Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu problemów związanych ze skutecznością, wydajnością odzysku i czystością pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych przy użyciu podejścia wirowania ultrafiltracyjnego. Bezpośrednio porównaliśmy tę technikę z techniką ultrawirowania i oczyszczania w gradieniu gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, wydajna i odpowiednia dla próbek o małej objętości, takich jak mysi płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Co ważniejsze, zapewnia wysoką czystość i znacznie wyższą skalowalność w porównaniu z metodą izolacji ultrawirowania. Procedurę zademonstruje pan Norman Garrett III, pracownik naukowy mojego laboratorium. Na początek włóż angiocewnik o rozmiarze 22 do tchawicy myszy poddanej eutanazji.

Podłącz strzykawkę z insuliną z jednym mililitrem lodowatego sterylnego DPBS i wkropl jeden mililitr do obu płuc. Powoli wyjmować tłok strzykawki w celu pobrania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub płynu BAL. I dozować płyn BAL do stożkowej rurki na lodzie.

Następnie wyciągnij płyn BAL z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy. Odwirować płyn BAL o temperaturze 400 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i odwirować go w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie zebrać supernatant i natychmiast przejść do etapów izolacji EV. Najpierw przefiltruj super natant przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra. Następnie zrównoważyć filtr odśrodkowy sterylnym DPBS przez 10 minut.

Następnie odwirować jednostkę odśrodkową w temperaturze 15 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Napełnij filtr 15 mililitrami płynu BAL. I odwirować go w temperaturze 3000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przemyć retentat 14 mililitrami sterylnego DPBS, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą w temperaturze 3 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć DPBS i stężyć retentat. Aby zebrać skoncentrowane EV pochodzące z płynu BAL, włóż pipeter do dolnej części jednostki filtrującej i wyjmij próbkę ruchem zamiatania na boki.

Następnie podwielokrotnie EV pochodzące z płynu BAL i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Alternatywnie, zacznij od przeniesienia poprzednio nabytego supernatantu do probówki ultrawirówkowej. I odwirować go w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie zebrać supernatant i odwirować. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulat EV w 200 mikrolitrach DPBS. Następnie wymieszaj zawieszenie EV z 300 mikrolitrami 50% roztworu roboczego joduksanolu.

I przenieś go do 15-mililitrowej probówki ultrawirówkowej. Następnie dodaj roztwór buforowy zgodnie z protokołem tekstowym, aby utworzyć gradient gęstości wyporu i odwiruj go w temperaturze 100 000 G przez trzy godziny i 50 minut. Zbierz 15% i 25% frakcje jodiksanolu i rozcieńcz je w DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 mililitrów.

Przenieś frakcje do nowej probówki ultrawirówki i odwiruj w temperaturze 100 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 mikrolitrach sterylnego DPBS. Aby rozpocząć analizę śledzenia nanocząstek, rozcieńczyć próbkę EV w jednym mililitrze DPBS.

I załaduj próbkę do strzykawki insulinowej. Następnie podłącz strzykawkę do pompy strzykawkowej i zmierz liczbę cząstek oraz rozmiar. Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na jeden.

Następnie użyj czytnika płytek, aby określić ilościowo ilość białka w próbce EV za pomocą detekcji kolorymetrycznej. Rozpuścić równą ilość białka EV z każdej próbki za pomocą buforu ładującego blotting i DTT. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Załaduj próbki do żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę przez 35 minut. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu. Następnie zablokuj membranę pięcioprocentowym odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, delikatnie kołysząc.

Inkubuj błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc przez noc. Opracuj błonę, inkubując błonę z przeciwciałem łączącym HRP przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć membranę przez 10 minut trzykrotnie buforem TBST.

Na koniec opracuj membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP przed przystąpieniem do obrazowania. Aby rozpocząć cytometrię przepływową, rozcieńczyć EV pochodzące z płynu BAL w 49 mikrolitrach buforu barwiącego PEB. Następnie dodaj trzy przeciwciała do każdej z próbek, a następnie inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem przez 60 minut w ciemności.

Na koniec rozcieńczyć próbki 40 mikrolitrami przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej. W tym protokole EV wyizolowano z mysiego płynu BAL przy użyciu metod UFC i UC-DGC. EV pochodzące z płynu BAL od normalnych myszy wyizolowanych metodą UFC wykazywały mniejsze rozmiary i bardziej równomierny rozkład rozmiarów niż UC-DGC-EV.

Technika UFC miała również znacznie wyższą całkowitą liczbę cząstek w porównaniu z techniką UC-DGC. Całkowite odzysk białka mierzony w miligramach UFC-EV był również wyższy niż w UC-DGC-EV, co wskazuje, że technika UFC jest bardziej efektywna pod względem czasu i wysiłku. Wreszcie, EV pochodzące z płynu BAL zostały również dodatkowo scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej.

Zarówno UFC-EV, jak i UC-DGC-EV wyrażały CD63, CD9 i CD81. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ponownym nawodnieniu membrany jednostki ultrafiltracji za pomocą DPBS. Po nawodnieniu membrany urządzenie musi być przez cały czas mokre, aż do użycia.

Pobieranie retentatu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z jednostki filtrującej może być trudne. Upewnij się, że końcówka pipety jest przesunięta na boki, aby odzyskać większość EV z jednostki filtrującej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się izolacją pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do zbadania funkcji biologicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach u małych zwierząt.