Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak to, gdzie ludzkie komórki macierzyste mieszków zębowych mogą być genetycznie modyfikowane w celu poprawy ich właściwości terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki macierzyste mogą być modyfikowane przez wprowadzenie mikroRNA bez ryzyka stabilnej integracji genomu. Rozpocznij procedurę enzymatycznego trawienia dwóch pęcherzyków, poprzez wstępne podgrzanie do temperatury pokojowej, ludzkiej komórki macierzystej pęcherzyków zębowych lub pożywki hodowlanej hDFSC i roztworu PBSPSG.

Rozmrozić po jednej porcji roztworów podstawowych kolagenazy typu I i dyspazy II. Przygotować roztwór wytrawiający, dodając 500 mikrolitrów roztworu podstawowego kolagenazy typu I i 500 mikrolitrów roztworu podstawowego Dispase II do 4 mililitrów podłoża podstawowego zawierającego 1% antybiotyk. Aby uniknąć zanieczyszczenia miejsca podczas izolacji ludzkich komórek macierzystych mieszków zębowych, stosowane płuczące i pożywki hodowlane muszą zawierać antybiotyki.

Umieść usunięty mieszek włosowy na sterylnej szalce Petriego. Dodaj 10 mililitrów roztworu PBSPSG, aby przemyć wyekstrahowaną tkankę. Odessać i wyrzucić roztwór, a następnie dodać świeży roztwór PBSPSG, aby powtórzyć pranie.

Za pomocą sterylnego skalpela zmiel wyekstrahowany mieszek włosowy na kawałki, jeśli ma około 1 na 1 milimetr. Przenieść tkankę mieloną i roztwór PBSPSG z szalki Petriego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, umyć szalkę Petriego 10 mililitrami roztworu PBSPSG i przenieść roztwór do tej samej probówki. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 353 x g w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Dodaj 5 mililitrów roztworu wytrawiającego do paletyzowanej tkanki, delikatnie wymieszaj roztwór i tkankę, inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w inkubatorze wstrząsającym przez dwie godziny. Po dwóch godzinach odwirować strawioną zawiesinę komórek i tkanek o masie 353 g przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymaną paletę w 6 mililitrach pożywki hodowlanej HDFSC.

Wysiewaj zawiesinę komórkową w kolbie do hodowli komórek o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pobraniu komórek i scharakterystyce HDFSC jest opisana w protokole tekstowym, wysiewaj hDFSC na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 20% tlenu przez 24 godziny.

Następnego dnia rozcieńczyć 40 pikomoli mikroRNA w 66,7 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i zawirować roztwór. Rozcieńczyć 0,67 mikrolitra odczynnika do transfekcji na bazie kationowych lipidów w 66,7 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy, zawirować roztwór i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach dodać wstępnie rozcieńczone mikroRNA do wstępnie rozcieńczonego odczynnika do transfekcji, wymieszać roztwór i inkubować w temperaturze pokojowej przez piętnaście minut.

Następnie dodaj przygotowane złożoność transfekcji, kroplami, bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach. Delikatnie wymieszaj, kołysząc 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej w przód iw tył. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

24 godziny po transfekcji zebrać supernatant próbek do odpowiednich stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Umyj komórki 1 mililitrem PBS i przenieś PBS do odpowiedniej probówki wirówkowej. Dodaj 500 mikrolitrów kroplówek i EDTA do komórek i inkubuj 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3 minuty.

Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 mililitr pożywki do hodowli komórkowych dla komórek i przenosząc roztwór do odpowiedniej probówki wirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g i 4 stopnie Celsjusza przez dziesięć minut. Od tego momentu utrzymuj komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego i przenieść roztwór komórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 0,5 mililitra barwnika reagującego z aminami do każdej próbki, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dziesięć minut.

Dodaj 1 mililitr PBS do komórek i odwiruj w temperaturze 300 g i 4 stopni Celsjusza przez dziesięć minut Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS, dodaj 33 mikrolitry paraformaldehydu i wymieszaj roztwory, przechowuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza chronione przed światłem do pomiarów cytometrii przepływowej. Przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej i przeprowadzić cytometrię przepływową przy użyciu strategii bramkowania opisanej w protokole tekstowym. Wyizolowane ludzkie komórki macierzyste pęcherzyków zębowych wykazywały wszystkie cechy opisane w definicji mezenchymalnych komórek zrębu, komórki przylegały do tworzywa sztucznego i wykazywały morfologię podobną do włókna szklanego w standardowych warunkach hodowli.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że hDFSC wyrażały panel niektórych antygenów powierzchniowych, w tym CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105. Podczas gdy CD45 i CD117 były nieobecne. Adipogenne, osteogenne i chondrogenne potencjały różnicowania komórek w określonych warunkach hodowli in vitro potwierdzono za pomocą barwienia immunologicznego, białka wiążącego kwasy tłuszczowe dla: osteokalcyny i agrekanu.

Strategia bramkowania zastosowana do ilościowego określenia cytotoksyczności i skuteczności wychwytu mikroRNA znakowanej Cy3 24 godziny po transfekcji potwierdziła wychwyt mikroRNA w 100% żywotnych komórek. Porównywalne ilości martwych komórek w próbkach transfekowanych i nietransfekowanych wskazują, że mikroRNA jest skutecznie wprowadzane bez efektów cytotoksycznych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak transdyferencjacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak plastyczność Cytolab.