Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Po raz pierwszy opisujemy tutaj metodę, która pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków pod kątem związków senoterapeutycznych, które okazały się korzystne w chorobach związanych ze starzeniem się. W rzeczywistości obecnie toczy się kilka badań klinicznych z lekami testowanymi w tej istocie. Główną zaletą tej techniki jest rozróżnienie dwóch rodzajów leków senoterapeutycznych, senolityków i senomorfików, poprzez zastosowanie dobrze ugruntowanego wykrywania SA-beta-galaktozydazy w komórkach starczych.

Technika ta jest ważnym narzędziem przesiewowym dla nowych związków senoterapeutycznych. W rzeczywistości kilka związków, które zostały zidentyfikowane za pomocą tego ekranu, jest opisywanych w różnych głośnych publikacjach i są obecnie w fazie badań klinicznych. Technika ta jest niezwykle wszechstronna i może być dostosowana do kilku sit o wysokiej przepustowości.

W rzeczywistości możliwe jest multipleksowanie badań przesiewowych i badanie przesiewowe w poszukiwaniu związków, które hamują starzenie się poprzez aktywację lub hamowanie jednego z kilku szlaków. Zmiel każdy zarodek na jednomilimetrowe kawałki i kilkakrotnie przeciskaj go w górę iw dół. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki wzrostowej do tkanek każdego zarodka.

Umieść je w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 3% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni. I inkubuj resztę każdego zarodka z mieszaniną 0,25% trypsyny EDTA przez 10 minut. Aby wytrypsynizować komórki, najpierw ostrożnie usuń pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyj komórki 10 mililitrami 1X PBS.

Następnie dodaj dwa mililitry roztworu 025 trypsyny EDTA do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut. Następnie sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są oderwane od powierzchni. Dodaj taką samą ilość pożywki wzrostowej, aby zakończyć trawienie trypsyny i przenieś komórki do stożkowej rurki.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odrzuć supernatant i dodaj świeżą pożywkę wzrostową, aby ponownie zawiesić komórki. Następnie policz komórki i umieść je na nowych płytkach przy przewidywanej gęstości komórek.

W przypadku subuprawy niestarzejącej się, najpierw należy podzielić zlewające się komórki w stosunku jeden do czterech. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 3% tlenu i 5% dwutlenku węgla, aby przedłużyć się do kolejnego przejścia. Następnie, aby wywołać starzenie się komórek, wysiewaj zlewające się komórki z pasażu pierwszego w stosunku jeden do czterech i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni.

Aby monitorować starzenie się komórek, za pomocą zaawansowanego systemu licznika komórek Coulter mierz stopniowy wzrost średnicy i objętości komórek podczas każdego etapu trypsynizacji. Aby rozpocząć test przesiewowy beta-Gal, wysiewaj 5 000 komórek starczych lub 3 000 komórek niestarzejących się na dołek w 96 płytkach dołkowych. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin.

Następnie dodaj rozcieńczenia leku do komórek MEF i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 24 do 48 godzin. Po inkubacji usunąć roztwór leku i umyć komórki 100 mikrolitrami 1X PBS. Aby wywołać alkalizację lizosomalną, należy wstępnie potraktować komórki 90 mikrolitrami roztworu bafilomycyny A1, rozcieńczonego w pożywce do hodowli świeżych komórek o końcowym stężeniu 100 nanomolowców.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Do analizy fluorescencyjnej aktywności SA-beta-Gal należy przygotować świeży roztwór roboczy C12FDG rozcieńczony w pożywce wzrostowej o końcowym stężeniu 100 mikromolowym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu roboczego do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 10 mikromoli i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny.

Umyj komórki 100 mikrolitrami 1X PBS. Następnie dodaj dwa mikrolitry barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 100 mikrogramów na mililitr w końcowym stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 20 minut.

Po inkubacji usuń pożywkę, dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej i przystąp do obrazowania. W tym badaniu platforma akwizycji i analizy obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości pozwoliła na identyfikację leków senolitycznych, takich jak 17-DMAG, które zmniejszyły ogólną aktywność SA-beta-Gal w hodowlach mysich embrionalnych komórek fibroblastów zawierających komórki starcze w pasażu piątym. Wygenerowane przez oprogramowanie analizy ilościowe mieszanin komórek starczych i niestarzejących się pozwalają na wyraźne wykazanie efektów specyficznych dla komórek starzejących się oraz eliminację aktywności beta-galaktozydazy tła przez bafilomycynę A. Należy upewnić się, że uwzględniono wszystkie niezbędne kontrole komórek, zwłaszcza nieleczone komórki starcze i komórki starcze poddane kontroli dodatniej.

Ten esej obejmuje pracę z komórkami pierwotnymi w stresie oksydacyjnym, który może prowadzić do zmienności, którą należy monitorować. Procedura ta jest pierwszym krokiem w wykrywaniu leków senoterapeutycznych. Aby potwierdzić wyniki badań przesiewowych, należy przeprowadzić dodatkowe badania żywotności i starzenia się komórek.

Za pomocą tego eseju wykryto kilka nowych leków senolitycznych, w tym pierwszą kombinację leków senolitycznych kwercetynę dazatynib, inhibitory białka szoku cieplnego 90, inhibitory z rodziny Bcl-2 i polifenolową fisetynę.