Name: Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę izolacji i modyfikacji genetycznej ludzkich komórek pęcherzyków zębowych przy użyciu mikroRNA. Technika ta umożliwia bezpieczną, przejściową modyfikację komórek macierzystych bez ryzyka trwałej integracji genomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889018) oraz Fundację DAMP (2016-11). Ponadto P.M. i R.D. są wspierane przez BMBF (VIP+ 00240).

HDFSC są izolowane z mieszków włosowych usuniętych zębów mądrości dostarczonych przez Oddział Chirurgii Plastycznej Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku. Uzyskano świadomą zgodę i pisemną zgodę od wszystkich pacjentów. Badanie to zostało autoryzowane przez lokalną komisję etyczną Uniwersytetu w Rostocku (zezwolenie nr A 2017-0158).
1. Izolacja hDFSC
UWAGA: Aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, zęby mądrości nie powinny być wyrzynane przed ekstrakcją
<ol>
	<li>Przygotowanie wymaganych rozwiązań
	<ol>
		<li>Przygotować buforowany fosforanami roztwór soli fizjologicznej (PBS)/penicyliny-streptomycyny-glutaminy (P-S-G): zmieszać 495 ml PBS z 5 ml roztworu PSG. Przechowywać podwielokrotności po 50 ml w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną hDFSC: wymieszać 445 ml podłoża podstawowego z 5 ml antybiotyku i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy typu I (30 mg/ml): rozcieńczyć 300 mg kolagenazy typu I w 10 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 1% antybiotykiem. Energicznie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać podwielokrotności 500 μl roztworu podstawowego kolagenazy typu I w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy Dispazy II (40 mg/ml): rozcieńczyć 40 mg Dispazy II w 10 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 1% antybiotykiem. Energicznie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać podwielokrotności 500 μl roztworu podstawowego Dispase II w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabiegu chirurgicznego
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć odpowiednią ilość (maksymalnie: 2 ml) środka znieczulającego miejscowo.</li>
		<li>Utwórz i podnieś trójstronny płat śluzówkowo-okostnowy. Podnoszenie klapki językowej nie jest wymagane.</li>
		<li>Chroń aspekt językowy za pomocą windy okostnej.</li>
		<li>Delikatnie zmiel kość policzkową i dystalną za pomocą okrągłego zadzioru z twardego metalu.</li>
		<li>Poluzuj tkankę mieszków włosowych za pomocą windy okostnej. Ostrożnie usuń cały ząb (zarodek) i mieszek włosowy, wyciągając koronę (i mieszek) za pomocą kleszczyków tylnych (trzecich trzonowców).</li>
		<li>Oczyścić i dokładnie przepłukać gniazdo roztworem NaCl.</li>
		<li>Zastąp płat śluzówkowo-okostnowy szwami vicryl (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Usunąć mieszek włosowy z jamy ustnej i umieścić go w porcji 50 ml roztworu PBS/P-S-G. 
		UWAGA: Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie enzymatyczne mieszka włosowego
	<ol>
		<li>Wstępnie ogrzej pożywkę hodowlaną hDFSC i roztwór PBS/P-S-G do temperatury pokojowej (RT).</li>
		<li>Rozmrozić po jednej porcji każdego roztworu podstawowego kolagenazy typu I i dyspazy II. Przygotować roztwór wytrawiający składający się z 3 mg/ml kolagenazy typu I i 4 mg/ml dypazy II, dodając po 500 μl każdego roztworu podstawowego kolagenazy typu I i dypazy II do 4 ml podłoża podstawowego zawierającego 1% antybiotyku.</li>
		<li>Umieść wyekstrahowany pęcherzyk na sterylnej szalce Petriego i dodaj 10 ml roztworu PBS/P-S-G, aby przemyć wyekstrahowaną tkankę. Powtórz ten krok prania dwa razy.</li>
		<li>Wyekstrahowany pęcherzyk należy rozdrobnić na kawałki o wymiarach około 1 mm x 1 mm za pomocą sterylnego skalpela na szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu PBS/P-S-G.</li>
		<li>Przenieść tkankę mieloną i roztwór PBS/P-S-G z płytki Petriego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyć szalkę Petriego 10 ml roztworu PBS/P-S-G i przenieść roztwór do tej samej probówki.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę wirówkową przez 10 minut przy 353 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu trawiącego do granulowanej tkanki. Delikatnie wymieszaj roztwór i tkankę. Mieszaninę inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
		<li>Odwirować przetrawioną zawiesinę komórek/tkanek o stężeniu 353 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymany osad w 6 ml pożywki hodowlanej hDFSC.</li>
		<li>Zawiesina komórek nasiennych w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 20% O2, 
		UWAGA: Jeśli tkanka nie jest całkowicie strawiona, należy również przenieść pozostałą tkankę do kolby do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Ostrożnie zmień podłoże 24 godziny po wysianiu komórek. Następnie zmieniaj podłoże co trzy dni, aż do zbiegu. 
		UWAGA: HDFSC powinny przylegać do tworzywa sztucznego 24 godziny po wysiewie komórek i można je oddzielić od nieprzylegających komórek i składników krwi poprzez prostą zmianę podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek
	<ol>
		<li>Wstępnie ogrzej pożywkę hodowlaną hDFSC, roztwór PBS/P-S-G i roztwór trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do RT.</li>
		<li>Odrzucić supernatant z kolby hodowlanej i przemyć zlejące się komórki 5 ml roztworu PBS/P-S-G.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny/EDTA do kolby hodowlanej i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać proces trawienia, dodając 3 ml pożywki hodowlanej hDFSC do kolby hodowlanej.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę przez 10 minut przy 353 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej ilości pożywki hodowlanej hDFSC.</li>
		<li>Policz komórki: delikatnie wymieszaj 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Nanieść 10 μl do komory liczącej i obliczyć ilość komórek hDFSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka hDFSC
<ol>
	<li>Immunofenotypowanie
	<ol>
		<li>Przygotowanie komórek do analizy cytometrii przepływowej
		<ol>
			<li>Przygotowanie wymaganych rozwiązań
			<ol>
				<li>Przygotować PBS/EDTA (2 mM): zmieszać 996 ml PBS z 4 ml EDTA (0,5 M).</li>
				<li>Przygotować bufor do barwienia: zmieszać 995 ml PBS/EDTA (2 mM) z 5 g BSA. Przefiltrować roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
				<li>Przygotować roztwór podstawowy paraformaldehydu (PFA) (4%): rozcieńczyć 4 g PFA w 100 ml PBS i podgrzać roztwór do 80 °C. Wymieszać roztwór i dostosować wartość pH do 7,3. Podwielokrotność roztworu PFA w odpowiednich ilościach (1,5 ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
				UWAGA: Ponieważ opary PFA są toksyczne, przygotuj roztwór PFA w wentylowanym dygestorium.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Po pobraniu komórek (1.4) przenieść 14 próbek z 5 x 104 komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawiesiny o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
			UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Przechowuj komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
			<li>Ponownie zawiesić komórki w pewnych ilościach buforu barwiącego (4 °C) i dodać odczynnik blokujący FcR (4 °C), jak wskazano w Tabeli 1.</li>
			<li>Dodać następujące przeciwciała na wewnętrznej stronie odpowiedniej próbki, jak wskazano w tabeli 1: allofikocyjanina (APC) mysia anty-ludzka CD29; Kontrola izotypu IgG1 κ myszy APC; Białko perydyninowo-chlorofilowe (PerCP)-cyjanina5,5 mysia anty-ludzka CD44; PerCP-Cyjanina5,5 kontrola izotypu IgG2b κ myszy; Mysz V500 anty-ludzka CD45; Mysza kontrola izotypu IgG1 κ V500; Mysza fikoerytryna (PE) anty-ludzka CD73; kontrola izotypu myszy PE IgG1 κ; PerCP-cyjanina5,5 mysz anty-ludzka CD90; PerCP-Cyjanina5,5 kontrola izotypu mysiego IgG1 κ; mysz anty-ludzka CD105: Alexa Fluor (AF)488; mysia kontrola ujemna IgG1: AF488; PE-cyjaninina 7 mysi anty-ludzka CD117; PE-cyjaninina 7 mysia IgG1, kontrola izotypu κ. Po dodaniu przeciwciał do każdej próbki odkręć przeciwciała i delikatnie wymieszaj. Inkubować roztwory przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Dodać 1 ml PBS (4 °C) i odwirować próbki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
			<li>Ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS (4 °C) i dodaj 33 μl PFA (4%). Wymieszać roztwory i przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pomiar metodą cytometrii przepływowej komórek 
		UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Trzymaj komórki na lodzie do czasu pomiaru.
		<ol>
			<li>Aby zbadać ekspresję antygenów powierzchniowych, należy przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej.</li>
			<li>Zmierz co najmniej 2 x 104 zdarzenia za pomocą cytometru przepływowego. Przeanalizuj tak, jak pokazano w Rysunek 2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Multipotencjalny potencjał różnicowania hDFSC
	<ol>
		<li>Użyj dostępnego na rynku zestawu do identyfikacji funkcjonalnej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, aby potwierdzić potencjał różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego hDFSC. Zastosować drugorzędowe przeciwciało anty-kozie AF488 do barwienia białka wiążącego kwasy tłuszczowe 4 (FABP4) i agrekanu, a także przeciwciało drugorzędowe AF488 przeciwko osłom do barwienia osteokalcyny. Do barwienia jąder należy użyć podłoża montażowego z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). 
		UWAGA: Przygotować próbki bez przeciwciał pierwszorzędowych jako kontrole ujemne do analiz mikroskopowych.</li>
		<li>Analiza ekspresji białek za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Ustawienia mikroskopii: obiektyw 40x z zanurzeniem w olejku; laser wzbudzający 488 nm (dla AF488) i 405 nm (dla DAPI).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transfekcja hDFSC
<ol>
	<li>Po pobraniu komórek (1.4) wysiać hDFSC na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej na 24 godziny przed transfekcją. 
	UWAGA: Początkowa gęstość komórek wynosi około 4 x 104 komórek na studzienkę. Komórki powinny osiągnąć ~80% konfluencji w dniu transfekcji. 
	Uwaga: Zasiej jedną dodatkową próbkę komórkową jako kontrolę do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przygotowanie kompleksów transfekcyjnych 
	UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami, należy oczyścić przestrzeń roboczą bezpośrednio przed przygotowaniem kompleksów transfekcyjnych za pomocą roztworu do dekontaminacji RNazy. Używaj wyłącznie materiałów i roztworów wolnych od RNaz. 
	UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy miR (50 μM): ponownie zawiesić miR (5 nmol) znakowany Cy3 w 100 μl wody wolnej od nukleaz. Podwielokrotność roztworu podstawowego miR w odpowiednich ilościach (5 μl) i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Rozcieńczyć 40 pmol miR (0,8 μl 50 μM roztworu podstawowego miR) w 66,7 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj roztwór</li>
		<li>Rozcieńczyć 0,67 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów kationowych w 66,7 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po inkubacji dodać wstępnie rozcieńczony odczynnik do transfekcji do wstępnie rozcieńczonego miR. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowane kompleksy transfekcyjne dodawać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach. Delikatnie wymieszaj, kołysząc 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej w przód iw tył.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 20%O2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Analiza transfekcji
UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu.
<ol>
	<li>Pobieranie komórek po transfekcji 
	UWAGA: Zebrać wszystkie roztwory komórkowe jednej próbki w tej samej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
	<ol>
		<li>24 godziny po transfekcji zebrać sklarowany sklarent próbek do odpowiednich probówek wirówkowych.</li>
		<li>Umyj komórki 1 ml PBS, przenieś PBS do odpowiedniej probówki wirówkowej i dodaj 500 μl trypsyny/EDTA (RT) do komórek. Inkubować roztwory przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 ml pożywki hodowlanej (RT) do komórek i przenieś roztwór do odpowiedniej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Od tego czasu należy przechowywać komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek do analizy cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego (4 °C) i przenieść roztwór komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 0,5 μl barwnika reagującego z aminami do próbek, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS (4 °C) do komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS (4 °C) i dodaj 33 μl PFA (4%). Wymieszać roztwory i przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar metodą cytometrii przepływowej komórek 
	UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Trzymaj komórki na lodzie do czasu pomiaru.
	<ol>
		<li>Przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Zbadaj żywotność komórek i wydajność wychwytu miR za pomocą cytometru przepływowego. Zmierz co najmniej 2 x 104 zdarzenia. Użyj strategii bramkowania przedstawionej w Rysunek 4. 
		UWAGA: Użyj nietransfekowanych komórek jako kontroli negatywnej, aby zorganizować bramkowanie dla komórek Cy3-dodatnich i obliczyć śmierć komórki spowodowaną transfekcją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dorosłe komórki macierzyste są obecnie wykorzystywane w leczeniu kilku chorób zwyrodnieniowych. W szczególności komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (BM), w tym hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) i MSC, są przedmiotem intensywnych badań klinicznych47. Jednak pobieranie BM jest zabiegiem inwazyjnym, powodującym ból w miejscu pobrania i może prowadzić do zdarzeń niepożądanych48. Ostatnio tkanka zęba po urodzeniu stała się nowym i łatwo dostępnym źródłem ko...

Ludzki pęcherzyk zębowy to luźna tkanka łączna pochodząca z ektomezenchymalnej tkanki otaczającej rozwijający się ząb1,2. Oprócz funkcji koordynowania osteoklastogenezy i osteogenezy w procesie wyrzynania się zębów, tkanka ta zawiera komórki macierzyste i progenitorowe, szczególnie dla rozwoju przyzębia3,4,5. Dlatego mieszek włosowy jest uważany za alternatywne źródło pozyskiwania ludzkich dorosłych komórek macierzystych6,7.
Kilka badań wykazało, że ludzkie komórki macierzyste pęcherzyków zębowych (hDFSC) są zdolne do różnicowania się w linię przyzębia, w tym osteoblasty, fibroblasty więzadeł i cementoblasty8,9,10. Ponadto wykazano, że komórki te spełniają wszystkie cechy mezenchymalnych komórek zrębu (MSC), w tym zdolność do samoodnawiania, przyleganie do tworzywa sztucznego, ekspresję specyficznych markerów powierzchniowych (np. CD73, CD90, CD105), a także potencjał różnicowania kościogennego, adipogennego i chondrogennego11,12,13. Inne badania wykazały również potencjał różnicowania neuronalnego hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Ze względu na ich obiecujące właściwości i łatwy dostęp, hDFSC stały się ostatnio istotne dla inżynierii tkankowej19,20,21. Pierwsze badania koncentrowały się na potencjale DFSC do regeneracji korzeni kostnych, przyzębia i zębów19,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Od czasu poznania zdolności neurogennych hDFSC, zbadano ich zastosowanie jako potencjalnego leczenia chorób neurodegeneracyjnych31,32,33. HDFSC zyskały również na znaczeniu w odniesieniu do regeneracji innych tkanek (np. nabłonka rogówki)34,35. Potencjał terapeutyczny hDFSC opiera się nie tylko na ich bezpośrednim potencjale różnicowania, ale także na ich aktywności parakrynnej. Ostatnio wykazano, że hDFSC wydzielają wiele czynników bioaktywnych, takich jak metaloproteinazy macierzy (MMP), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), które odgrywają kluczową rolę w angiogenezie, immunomodulacji, przebudowie macierzy pozakomórkowej i procesach naprawczych36.
Jednak szerokie kliniczne tłumaczenie terapii komórkami macierzystymi jest nadal utrudnione przez kilka wyzwań, takich jak masowa początkowa śmierć komórek i niskie korzystne efekty komórek macierzystych37,38. Inżynieria genetyczna stanowi obiecującą strategię radzenia sobie z tymi wyzwaniami, a zatem może znacznie zwiększyć skuteczność terapeutyczną komórek macierzystych38,39,40. Do przejściowej manipulacji komórkami odpowiednie są mikroRNA (miR), ponieważ te małe regulatory translacyjne kontrolują los i zachowanie komórek macierzystych bez ryzyka stabilnej integracji genomu41,42,43. Do tej pory zidentyfikowano kilka korzystnych miR promujących proliferację komórek macierzystych, przeżycie, naprowadzanie, aktywność parakrynną, a także ich różnicowanie w kilka linii44. Na przykład, zmodyfikowane przez miR-133a MSCs wykazały zwiększoną przeżywalność i wszczepienie w serca szczurów z zawałem, co skutkowało poprawą funkcji serca w porównaniu z niezmodyfikowanymi MSCs45. Podobnie, wykazano, że MSCs z nadekspresją miR-146a wydzielają większe ilości VEGF, co z kolei doprowadziło do zwiększonej skuteczności terapeutycznej w tkance niedokrwiennej46.
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół selektywnej ekstrakcji i inżynierii genetycznej hDFSC. W tym celu opisaliśmy zbieranie i trawienie enzymatyczne ludzkich mieszków zębowych, a także późniejszą izolację hDFSC. W celu scharakteryzowania izolowanych komórek dołączono ważne instrukcje dotyczące weryfikacji właściwości MSC zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej13. Ponadto przedstawiamy szczegółowy opis wytwarzania hDFSC modyfikowanych miR, stosując strategię transfekcji opartej na kationowych lipidach oraz ocenę skuteczności transfekcji i cytotoksyczności.

<table><tbody><tr><td>Mysie przeciwciało anty ludzkie CD105: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało kontroli ujemnej IgG1: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało antyludzkie CD29 APC</td><td></td><td>559883</td><td>klon MAR4, monoklonalne</td></tr><tr><td>APC Mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Klon MOPC-21, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało antyludzkie CD73</td><td>PE BD Biosciences</td><td>550257</td><td>klon AD2, monoklonalne</td></tr><tr><td>PE mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>klon MOPC-21, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-ludzkie PE-Cy7 CD117</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>klon 104D2, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało PE-Cy7 IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>klon MOPC-21, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-ludzkie PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>klon G44-26, monoklonalne</td></tr><tr><td>Mysz PerCP-Cy5.5 IgG2b, &kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>klon 27-35, monoklonalny</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mysz anty-ludzka CD90&nbsp; Przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>klon 5E10, monoklonalny</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mysia IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Klon MOPC-21, monoklonalne</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-ludzkie V500 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>Klon HI30, monoklonalny</td></tr><tr><td>V500 Mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Clone X40, monoklonalny</td></tr><tr><td>odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0,5M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0,22 i mikro; m, sterylizowany radiologicznie, polieterosulfon</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do identyfikacji funkcjonalnej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNazy; RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Prekursor miR znakowany Cy3; Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola ujemna Pre-miR #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR prekursor miRNA kontrola ujemna #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Kationowy odczynnik do transfekcji na bazie lipidów; Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka surowicy; Opti-MEM I Obniżona pożywka surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko koziej IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>poliklonalne</td></tr><tr><td>podłoże montażowe; Fluoroshield z</td><td>podłożem montażowym</td>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td> do histologii</tr> mikroskop <tr><td>konfokalny ELYRA PS.1 LSM 780</td><td>Cytometr przepływowy Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr> BD <tr><td>FACSDiva Oprogramowanie 6.1.2</td><td>Oprogramowanie ZEN2011 BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> Roztwór trypsyny/EDTA <tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0,05%/ 0,02%)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>w PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Barwnik reaktywny aminy; ŻYWY/MARTWY&handel; Zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7,4; w/o: Ca i Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe; Dulbecco's Modified Eagle Podłoże i Mieszanka Składników Odżywczych F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filtr, filtr strzykawkowy Sterifix 0,2 i mikro; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; stożkowa probówka wirówkowa w ml</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,002</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże zamrażające, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1,8 ml</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie miejscowe, Ksylozytyna (chlorowodorek lidokainy) 2% z epinefryną (adrenalina) 0,001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór NaCl</td><td>Braun</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl nasycone, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikrorna

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Do tej pory, kilka typów komórek macierzystych na różnych etapach rozwoju jest w centrum uwagi w leczeniu chorób zwyrodnieniowych. Jednak niektóre aspekty, takie jak początkowa masowa śmierć komórek i słabe efekty terapeutyczne, upośledzały ich szerokie zastosowanie kliniczne. Inżynieria genetyczna komórek macierzystych przed przeszczepem okazała się obiecującą metodą optymalizacji terapeutycznych efektów działania komórek macierzystych. Wciąż jednak brakuje bezpiecznych i wydajnych systemów dostarczania genów. W związku z tym opracowanie odpowiednich metod może zapewnić podejście do rozwiązania obecnych wyzwań w terapiach opartych na komórkach macierzystych.
Obecny protokół opisuje ekstrakcję i charakterystykę ludzkich komórek macierzystych pęcherzyków zębowych (hDFSC), jak również ich niewirusową modyfikację genetyczną. Pourodzeniowy pęcherzyk zębowy jawi się jako obiecujące i łatwo dostępne źródło pozyskiwania dorosłych multipotencjalnych komórek macierzystych o wysokim potencjale proliferacji. Opisana procedura izolacji przedstawia prostą i niezawodną metodę pobierania hDFSC z zatrzymanych zębów mądrości. Protokół ten zawiera również metody określania charakterystyki komórek macierzystych izolowanych komórek. Na potrzeby inżynierii genetycznej hDFSC przedstawiono zoptymalizowaną strategię transfekcji opartej na kationowych lipidach, która umożliwia wysoce efektywne wprowadzanie mikroRNA bez powodowania efektów cytotoksycznych. MikroRNA są odpowiednimi kandydatami do przejściowej manipulacji komórkami, ponieważ te małe regulatory translacyjne kontrolują los i zachowanie komórek macierzystych bez ryzyka stabilnej integracji genomu. W związku z tym protokół ten stanowi bezpieczną i wydajną procedurę inżynierii hDFSC, która może stać się ważna dla optymalizacji ich skuteczności terapeutycznej.

W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółową instrukcję izolacji w celu pozyskania hDFSCs z ludzkiej tkanki mieszkowej zęba. Dzięki łatwemu dostępowi do mieszka zębowego podczas rutynowych zabiegów chirurgicznych, stanowi on obiecujące źródło ekstrakcji dorosłych komórek macierzystych.
Izolowane hDFSCs wykazały wszystkie cechy opisane w definicji MSCs13. W rzeczywistości komórki przylegały do tworzywa...

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak to, gdzie ludzkie komórki macierzyste mieszków zębowych mogą być genetycznie modyfikowane w celu poprawy ich właściwości terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki macierzyste mogą być modyfikowane przez wprowadzenie mikroRNA bez ryzyka stabilnej integracji genomu. Rozpocznij procedurę enzymatycznego trawienia dwóch pęcherzyków, poprzez wstępne podgrzanie do temperatury pokojowej, ludzkiej komórki macierzystej pęcherzyków zębowych lub pożywki hodowlanej hDFSC i roztworu PBSPSG.Rozmrozić po jednej porcji roztworów podstawowych kolagenazy typu I i dyspazy II. Przygotować roztwór wytrawiający, dodając 500 mikrolitrów roztworu podstawowego kolagenazy typu I i 500 mikrolitrów roztworu podstawowego Dispase II do 4 mililitrów podłoża podstawowego zawierającego 1% antybiotyk. Aby uniknąć zanieczyszczenia miejsca podczas izolacji ludzkich komórek macierzystych mieszków zębowych, stosowane płuczące i pożywki hodowlane muszą zawierać antybiotyki.Umieść usunięty mieszek włosowy na sterylnej szalce Petriego. Dodaj 10 mililitrów roztworu PBSPSG, aby przemyć wyekstrahowaną tkankę. Odessać i wyrzucić roztwór, a następnie dodać świeży roztwór PBSPSG, aby powtórzyć pranie.Za pomocą sterylnego skalpela zmiel wyekstrahowany mieszek włosowy na kawałki, jeśli ma około 1 na 1 milimetr. Przenieść tkankę mieloną i roztwór PBSPSG z szalki Petriego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, umyć szalkę Petriego 10 mililitrami roztworu PBSPSG i przenieść roztwór do tej samej probówki. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 353 x g w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.Dodaj 5 mililitrów roztworu wytrawiającego do paletyzowanej tkanki, delikatnie wymieszaj roztwór i tkankę, inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w inkubatorze wstrząsającym przez dwie godziny. Po dwóch godzinach odwirować strawioną zawiesinę komórek i tkanek o masie 353 g przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymaną paletę w 6 mililitrach pożywki hodowlanej HDFSC.Wysiewaj zawiesinę komórkową w kolbie do hodowli komórek o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pobraniu komórek i scharakterystyce HDFSC jest opisana w protokole tekstowym, wysiewaj hDFSC na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 20% tlenu przez 24 godziny.Następnego dnia rozcieńczyć 40 pikomoli mikroRNA w 66,7 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i zawirować roztwór. Rozcieńczyć 0,67 mikrolitra odczynnika do transfekcji na bazie kationowych lipidów w 66,7 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy, zawirować roztwór i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach dodać wstępnie rozcieńczone mikroRNA do wstępnie rozcieńczonego odczynnika do transfekcji, wymieszać roztwór i inkubować w temperaturze pokojowej przez piętnaście minut.Następnie dodaj przygotowane złożoność transfekcji, kroplami, bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach. Delikatnie wymieszaj, kołysząc 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej w przód iw tył. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.24 godziny po transfekcji zebrać supernatant próbek do odpowiednich stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Umyj komórki 1 mililitrem PBS i przenieś PBS do odpowiedniej probówki wirówkowej. Dodaj 500 mikrolitrów kroplówek i EDTA do komórek i inkubuj 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3 minuty.Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 mililitr pożywki do hodowli komórkowych dla komórek i przenosząc roztwór do odpowiedniej probówki wirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g i 4 stopnie Celsjusza przez dziesięć minut. Od tego momentu utrzymuj komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego i przenieść roztwór komórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 0,5 mililitra barwnika reagującego z aminami do każdej próbki, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dziesięć minut.Dodaj 1 mililitr PBS do komórek i odwiruj w temperaturze 300 g i 4 stopni Celsjusza przez dziesięć minut Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS, dodaj 33 mikrolitry paraformaldehydu i wymieszaj roztwory, przechowuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza chronione przed światłem do pomiarów cytometrii przepływowej. Przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej i przeprowadzić cytometrię przepływową przy użyciu strategii bramkowania opisanej w protokole tekstowym. Wyizolowane ludzkie komórki macierzyste pęcherzyków zębowych wykazywały wszystkie cechy opisane w definicji mezenchymalnych komórek zrębu, komórki przylegały do tworzywa sztucznego i wykazywały morfologię podobną do włókna szklanego w standardowych warunkach hodowli.Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że hDFSC wyrażały panel niektórych antygenów powierzchniowych, w tym CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105. Podczas gdy CD45 i CD117 były nieobecne. Adipogenne, osteogenne i chondrogenne potencjały różnicowania komórek w określonych warunkach hodowli in vitro potwierdzono za pomocą barwienia immunologicznego, białka wiążącego kwasy tłuszczowe dla: osteokalcyny i agrekanu.Strategia bramkowania zastosowana do ilościowego określenia cytotoksyczności i skuteczności wychwytu mikroRNA znakowanej Cy3 24 godziny po transfekcji potwierdziła wychwyt mikroRNA w 100% żywotnych komórek. Porównywalne ilości martwych komórek w próbkach transfekowanych i nietransfekowanych wskazują, że mikroRNA jest skutecznie wprowadzane bez efektów cytotoksycznych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak transdyferencjacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak plastyczność Cytolab.

isolation-characterization-microrna-based-genetic-modification-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Mieszek włosowy zawiera populację nabłonków i komórki mezenchymalne. Populację nabłonka wybrano z niejednorodnej populacji komórek pęcherzyków zębowych poprzez zapewnienie odrębnej pożywki hodowlanej. Komórki nabłonkowe przetrwały i utworzyły kolonie w podłożu wolnym od surowicy.

Izolacja komórek nabłonkowych z ludzkiego pęcherzyka zębowego

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Poznaj metodę izolacji i modyfikacji genetycznej ludzkich komórek pęcherzyków zębowych przy użyciu mikroRNA. Technika ta umożliwia bezpieczną, przejściową modyfikację komórek macierzystych bez ryzyka trwałej integracji genomowej.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów