmenty fotoreceptorów, a także nabłonek barwnikowy, pozostają jednak nienaruszone, co sugeruje, że wcześniej obserwowane oderwania lub sztuczne skutki uboczne przetwarzania nie wynikały z urazu lub patologii in vivo. W związku z tym wdrożono następującą technikę, aby zminimalizować artefakty związane z fiksacją i rozwarstwienie.

Po zarodkowaniu i utrwaleniu oczu zacznij od usunięcia wszczepionej gałki ocznej z etanolu i ostrożnego przycinania nadmiaru tkanki, w tym spojówki i torebki ścięgna. Przytnij nerw wzrokowy do długości od dwóch do trzech milimetrów. Układ elektrod jest widoczny przez półprzezroczystą twardówkę.

Następnie za pomocą pędzla z cienką końcówką ostrożnie nałóż barwniki histologiczne na tkankę, aby oznaczyć elektrody predefiniowanym kodem kolorystycznym. Uważając, aby nie rozmazać barwnika. Można wykonać dodatkowe znakowanie barwnikiem, aby zdefiniować interesujące miejsca lub pomóc w wyrównaniu sekcji.

W tym przypadku maksymalnie stymulowane elektrody zostały oznaczone kolorem zielonym. Pozostałe elektrody aktywne zostały oznaczone kolorem czerwonym. Elektrody powrotne o większej średnicy zostały pokolorowane na żółto, a wszelkie dodatkowe prowadnice czy oznaczenia anatomiczne zostały oznaczone niebieskim barwnikiem.

Po pięciu minutach suszenia na powietrzu przywróć kulę do 70% etanolu, aby odwodnić barwnik. Następnie, po przycięciu nadmiaru tkanki z nieobsadzonej gałki kontrolnej oka, jak właśnie pokazano, użyj ośmiu nylonowych szwów przymocowanych podczas etapu zarodkowania i fiksacji, aby wyrównać kontrolne i wszczepione oczy jako lustrzaną parę. Następnie umieść silikonowy szablon o tych samych wymiarach co matryca elektrod w lustrzanym miejscu na kontrolce I, odpowiadającym położeniu matrycy w wszczepionym oku.

Następnie oznacz kulę kontrolną tak, jak właśnie pokazano, tak aby każde miejsce implantacji elektrody miało parę kontrolną w anatomicznie porównywalnym miejscu. Następnie usuń matrycę implantów z oka, a następnie usuń przód oka, w tym rogówkę, tęczówkę i soczewkę. Następnie usuń płyn szklisty z pozostałej muszli ocznej.

Teraz przeanalizuj wszczepione oko na wiele pasków o grubości dwóch milimetrów. Każdy z nich zawiera podzbiór regionów oznaczonych matrycą. Orientacja pasków powinna być tak dobrana, aby pomóc w ocenie różnych aspektów odpowiedzi tkanek na implant, starannie udokumentować położenie oznaczeń matrycy na próbkach do wykorzystania w przyszłości.

Następnie umieść pasek stroną do przecięcia skierowaną do dołu w płytkiej kałuży upłynnionego agaru. Gdy agar stwardnieje, przeciąć próbkę i umieścić ją w kasecie na tkanki wspartej na wkładkach piankowych. Po wypreparowaniu i osadzeniu oka kontrolnego umieść kasety w neutralnej buforowanej forminie i przetwarzaj je przez noc za pomocą standardowej zautomatyzowanej 12-godzinnej techniki przetwarzania parafiny.

Następnego dnia zanurz przetworzoną tkankę w parafinie stroną do cięcia skierowaną najpierw w dół. Teraz pokrój bloki parafiny na sekcje o grubości pięciu mikronów. Następnie zamontuj sekcje z każdego z barwionych obszarów na szkiełkach.

Aby zlokalizować obszar DY, regularnie sprawdzaj szkiełka pod mikroskopem. Obszary bezpośrednio przylegające do każdego barwionego miejsca twardówki będą tymi, które znajdowały się w najbliższej odległości od odpowiedniej elektrody z matrycy. Na koniec zabejcuj sekcje według uznania.

Wysoki zakres dynamiki. Zdjęcia makro wyłuszczonego oka kota z układem elektrod nadnaczyniówkowych in situ są pokazane po utrwaleniu za pomocą utrwalacza Davidsona i przed usunięciem matrycy. Przezroczysta twardówka umożliwia wizualizację poszczególnych elektrod w układzie.

Jak wskazano grotem strzałki, elektrody są oznaczone predefiniowanym schematem kolorów barwnika. Te oznaczenia barwnika umieszczone w regularnych odstępach od anatomicznych punktów orientacyjnych są używane do utrzymania spójności między eksperymentami. Po wyjęciu matrycy elektrod oko jest ręcznie preparowane na paski próbki.

Groty strzałek wskazują dwa sąsiadujące ze sobą miejsca elektrody na twardówce. Linia przerywana wskazuje płaszczyznę przekroju w tym reprezentatywnym przekroju uzyskaną w wyniku wycięcia próbki z poprzedniego rysunku, ogólny kształt paska próbki został zachowany z minimalnymi różnicowymi artefaktami tkankowymi. Oba oznaczenia barwnika są nadal widoczne na twardówce, jak wskazują groty strzałek.

Chociaż zielony barwnik był bardziej sprężysty niż czerwony, lokalizacja barwnika wskazuje położenie elektrody. W związku z tym sąsiednia tkanka siatkówki może być oceniona pod kątem uszkodzeń, jeśli takie występują, spowodowanych stymulacją elektryczną, jak widać w tym powiększeniu, warstwy siatkówki przylegające do zielonego barwnika widocznego na poprzednim zdjęciu nie zostały faktycznie oderwane, a morfologia siatkówki została tutaj zachowana. Reprezentatywne specjalne barwienie i immunohistochemia skrawków tkanki siatkówki przetworzonych zgodnie z aktualnym protokołem są pokazane na tym pierwszym obrazie.

Hematyna zabarwiła jądra komórkowe na niebiesko, podczas gdy eoina zabarwiła cytoplazmę komórki, kolagen i tkankę podporową, różne odcienie różu Na tym zdjęciu luksusowy szybki błękit zabarwił mielinę na niebiesko. Fioletowe zabarwienie wyrostka czolistnego zostało użyte do identyfikacji komórek zwojowych poprzez zabarwienie ciał pocisków w kolorze niebieskim i podświetlenie otaczających komórek satelitarnych. W tej sekcji murarskiej potraktowanej na niebiesko trionem, roztwór fuzji szkarłatnego kwasu BRIC zabarwił włókna mięśniowe na czerwono, podczas gdy niebieski lin zabarwił kolagen.

W tym przypadku niebieska twardówka dla tego odcinka wybarwionego kwasem okresowym shiff składniki glikoproteinowe błony podstawnej i składniki tkanki łącznej wydają się fioletowe, podczas gdy jądra komórek hemat toin przeciwbarwiących wydają się niebieskie. Przekrój podtwardówkowy pokazany na tym zdjęciu został potraktowany perłowym błękitem pruskim w miejscu krwotoku. Tworzenie hemosyderyny ze zdegradowanych czerwonych krwinek i uwalnianie kompleksów żelaza powodowało fioletowy kolor.

Dodatek neutralnej czerwieni zabarwił lizosomy na czerwono na tym obrazie, antyglutamina Synthes została zabarwiona. Ten enzym rozkładający neuroprzekaźniki znajdujący się w komórkach Muellera na zielono rozciąga się w obu kierunkach z ciałami komórek Muellera w wewnętrznej warstwie jądrowej i kanałem końcowym komórki Muellera, tworząc wewnętrzną błonę ograniczającą do barwienia białka neurofilamentu. To białko cytoszkieletu o ciężkim łańcuchu zostało oznaczone jako zielone znalezione w somie komórkowej i przetwarza wiązania krzyżowe białka neurofilamentu z innymi neurofilamentami w celu utrzymania struktury neuronów.

Komórki zwojowe i ich aksony można zaobserwować w warstwach komórek zwojowych i włókien nerwowych, podczas gdy aksony komórek poziomych znajdujących się na zewnętrznej granicy wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kotów wydają się zielone. Na tym ostatnim obrazie pokazano kwaśne białko fibrylarne gleju to białko cytoszkieletu w kolorze czerwonym, proliferuje w komórkach Muellera i astrocytach podczas glejozy i można zobaczyć wyściełanie warstwy włókien nerwowych komórkami Muellera tworzącymi cienkie przedłużenia przez wewnętrzną do zewnętrznej warstwy siatkówki. Przeciwbarwienie z DPI w kolorze niebieskim pozwala na wizualizację warstw siatkówki.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wizualizacji przepływu pracy próbki w trzech wymiarach i regularnym uwzględnianiu orientacji próbek w trakcie całej procedury. Po tej procedurze można zastosować wszystkie metody histologiczne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z bezpieczeństwem po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem bionicznego oka do długoterminowej oceny bezpiecznych poziomów stymulacji dla pacjentów niewidomych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić bezpieczeństwo bionicznego implantu oka.