Name: Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę przesiewową opartą na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych, w tym senolityków i senomorfików. Technika umożliwia wykrywanie związków przydatnych w leczeniu chorób związanych z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH Grants AG043376 (Projekt 2 i Core A, PDR; Projekt 1 i Core B, LJN) i AG056278 (Projekt 3 i Core A, PDR; oraz Projekt 2, LJN) oraz grant z Glenn Foundation (LJN).

Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Scripps Florida.
1. Generowanie starzejących się embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) – 12-15 dni
<ol>
	<li>Izolować MEF typu dzikiego oraz Ercc1-/- z płodów samic myszy w 13. dniu embrionalnym (E13) zgodnie z wcześniejszym opisem33. 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych, przy użyciu sterylnych instrumentów.</li>
	<li>Odciąć głowę zarodka powyżej oczu.</li>
	<li>Usunąć tkanki czerwone (serce i wątrobę) i wykorzystać je do genotypowania, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Przygotować 500 mL mieszaniny (1:1) pożywki Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) oraz Ham’s F10 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1x nieessentialnych aminokwasów, penicyliny i streptomycyny jako pożywki wzrostowej; przed każdym użyciem podgrzać ją do 37 °C przez około 15 min. Pożywkę wzrostową przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować pozostałą część zarodka w 0,25% trypsynie/EDTA przez 10 min.</li>
	<li>Posiekać zarodek na kawałki o wielkości 1 mm i kilkukrotnie pipetować tkankę w górę i w dół.</li>
	<li>Dodać 10 mL pożywki wzrostowej i wysiać tkanki z jednego zarodka na jedną płytkę hodowlaną o średnicy 10 cm (pasaż 0).</li>
	<li>Kultywować komórki w 37 °C, 3% O2, 5% CO2. 
	UWAGA: W tych warunkach do niepowlekanych płytek hodowlanych przywierają wyłącznie komórki MEF.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę codziennie w pasażu 0, aby usunąć nieprzytwierdzone fragmenty tkanek i komórek. 
	UWAGA: W zależności od wielkości zarodka i jakości izolacji, komórki zazwyczaj osiągają konfluencję po 2 do 3 dniach.</li>
	<li>Trypsynizacja
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki 10 mL 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 2 mL 0,025% roztworu trypsyny/EDTA do komórek na płytkach o średnicy 10 cm i inkubować w 37 °C przez 2-3 min.</li>
		<li>Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki odłączyły się od powierzchni.</li>
		<li>Zatrzymać trawienie trypsyną, dodając taką samą ilość pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Przenieść komórki do probówki stożkowej i odwirować przy 200 x g przez 3 min, a następnie odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Ostrożnie resuspendować komórki w świeżej pożywce wzrostowej, policzyć je i wysiać na nowe płytki z zakładaną gęstością komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku subkultywacji komórek niesenescencyjnych, rozdzielić konfluentne komórki w stosunku 1:4 i prowadzić kolejny pasaż w 3% O2, 37 °C, aby uzyskać więcej komórek (pasaż 1). 
	UWAGA: Na tym etapie komórki można albo utrzymywać w kulturze, albo przechowywać do późniejszego użycia w ciekłym azocie w krio probówkach zawierających około 1 milion komórek każda. Krok ten umożliwia również utworzenie mieszanej partii komórek z różnych zwierząt w celu zmniejszenia zmienności wynikającej z analizy pojedynczego zwierzęcia.</li>
	<li>Aby indukowć senescencję komórkową, wysiać rozdzielone konfluentne komórki z pasażu 1 w stosunku 1:4 i inkubować je w 20% O2, 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni; warunki te odpowiadają atmosferycznemu stężeniu tlenu. 
	UWAGA: Kultywowanie komórek i blastocyst w otoczeniu tlenu o stężeniu atmosferycznym może podnieść poziom markerów senescencji komórkowej, szczególnie w przypadku upośledzonej naprawy uszkodzeń DNA34,35,36.</li>
	<li>Powtórzyć tę procedurę przez kolejne 2 pasaże.</li>
	<li>W celu monitorowania senescencji komórkowej, mierzyć stopniowy wzrost średnicy i objętości komórek podczas każdego etapu trypsynizacji za pomocą zaawansowanego systemu licznika komórek Coulter.</li>
	<li>Ocenić redukcję proliferacji komórek poprzez wyznaczenie podwojenia populacji (PD) za pomocą równania 
	PDT = (t2-t1)/3.32 x (log n2 – log n1) 
	UWAGA: Czas podwojenia populacji był stosowany wyłącznie dla komórek niesenescencyjnych.</li>
	<li>Użyć komórek MEF typu dzikiego lub Ercc1-/- z wczesnych pasaży, które były utrzymywane w 3% O2, 37 °C, 5% CO2, jako kontrolnych komórek niesenescencyjnych.</li>
</ol>
2. Test przesiewowy aktywności β-gal laktozowej związanej z procesem starzenia – 2-3 dni
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM roztwory zapasowe wszystkich testowanych leków w DMSO i przechowywać alikwoty w temperaturze -80 °C. Nie rozmrażać i ponownie zamrażać roztworów zapasowych, ponieważ może to obniżyć aktywność leków. 
	UWAGA: W tej procedurze inhibitor HSP90, 17DMAG, został zastosowany jako lek senolityczny zdolny do selektywnego zabijania komórek senescentnych17.</li>
	<li>W dniu eksperymentu rozmrozić alikwot, rozcieńczyć leki w świeżej pożywce hodowlanej i dodać do komórek znajdujących się w pożywce warunkowanej w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie w pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Do rozcieńczeń seryjnych i kombinacji leków użyć płytek 96-dołkowych do wstępnego rozcieńczania. 
	UWAGA: W przypadku komórek MEF empirycznie ustalono, że stężenia DMSO nie powinny przekraczać 2%; w każdej serii należy uwzględnić komórki kontrolne traktowane najwyższymi zastosowanymi stężeniami DMSO.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem leczenia, co najmniej 6 h wcześniej, wysiać 5 x 103 komórek senescentnych lub 3 x 103 komórek niesenescentnych na dołek w płytkach 96-dołkowych w 100 µL pożywki wzrostowej i inkubować w warunkach 20% O2, 37 °C, 5% CO2. 
	UWAGA: Przed leczeniem komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji. </li>
	<li>Aby zminimalizować przesłuchy sygnału fluorescencyjnego i tło, należy użyć modyfikowanych płytek 96-dołkowych do hodowli tkankowej z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem. 
	UWAGA: Pomyślnie przetestowano jednak również płytki całkowicie przezroczyste.</li>
	<li>Dodać rozcieńczenia leków do komórek MEF i inkubować przez 24 h do 48 h w warunkach 20% O2, 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Komórki niesenescentne utrzymywać w warunkach 3% O2, 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia alkalizacji lizosomów przygotować 10 mM roztwór bafilomycyny A1, podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Do analizy fluorescencyjnej aktywności SA-β-Gal przygotować 2 mM roztwór zapasowy C12FDG, przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.</li>
	<li>Roztwór roboczy 100 µM C12FDG w pożywce wzrostowej przygotować w dniu eksperymentu. 
	UWAGA: Wszystkie etapy (inkubacje) z wykorzystaniem C12FDG powinny być przeprowadzane w ciemności.</li>
	<li>Usunąć roztwór leku i przemyć komórki 1 raz przy użyciu 100 µL 1x PBS.</li>
	<li>Zindukować alkalizację lizosomów poprzez wstępne traktowanie komórek 90 µL roztworem 100 nM bafilomycyny A1 przygotowanym w świeżej pożywce do hodowli komórkowej przez 1 godzinę w warunkach 20% O2, 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Dodać 10 µL roztworu roboczego 100 µM C12FDG do pożywki hodowlanej (stężenie końcowe 10 µM).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 2 h.</li>
	<li>Dodać do hodowli 2 µL barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 100 µg/mL (stężenie końcowe 2 µg/mL) i inkubować przez 20 min.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dodać 100 µL świeżej pożywki wzrostowej.</li>
</ol>
3. Ilościowa analiza obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości danych
<ol>
	<li>Należy wykorzystać platformę do wysokoprzepustowego obrazowania i analizy fluorescencyjnej w celu pozyskania obrazów fluorescencyjnych komórek w dwóch kanałach odpowiednich dla detekcji fluorescencji Hoechst oraz C12FDG (np. odpowiednio w ustawieniach wstępnych dla kanałów DAPI i FITC). 
	UWAGA: Protokoły akwizycji wymagają zdefiniowania kilku zmiennych specyficznych dla danego badania. Celem protokołu akwizycji jest zarejestrowanie odpowiedniej liczby ostrych obrazów fluorescencyjnych dla dostatecznej liczby komórek, aby umożliwić późniejszą analizę ilościową.</li>
	<li>Opracuj odpowiedni protokół analizy, wybierając każdy kanał i definiując – poprzez dostosowanie jednego lub więcej kryteriów selektywnych – co kwalifikuje się jako cecha interesująca w każdym kanale.
	<ol>
		<li>W przypadku jądra należy zastosować predefiniowane ustawienia segmentacji (np. segmentację jądrową, segmentację pęcherzykową, segmentację cytoplazmatyczną), które umożliwią identyfikację organelli komórkowych na podstawie wielu kryteriów, w tym morfologii, rozmiaru i intensywności sygnału. Należy dostosować te kryteria tak, aby uwzględnić jądra, wykluczając jednocześnie fragmenty jądrowe i debris, które mogą wykazywać sygnał, ale są na przykład zbyt duże lub zbyt małe, aby być uznane za jądra.</li>
		<li>Sprawdź sygnał w kanale FITC, który stanowi fluorescencję pochodzącą z odszczepionego C12FDG i reprezentuje poziom aktywności β-galaktozydazy związanej z senescencją w komórkach. 
		UWAGA: Komórki senescentne wykazują wyższą aktywność β-galaktozydazy związanej z senescencją niż komórki niesenescentne; jednakże, C12Fluorescencja FDG nie będzie dyskretna, lecz ciągła, co wymusza ustanowienie progu odróżniającego to, co uznaje się za C12dodatni w badaniu FDG oraz C12komórka FDG-ujemna</li>
		<li>Przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania analitycznego należy wygenerować liczbę przypadków, w których zdefiniowany obszar wokół jądra (domniemana komórka) nałożył się przynajmniej raz na sygnał C powyżej progu.12FDG. 
		UWAGA: Oprogramowanie analityczne automatycznie generuje liczbę komórek przy użyciu łączenia celów (target linking). Jest to praktyczna definicja komórki senescencyjnej w tym teście, C12Komórka FDG-dodatnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszystkie próbki należy przeanalizować w trzech powtórzeniach, badając od 3 do 5 pól w każdej studience, a następnie odpowiednio obliczyć wartości średnie i odchylenia standardowe.</li>
	<li>Oblicz procent komórek senescencyjnych, korzystając z następującego wzoru: 
	Komórki senescentne (%) = <img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie starzenia się, stosunek komórek starzejących się do wszystkich komórek, badania biologiczne." src="/files/ftp_upload/58133/58133eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> x 100</li>
</ol>
4. Parametry walidacji metody
<ol>
	<li>Dla wszystkich próbek obliczono wewnątrz- i międzyseryjne współczynniki zmienności (%CVs), korzystając z następującego wzoru: 
	CV wewnątrzseriejne (n = 10 powtórzeń wykonanych w jednym eksperymencie) = <img alt="wzór na obliczanie wartości średniej, ułamek średniej przez n, równanie matematyczne" src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> x 100 (%) 
	CV międzyseryjne (n = 5 niezależnych eksperymentów) = <img alt="wzór na obliczanie wartości średniej, ułamek średniej przez n, równanie matematyczne" src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> x 100 (%)</li>
	<li>W celach przesiewowych wyznacz wartość Z’, będącą parametrem statystycznym służącym do oceny jakości testu, na podstawie komórek traktowanych 200 nM rapamycyną przez 24 h przy 20% O2, 37 °C, 5% CO2 (kontrolka pozytywna dla leków senoterapeutycznych) oraz nie traktowanych senescencyjnych komórek (kontrolka negatywna). 
	UWAGA: Wartość Z’ obliczono zgodnie z metodą Zhang i wsp.37. Wartości Z’ pomiędzy 0,5 a 1 wskazują, że test może być wykorzystany do przesiewu leków.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

SA-β-Gal jest dobrze zdefiniowanym biomarkerem starzenia się komórek, pierwotnie odkrytym przez Dimri i in. (1995), wykazującym, że starzejące się ludzkie fibroblasty mają zwiększoną aktywność SA-β-Gal podczas oznaczania przy pH 6,23 w porównaniu z komórkami proliferującymi. Tymczasem testy in vitro i in vivo na obecność SA-β-Gal ustalono dla różnych typów komórek i tkanek 25,39,40. Oparta na flu...

Starzenie się komórek zostało po raz pierwszy opisane przez Leonarda Hayflicka i Paula Moorheada, którzy wykazali, że normalne komórki mają ograniczoną zdolność do namnażania się w hodowli1. Starzejące się komórki nie namnażają się pomimo obecności składników odżywczych, czynników wzrostu i braku hamowania kontaktu, ale pozostają aktywne metabolicznie2. Zjawisko to znane jest jako starzenie replikacyjne i przypisuje się je głównie skracaniu telomerów, przynajmniej w komórkach ludzkich3. Dalsze badania wykazały, że komórki mogą być również indukowane do starzenia się w odpowiedzi na inne bodźce, takie jak stres onkogenny (starzenie się wywołane onkogenem, OIS), uszkodzenie DNA, leki cytotoksyczne lub napromienianie (starzenie się wywołane stresem, SIS)4,5,6. W odpowiedzi na uszkodzenie DNA, w tym erozję telomerów, komórki albo starzeją się, rozpoczynają niekontrolowany wzrost komórek, albo ulegają apoptozie, jeśli uszkodzenia nie można naprawić. W tym przypadku starzenie się komórek wydaje się być korzystne, ponieważ działa w sposób hamujący nowotwór2. Natomiast starzenie się nasila się wraz z wiekiem z powodu nagromadzenia uszkodzeń komórek, w tym uszkodzenia DNA. Ponieważ komórki starcze mogą wydzielać cytokiny, metaloproteinazy i czynniki wzrostu, zwane fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem się (SASP), ten zależny od wieku wzrost starzenia się komórek i SASP przyczynia się do zmniejszenia homeostazy tkanek, a następnie starzenia się. Wiadomo również, że ten zależny od wieku wzrost obciążenia związanego ze starzeniem się wywołuje choroby metaboliczne, wrażliwość na stres, zespoły progerii i zaburzenia gojenia7,8 i jest częściowo odpowiedzialny za liczne choroby związane z wiekiem, takie jak miażdżyca, choroba zwyrodnieniowa stawów, zwyrodnienie mięśni, powstawanie wrzodów i choroba Alzheimera9,10,11,12,13. Eliminacja komórek starczych może pomóc w zapobieganiu lub opóźnianiu dysfunkcji tkanek i przedłużeniu okresu zdrowia14. Zostało to wykazane w transgenicznych modelach myszy14,15,16, a także przy użyciu leków senolitycznych i kombinacji leków, które zostały odkryte zarówno dzięki badaniom przesiewowym leków, jak i analizie bioinformatycznej szlaków indukowanych specyficznie w komórkach starczych17,18,19,20,21,22. Zidentyfikowanie bardziej optymalnych leków senoterapeutycznych, zdolnych do skuteczniejszego zmniejszania obciążenia komórek starczych, jest ważnym kolejnym krokiem w rozwoju podejść terapeutycznych dla zdrowego starzenia się.
Starzejące się komórki wykazują charakterystyczne cechy fenotypowe i molekularne, zarówno w hodowli, jak i in vivo. Te markery starzenia mogą być przyczyną lub wynikiem indukcji starzenia się lub produktem ubocznym zmian molekularnych w tych komórkach. Jednak żaden pojedynczy marker nie znajduje się specyficznie w komórkach starczych. Obecnie wykrywanie β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal) jest jedną z najlepiej scharakteryzowanych i uznanych metod pomiaru starzenia się in vitro i in vivo opartych na pojedynczych komórkach. SA-β-Gal jest hydrolazą lizosomalną o optymalnej aktywności enzymatycznej przy pH 4. Pomiar jego aktywności przy pH 6 jest możliwy, ponieważ komórki starcze wykazują zwiększoną aktywność lizosomalną23,24. W przypadku żywych komórek podwyższone pH lizosomalne uzyskuje się przez alkalizację lizosomalną wakuolarnym inhibitorem H+-ATPazy Bafilomycyną A1 lub inhibitorem kwasowości endosomalnej chlorochiną25,26. 5-dodekanylaminofluoresceina Di-β-D-galaktopyranozyd (C12FDG) jest stosowany jako substrat w żywych komórkach, ponieważ zatrzymuje rozszczepiony produkt w komórkach dzięki swojemu 12-węglowemu ugrupowaniu lipofilowe25. Co ważne, sama aktywność SA-β-Gal nie jest bezpośrednio związana z żadnym szlakiem zidentyfikowanym w komórkach starczych i nie jest niezbędna do wywołania starzenia. Dzięki temu testowi komórki starcze można zidentyfikować nawet w heterogenicznych populacjach komórek i starzejących się tkankach, takich jak biopsje skóry od osób starszych. Został również wykorzystany do pokazania korelacji między starzeniem się komórek a starzeniem się23, ponieważ jest to wiarygodny marker do wykrywania komórek starczych w kilku organizmach i warunkach27,28,29,30. W tym miejscu opisano wysokoprzepustowy test przesiewowy SA-β-Gal oparty na subsecie fluorescencyjnym C12FDG przy użyciu pierwotnych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z silnym starzeniem się komórek wywołanym stresem oksydacyjnym oraz omówiono jego zalety i wady. Chociaż test ten można przeprowadzić na różnych typach komórek, zastosowanie MEF z niedoborem Ercc1 i upośledzoną naprawą DNA pozwala na szybszą indukcję starzenia się w warunkach stresu oksydacyjnego. U myszy zmniejszona ekspresja endonukleazy naprawy DNA ERCC1-XPF powoduje upośledzoną naprawę DNA, przyspieszoną akumulację endogennych uszkodzeń DNA, podwyższony ROS, dysfunkcję mitochondriów, zwiększone obciążenie komórkami starczymi, utratę funkcji komórek macierzystych i przedwczesne starzenie się, podobnie jak w naturalnym starzeniu się31,32. Podobnie, MEF-y z niedoborem Ercc1 starzeją się szybciej w culture17. Ważną cechą testu MEF w procesie starzenia się jest to, że każda studzienka zawiera mieszaninę komórek starczych i niestarzejących się, co pozwala na wyraźne wykazanie efektów specyficznych dla komórek starczych. Jednak chociaż uważamy, że zastosowanie stresu oksydacyjnego w komórkach pierwotnych w celu wywołania starzenia się jest bardziej fizjologiczne, test ten może być również stosowany w przypadku linii komórkowych, w których starzenie się jest indukowane przez czynniki uszkadzające DNA, takie jak etopozyd lub napromienianie.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>medium</td></tr><tr><td>Ham's F10</td><td>Gibco</td><td>12390-035</td><td>średnia</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Tissue Culture Biologics</td><td>101</td><td>surowica</td></tr><tr><td>1x aminokwasy endogenne</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td>aminokwasy</td></tr><tr><td>bafilomycyna A1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td>inhibitor lizosomalny</td></tr><tr><td>C12FDG</td><td>Setareh Biotech</td><td>7188</td><td>substrat b-Gal</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Środek interkalacyjny DNA</td></tr><tr><td>17DMAG</td><td>Selleck Chemical LLC</td><td>50843</td><td>Inhibitor HSP90</td></tr><tr><td>System obrazowania komórek InCell6000</td> System <td>obrazowania o wysokiej zawartości</td> GE <td>Healthcare</td><td></td></tr></tbody></table>

test przesiewowy oparty na sa-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Starzenie się komórek jest jedną z cech charakterystycznych starzenia się, o której wiadomo, że negatywnie wpływa na długość życia w zdrowiu. Leki zdolne do zabijania komórek starczych w hodowli komórkowej, zwane senolitykami, mogą zmniejszyć obciążenie komórek starczych in vivo i wydłużyć okres zdrowia. Do tej pory zidentyfikowano wiele klas senolityków, w tym inhibitory HSP90, inhibitory z rodziny Bcl-2, pipelonguminę, peptyd hamujący FOXO4 oraz skojarzenie dazatynibu z kwercetyną. Wykrywanie SA-β-Gal przy podwyższonym pH lizosomalnym jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych markerów wykrywania komórek starczych. Pomiary aktywności β-galaktozydazy (SA-β-Gal) związanej ze starzeniem się w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego substratu C12FDG w połączeniu z określeniem całkowitej liczby komórek przy użyciu barwnika Hoechsta interkalującego DNA otwierają możliwość badań przesiewowych w kierunku leków senoterapeutycznych, które albo zmniejszają ogólną aktywność SA-β-Gal poprzez zabijanie komórek starczych (senolityków), albo przez tłumienie SA-β-Gal i innych fenotypów komórek starczych (senomorfiki). Wykorzystanie platformy do akwizycji i analizy obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości pozwala na szybkie i wysokoprzepustowe badania przesiewowe bibliotek leków pod kątem wpływu na SA-β-Gal, morfologię komórek i liczbę komórek.

Aktywność SA-β-Gal można wykryć w komórkach, których starzenie zostało indukowane na różne sposoby: od wyczerpania replikacyjnego, stresu genotoksycznego i oksydacyjnego, po aktywację onkogenów23,25,38. W obecnym modelu z wykorzystaniem fibroblastów zarodkowych myszy pozbawionych genu Ercc1, warunki wzrostu w normoksji (20% O2) były wystarczające do indukcji starzenia się komó...

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Po raz pierwszy opisujemy tutaj metodę, która pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków pod kątem związków senoterapeutycznych, które okazały się korzystne w chorobach związanych ze starzeniem się. W rzeczywistości obecnie toczy się kilka badań klinicznych z lekami testowanymi w tej istocie. Główną zaletą tej techniki jest rozróżnienie dwóch rodzajów leków senoterapeutycznych, senolityków i senomorfików, poprzez zastosowanie dobrze ugruntowanego wykrywania SA-beta-galaktozydazy w komórkach starczych.Technika ta jest ważnym narzędziem przesiewowym dla nowych związków senoterapeutycznych. W rzeczywistości kilka związków, które zostały zidentyfikowane za pomocą tego ekranu, jest opisywanych w różnych głośnych publikacjach i są obecnie w fazie badań klinicznych. Technika ta jest niezwykle wszechstronna i może być dostosowana do kilku sit o wysokiej przepustowości.W rzeczywistości możliwe jest multipleksowanie badań przesiewowych i badanie przesiewowe w poszukiwaniu związków, które hamują starzenie się poprzez aktywację lub hamowanie jednego z kilku szlaków. Zmiel każdy zarodek na jednomilimetrowe kawałki i kilkakrotnie przeciskaj go w górę iw dół. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki wzrostowej do tkanek każdego zarodka.Umieść je w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 3% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni. I inkubuj resztę każdego zarodka z mieszaniną 0,25% trypsyny EDTA przez 10 minut. Aby wytrypsynizować komórki, najpierw ostrożnie usuń pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyj komórki 10 mililitrami 1X PBS.Następnie dodaj dwa mililitry roztworu 025 trypsyny EDTA do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut. Następnie sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są oderwane od powierzchni. Dodaj taką samą ilość pożywki wzrostowej, aby zakończyć trawienie trypsyny i przenieś komórki do stożkowej rurki.Następnie odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Odrzuć supernatant i dodaj świeżą pożywkę wzrostową, aby ponownie zawiesić komórki. Następnie policz komórki i umieść je na nowych płytkach przy przewidywanej gęstości komórek.W przypadku subuprawy niestarzejącej się, najpierw należy podzielić zlewające się komórki w stosunku jeden do czterech. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 3% tlenu i 5% dwutlenku węgla, aby przedłużyć się do kolejnego przejścia. Następnie, aby wywołać starzenie się komórek, wysiewaj zlewające się komórki z pasażu pierwszego w stosunku jeden do czterech i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni.Aby monitorować starzenie się komórek, za pomocą zaawansowanego systemu licznika komórek Coulter mierz stopniowy wzrost średnicy i objętości komórek podczas każdego etapu trypsynizacji. Aby rozpocząć test przesiewowy beta-Gal, wysiewaj 5 000 komórek starczych lub 3 000 komórek niestarzejących się na dołek w 96 płytkach dołkowych. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin.Następnie dodaj rozcieńczenia leku do komórek MEF i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 24 do 48 godzin. Po inkubacji usunąć roztwór leku i umyć komórki 100 mikrolitrami 1X PBS. Aby wywołać alkalizację lizosomalną, należy wstępnie potraktować komórki 90 mikrolitrami roztworu bafilomycyny A1, rozcieńczonego w pożywce do hodowli świeżych komórek o końcowym stężeniu 100 nanomolowców.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Do analizy fluorescencyjnej aktywności SA-beta-Gal należy przygotować świeży roztwór roboczy C12FDG rozcieńczony w pożywce wzrostowej o końcowym stężeniu 100 mikromolowym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu roboczego do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 10 mikromoli i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny.Umyj komórki 100 mikrolitrami 1X PBS. Następnie dodaj dwa mikrolitry barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 100 mikrogramów na mililitr w końcowym stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 20 minut.Po inkubacji usuń pożywkę, dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej i przystąp do obrazowania. W tym badaniu platforma akwizycji i analizy obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości pozwoliła na identyfikację leków senolitycznych, takich jak 17-DMAG, które zmniejszyły ogólną aktywność SA-beta-Gal w hodowlach mysich embrionalnych komórek fibroblastów zawierających komórki starcze w pasażu piątym. Wygenerowane przez oprogramowanie analizy ilościowe mieszanin komórek starczych i niestarzejących się pozwalają na wyraźne wykazanie efektów specyficznych dla komórek starzejących się oraz eliminację aktywności beta-galaktozydazy tła przez bafilomycynę A. Należy upewnić się, że uwzględniono wszystkie niezbędne kontrole komórek, zwłaszcza nieleczone komórki starcze i komórki starcze poddane kontroli dodatniej.Ten esej obejmuje pracę z komórkami pierwotnymi w stresie oksydacyjnym, który może prowadzić do zmienności, którą należy monitorować. Procedura ta jest pierwszym krokiem w wykrywaniu leków senoterapeutycznych. Aby potwierdzić wyniki badań przesiewowych, należy przeprowadzić dodatkowe badania żywotności i starzenia się komórek.Za pomocą tego eseju wykryto kilka nowych leków senolitycznych, w tym pierwszą kombinację leków senolitycznych kwercetynę dazatynib, inhibitory białka szoku cieplnego 90, inhibitory z rodziny Bcl-2 i polifenolową fisetynę.

sa-galactosidase-based-screening-assay-for-identification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Ten film opisuje wysokoprzepustowy test kolorymetryczny, test sulforodaminy B, do pomiaru cytotoksyczności wywołanej lekiem w komórkach rakowych. Test określa oporność na leki, mierząc gęstość komórek na podstawie zawartości białka komórkowego.

Test sulforodaminy B: czuły test do pomiaru oporności na leki poprzez określenie zawartości białka komórkowego w komórkach rakowych

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

W tym filmie opisujemy prostą i solidną metodę określania potencjału cytotoksycznego leku trypanobójczego przeciwko pasożytowi, Trypanosoma cruzi, wyrażającemu enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza służy jako wskaźnik lizy komórek, a jej aktywność może być wykorzystana do oceny efektów działania leku.

Test β-galaktozydazy do oceny cytotoksyczności wywołanej lekiem u pasożytów

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

S-transferazy glutationu (GST) są enzymami detoksykacyjnymi biorącymi udział w metabolizmie wielu leków chemioterapeutycznych. Nadekspresja GST jest skorelowana z opornością na chemioterapię raka. Jednym ze sposobów przeciwdziałania temu fenotypowi jest stosowanie inhibitorów. Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą test spektrofotometryczny do badań przesiewowych pod kątem potencjalnych inhibitorów GST.

Spektrofotometryczne badania przesiewowe w kierunku potencjalnych inhibitorów cytozolowych S-transferaz glutationowych

Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje...

Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół użycia testu reporterowego opartego na lucyferazie w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę przesiewową opartą na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych, w tym senolityków i senomorfików. Technika umożliwia wykrywanie związków przydatnych w leczeniu chorób związanych z wiekiem.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Przeglądaj więcej filmów