Name: Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Naucz się izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu wirowania ultrafiltracji. Ta metoda zapewnia wyższą czystość i skalowalność w porównaniu z tradycyjną ultrawirowanią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca jest wspierana przez granty NHLBI/NIH HL103868 (dla P.C.) i HL137076 (dla P.C.), American Heart Association Grant-in-Aid (dla P.C.) oraz Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (dla P.C.). Chcielibyśmy wyrazić nasze wielkie uznanie dla Smidt Heart Institute w Cedars-Sinai Medical Center, który dostarcza nam maszynę Nanosight do analizy śledzenia nanocząstek EV.

Wykorzystanie zwierząt i wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Cedars-Sinai (CSMC).
1. Mysie płyny do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) Pobieranie i przygotowanie
<ol>
	<li>Kolekcja BALF
	<ol>
		<li>Eutanazja myszy za pomocą koktajlu ketaminy (300 mg / kg) i ksylazyny (30 mg / kg) drogą dootrzewnową, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.</li>
		<li>Wprowadzić angiocewnik 22 G do tchawicy. Podłącz strzykawkę insulinową zawierającą 1 ml (ml) lodowatego sterylnego buforu fosforanowego Dulbecco z soli fizjologicznej (DPBS) i wkraplaj 1 ml DBPS do obu płuc przez angiocewnik.</li>
		<li>Powoli wyjąć tłok strzykawki w celu pobrania BALF i dozować BALF do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj BALF na lodzie.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.2 i 1.1.3 3x (łącznie 4x w każdej myszy). 
		Uwaga: Zwykle pobiera się około 0,8 ml na mililitr wkroplenia. Poniższe kroki można również wykonać dla pojedynczych myszy (tj. 3 ml BALF), ale łączenie wielu próbek BALF pozwoli na izolację większej partii EV w celu zapewnienia spójności w dalszych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie BALF
	<ol>
		<li>Zbierz BALF z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy (~35 ml na podwielokrotność).</li>
		<li>Odwirować BALF w temperaturze 400 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut, w celu usunięcia komórek i innych zanieczyszczeń komórkowych oraz zebrania supernatantu.</li>
		<li>Odwirować supernatant w temperaturze 1 500 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut, w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatant i przejść do etapów izolacji EV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
UWAGA: W tym badaniu, dwie techniki izolacji EV, a mianowicie UFC i ultrawirowanie z pływalnością, służyły do izolowania EV od BALF. Szczegółowy protokół każdej metody jest opisany poniżej.
<ol>
	<li>Metoda wzbogacania metodą wirowania ultrafiltracyjnego (UFC) 
	UWAGA: Ta metoda została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opisanego protocol10.
	<ol>
		<li>Przefiltrować supernatant z kroku 1.2.3 przez sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm i utrzymać przefiltrowany BALF na lodzie. 
		UWAGA: Jest to etap wykluczania wielkości, w którym zbierane są tylko pęcherzyki mniejsze niż 200 nm.</li>
		<li>Równoważyć filtr odśrodkowy MWCO o mocy 100 kDa sterylnym DPBS przez 10 minut. Odwirować jednostkę odśrodkową przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wyrzucić DPBS. 
		UWAGA: Gdy membrana w urządzeniu filtrującym zostanie zrównoważona z DPBS, membrana musi być mokra przez cały czas, aż urządzenie zostanie użyte.</li>
		<li>Napełnić jednostkę filtrującą 15 ml próbki BALF z kroku 2.1.1 i odwirować przy 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przepływowy BALF można wyrzucić lub zebrać do oddzielnej probówki kanonicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.3 dla pozostałego BALF. z filtrem 0,2 μm
		Uwaga: Potrzeba było trzech powtórzeń wirowania, aby wystarczająco skoncentrować BALF EV z pierwotnej objętości wyjściowej 35 ml. W ten sposób uzyskano 1–1,5 ml retentatu.</li>
		<li>Przemyć retentat 14 ml jałowego DPBS, delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą przy 3 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 30 minut, w celu usunięcia DPBS i zagęszczenia retentatu EV.</li>
		<li>Zebrać skoncentrowane EV pochodzące z BALF z urządzenia filtrującego, wkładając pipetor do dolnej części urządzenia filtrującego i pobierając próbkę ruchem zamiatania z boku na bok, aby zapewnić całkowite odzysk.</li>
		<li>Podwielokrotnić EV pochodzące z BALF i przechowywać je w temperaturze -80 °C w celu dalszej kwantyfikacji i charakterystyki cząstek (patrz krok 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ultrawirowanie (UC) z wirowaniem w gradionym gradimencie gęstości wyporu (DGC) 
	UWAGA: Następujący protokół został zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opisanego protocol24.
	<ol>
		<li>Przenieść supernatant z etapu 2.1.1 do probówki ultrawirówkowej o pojemności 37 ml i odwirować próbkę o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki. Zebrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Podczas gdy granulki EV są odwirowywane, należy przygotować różne stężenia gradientu gęstości wyporu (tabela 1) dla kroku 2.2.3.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 200 μl DPBS.</li>
		<li>Zmieszać zawiesinę EV z 300 μl 50% roztworu roboczego jodixanolu (Tabela 1) i przenieść do probówki ultrawirówki o pojemności 15 ml. Na wierzch 50% zawiesiny mieszaniny jodiksanolu-EV ułóż kolejno następujący roztwór buforowy w kolejności od dołu do góry: 30% jodiksanolu (4,5 ml), 25% jodiksanolu (3 ml), 15% jodiksanolu (2,5 ml) i 5% jodiksanolu (6 ml). Wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 230 min. 
		UWAGA: Gradient gęstości wyporu opiera się na procentowym skalowaniu jodiksanolu od najwyższego stężenia (50%) na dole do najniższego stężenia (5%) na górze. Aby wytworzyć różne stężenia jodiksanolu, różne ilości pożywki homogenizacyjnej (tabela 1) zmieszano z roztworem roboczym (50% jodiksanolu).</li>
		<li>Zebrać frakcję 15% i 25% i rozcieńczyć je w sterylnym DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 ml. Przenieść je do nowej małej probówki do ultrawirówki i wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 μl sterylnego DPBS w celu dalszej charakterystyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
UWAGA: Wydajność odzysku EV pochodząca z BALF jest mierzona za pomocą dwóch wskaźników.
<ol>
	<li>Pomiar w analizie śledzenia nanocząstek (NTA)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbkę EV w stosunku 1:200–1:500 w 1 ml DPBS i załadować próbkę do strzykawki insulinowej. Podłączyć strzykawkę z próbką do pompy strzykawkowej i rozpocząć pomiar liczby cząstek i wielkości (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na 1 dla wszystkich pomiarów próbki. Dla każdej próbki zarejestrowano pięć powtarzających się pomiarów z 1500 klatkami w ciągu 30 sekund, z opóźnieniem 20 s między odczytami. Połącz i uśrednij dane w końcowych raportach stężeń i rozmiarów. 
		UWAGA: Aby uzyskać dokładne uchwycenie wszystkich cząstek, dostosuj odpowiednio poziom kamery, aby uwidocznić wszystkie cząstki i użyj podobnych ustawień dla wszystkich pomiarów próbki w każdym eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja białka 
	UWAGA: Test białka kwasu bicinchoninowego (BCA) został użyty do pomiaru stężenia białka w EV pochodzących z BALF.
	<ol>
		<li>Rozpuść próbki EV w 1x buforze do lizy.</li>
		<li>Określ ilościowo ilość białka w EV pochodzących z BALF zgodnie ze standardowym protokołem BCA za pomocą detekcji kolorymetrycznej, mierząc absorbancję przy 560 nm w czytniku płytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z BALF
UWAGA: Powszechnie znane białka markerów powierzchniowych egzosomów (TSG101, CD63, CD81 i CD9) zostały użyte do weryfikacji odzysku EV za pomocą SDS-PAGE oraz analizy immunoblottingu i cytometrii przepływowej.
<ol>
	<li>SDS-PAGE i immunoblotting
	<ol>
		<li>Rozpuścić równą ilość białek EV w każdej próbce za pomocą buforu ładującego blotting (dodecylosiarczan litu) i 50 mM ditiotreitolu (DTT) w probówce o pojemności 1,6 ml. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Załaduj próbki z kroku 4.1.1 do 4–12% żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę (150 V, 35 mA) przez 35 minut.</li>
		<li>Przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu.</li>
		<li>Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Inkubować błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV, genowi podatności guza 101 (TSG101), w rozcieńczeniu 1:500 w 5% BSA w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej Tween-20 (TBST) w temperaturze 4 °C, kołysząc przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia przemyć membranę 3 razy po 10 minut każde płukanie w buforze TBST i inkubować ją z anty-króliczą IgG, przeciwciałem sprzężonym z HRP, w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj membranę 3x po 10 minut każde pranie w buforze TBST. Opracować membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP i obrazu (patrz Tabela materiałów systemu obrazowania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć EV pochodzące z BALF w 49 μl buforu barwiącego PEB (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, przefiltrowane przez membranę filtracyjną strzykawkową 0,1 μm).</li>
		<li>Dodaj każde z następujących przeciwciał do każdej pojedynczej próbki: 1) szczurze przeciwciało przeciwko mysiemu PE CD63 (100 ng na reakcję); 2) szczurzy PE CD81 przeciw myszom (500 ng); 3) szczurzy anty-mysz FITC CD9 (200 ng). Inkubować w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 60 minut w ciemności.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki 450 μl przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i poddać próbki analizie metodą cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów)25.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia cytometru przepływowego w następujący sposób: 1) ustaw wszystkie kanały w hyper log (hlog); 2) ustawić spust na SSC na 4; 3) Wyłącz dodatkowy spust. Uruchom próbki w ustawieniu niskiej prędkości i uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń w każdej próbce.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę danych z niskiej cytometrii w każdej próbce za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Secretion%2C+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li>
<li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://tcr.amegroups.com/article/view/16316/html">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li>
<li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+systems+for+exosome+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Exosome-Based+Therapeutics%3A+Isolation%2C+Heterogeneity%2C+and+Fit-for-Purpose+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium%3A+a+possible+role+in+innate+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li>
<li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li>
<li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).</li>
<li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li>
<li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
<li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li>
<li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+it+out%3A+Regulation+of+exosome+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exosome+Total+Isolation+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li>
<li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li>
<li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).</li>
<li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich kilku dekad naukowcy odkryli znaczenie pojazdów elektrycznych w homeostazie komórkowej. Co ważniejsze, EV odgrywają główną rolę w wielu procesach chorobowych, modulując sąsiednie i odległe komórki za pomocą ich bioaktywnych cząsteczek ładunkowych 1,21,22,26,27,28,29,30.<sup...

Egzosomy są najmniejszym podzbiorem EV, o średnicy 50–200 nm i mają wiele funkcji biologicznych w zróżnicowanym zakresie procesów sygnalizacyjnych1,2,3,4,5. Regulują homeostazę komórkową i tkankową przede wszystkim poprzez ułatwianie komunikacji międzykomórkowej poprzez cząsteczki ładunku, takie jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe6,7,8,9. Jednym z kluczowych etapów badań nad pojazdami elektrycznymi jest proces izolacji. Ultrawirowanie różnicowe (UC), z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości lub bez niego (DGC), jest uważane za złoty standard, ale ta metoda niesie ze sobą poważne ograniczenia, w tym nieefektywne wskaźniki odzysku EV i niską skalowalność10,11,12, które ograniczają jej najlepsze wykorzystanie do próbek o większej objętości, takich jak supernatant do hodowli komórkowych lub próbki o wysokiej produkcji egzosomów. Zalety i wady innych metod, takich jak wykluczanie wielkości za pomocą ultrafiltracji lub chromatografii, izolacja powinowactwa immunologicznego za pomocą kulek lub kolumn oraz mikrofluidyka, są dobrze opisane, a nowoczesne procedury uzupełniające zostały opracowane w celu przezwyciężenia i zminimalizowania ograniczeń technicznych w każdym podejściu11,12,13,14,15. Inni wykazali, że wirowanie ultrafiltracyjne (UFC) z nanoporowatą membraną w jednostce filtrującej jest alternatywną techniką, która zapewnia czystość porównywalną do metody UC16,17,18. Technikę tę można uznać za jedną z alternatywnych metod izolacji.
Płyn popłuczynowo-oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF) zawiera EVs, które posiadają liczne funkcje biologiczne w różnych stanach układu oddechowego19,20,21,22. Badanie EV pochodzących z BALF wiąże się z pewnymi wyzwaniami ze względu na inwazyjność procedury bronchoskopii u ludzi, a także ograniczoną ilość odzyskiwania płynu z płukania. U małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, tylko kilka mililitrów można odzyskać w normalnych warunkach płuc, a jeszcze mniej w płucach objętych stanem zapalnym lub zwłóknieniowym23. W związku z tym zebranie wystarczającej ilości BALF do izolacji pojazdów elektrycznych za pomocą ultrawirowania różnicowego do dalszych zastosowań może nie być wykonalne. Jednak wyizolowanie prawidłowych populacji EV jest kluczowym czynnikiem w badaniu funkcji biologicznych EV. Delikatna równowaga między wydajnością a skutecznością nadal stanowi wyzwanie w dobrze znanych metodach izolacji pojazdów elektrycznych.
W tym obecnym badaniu wykazujemy, że ultrafiltracja odśrodkowa, wykorzystująca nanomembranowy filtr o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO), jest odpowiednia dla próbek biologicznych o małej objętości, takich jak BALF. Technika ta jest prosta, wydajna i zapewnia wysoką czystość i skalowalność, aby wspierać badanie pojazdów elektrycznych pochodzących z BALF.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Ultracel-100K</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International, Prospect, IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td></td><td>MKCD9753 Gradient gęstości Średnia</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>VetOne, Boise, ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Strzykawka, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Angiocewnik 20 g</td><td>BD Strzykawka, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Test białka kwasu bicunchonowego (BCA)</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom TSG101</td><td>królika AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało anty-mysie PE-CD63 Biolegend</td><td>, San Diego, Kalifornia</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP</td><td>, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Środek redukujący (Bolt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor do lizy (Bolt)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus żel akrylamidowy</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Mini stosy nitrocelulozy</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescencyjny odczynnik do wykrywania przeciwciał HRP HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek 17 ml</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Corning SFCA 0,2 i mikro; m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf, Hamburg,</td> <td>Niemcy-Ultrawirówka</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(NS300)</td><td>Malvern, Worcestershire, Wielka</td> <td>Brytania-Do</td> <td>pomiaru rozkładu wielkości cząstek i stężenie cząstek</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 cytometr przepływowy</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,</td> <td>Niemcy-iBlot</td><td></td></tr> <tr><td>Aparat do przenoszenia</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChemiDoc MP System obrazowania</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr></tbody></table>

izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nowo odkryte subkomórkowe składniki, które odgrywają ważną rolę w wielu biologicznych funkcjach sygnalizacyjnych podczas stanów fizjologicznych i patologicznych. Izolacja pojazdów elektrycznych nadal stanowi poważne wyzwanie w tej dziedzinie, ze względu na ograniczenia nieodłącznie związane z każdą techniką. Ultrawirowanie różnicowe z metodą wirowania w gradionym gradimencie gęstości jest powszechnie stosowanym podejściem i jest uważane za złoty standard procedury izolacji EV. Jednak procedura ta jest czasochłonna, pracochłonna i zazwyczaj skutkuje niską skalowalnością, co może nie być odpowiednie w przypadku próbek o małej objętości, takich jak płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Wykazaliśmy, że metoda izolacji wirowania ultrafiltracji jest prosta, efektywna czasowo i pracochłonnie, a jednocześnie zapewnia wysoką wydajność i czystość odzysku. Proponujemy, aby ta metoda izolacji mogła być alternatywnym podejściem, które jest odpowiednie do izolacji EV, szczególnie w przypadku próbek biologicznych o małej objętości.

Przeprowadziliśmy izolację EV z płynu z przemywania dróg oddechowych (BALF) myszy przy użyciu metod izolacji UFC oraz UC-DGC tego samego dnia. Metoda UFC wymagała około 2,5–3 h, podczas gdy technika UC-DGC wymagała 8 h czasu przetwarzania. Czas ten nie obejmował przygotowania buforów i odczynników. Należy zauważyć, że podczas długich okresów wirowania można było wykonywać inne zadania. Niemniej jednak, w przypadku techniki izolacji UC-DGC cały proces trwał prawie cały dzień.
<p class=...

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu problemów związanych ze skutecznością, wydajnością odzysku i czystością pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych przy użyciu podejścia wirowania ultrafiltracyjnego. Bezpośrednio porównaliśmy tę technikę z techniką ultrawirowania i oczyszczania w gradieniu gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, wydajna i odpowiednia dla próbek o małej objętości, takich jak mysi płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.Co ważniejsze, zapewnia wysoką czystość i znacznie wyższą skalowalność w porównaniu z metodą izolacji ultrawirowania. Procedurę zademonstruje pan Norman Garrett III, pracownik naukowy mojego laboratorium. Na początek włóż angiocewnik o rozmiarze 22 do tchawicy myszy poddanej eutanazji.Podłącz strzykawkę z insuliną z jednym mililitrem lodowatego sterylnego DPBS i wkropl jeden mililitr do obu płuc. Powoli wyjmować tłok strzykawki w celu pobrania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub płynu BAL. I dozować płyn BAL do stożkowej rurki na lodzie.Następnie wyciągnij płyn BAL z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy. Odwirować płyn BAL o temperaturze 400 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i odwirować go w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie zebrać supernatant i natychmiast przejść do etapów izolacji EV. Najpierw przefiltruj super natant przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra. Następnie zrównoważyć filtr odśrodkowy sterylnym DPBS przez 10 minut.Następnie odwirować jednostkę odśrodkową w temperaturze 15 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Napełnij filtr 15 mililitrami płynu BAL. I odwirować go w temperaturze 3000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przemyć retentat 14 mililitrami sterylnego DPBS, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą w temperaturze 3 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć DPBS i stężyć retentat. Aby zebrać skoncentrowane EV pochodzące z płynu BAL, włóż pipeter do dolnej części jednostki filtrującej i wyjmij próbkę ruchem zamiatania na boki.Następnie podwielokrotnie EV pochodzące z płynu BAL i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Alternatywnie, zacznij od przeniesienia poprzednio nabytego supernatantu do probówki ultrawirówkowej. I odwirować go w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie zebrać supernatant i odwirować. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulat EV w 200 mikrolitrach DPBS. Następnie wymieszaj zawieszenie EV z 300 mikrolitrami 50% roztworu roboczego joduksanolu.I przenieś go do 15-mililitrowej probówki ultrawirówkowej. Następnie dodaj roztwór buforowy zgodnie z protokołem tekstowym, aby utworzyć gradient gęstości wyporu i odwiruj go w temperaturze 100 000 G przez trzy godziny i 50 minut. Zbierz 15% i 25% frakcje jodiksanolu i rozcieńcz je w DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 mililitrów.Przenieś frakcje do nowej probówki ultrawirówki i odwiruj w temperaturze 100 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 mikrolitrach sterylnego DPBS. Aby rozpocząć analizę śledzenia nanocząstek, rozcieńczyć próbkę EV w jednym mililitrze DPBS.I załaduj próbkę do strzykawki insulinowej. Następnie podłącz strzykawkę do pompy strzykawkowej i zmierz liczbę cząstek oraz rozmiar. Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na jeden.Następnie użyj czytnika płytek, aby określić ilościowo ilość białka w próbce EV za pomocą detekcji kolorymetrycznej. Rozpuścić równą ilość białka EV z każdej próbki za pomocą buforu ładującego blotting i DTT. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.Załaduj próbki do żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę przez 35 minut. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu. Następnie zablokuj membranę pięcioprocentowym odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, delikatnie kołysząc.Inkubuj błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc przez noc. Opracuj błonę, inkubując błonę z przeciwciałem łączącym HRP przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć membranę przez 10 minut trzykrotnie buforem TBST.Na koniec opracuj membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP przed przystąpieniem do obrazowania. Aby rozpocząć cytometrię przepływową, rozcieńczyć EV pochodzące z płynu BAL w 49 mikrolitrach buforu barwiącego PEB. Następnie dodaj trzy przeciwciała do każdej z próbek, a następnie inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem przez 60 minut w ciemności.Na koniec rozcieńczyć próbki 40 mikrolitrami przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej. W tym protokole EV wyizolowano z mysiego płynu BAL przy użyciu metod UFC i UC-DGC. EV pochodzące z płynu BAL od normalnych myszy wyizolowanych metodą UFC wykazywały mniejsze rozmiary i bardziej równomierny rozkład rozmiarów niż UC-DGC-EV.Technika UFC miała również znacznie wyższą całkowitą liczbę cząstek w porównaniu z techniką UC-DGC. Całkowite odzysk białka mierzony w miligramach UFC-EV był również wyższy niż w UC-DGC-EV, co wskazuje, że technika UFC jest bardziej efektywna pod względem czasu i wysiłku. Wreszcie, EV pochodzące z płynu BAL zostały również dodatkowo scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej.Zarówno UFC-EV, jak i UC-DGC-EV wyrażały CD63, CD9 i CD81. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ponownym nawodnieniu membrany jednostki ultrafiltracji za pomocą DPBS. Po nawodnieniu membrany urządzenie musi być przez cały czas mokre, aż do użycia.Pobieranie retentatu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z jednostki filtrującej może być trudne. Upewnij się, że końcówka pipety jest przesunięta na boki, aby odzyskać większość EV z jednostki filtrującej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się izolacją pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do zbadania funkcji biologicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach u małych zwierząt.

isolation-extracellular-vesicles-from-murine-bronchoalveolar-lavage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Naucz się izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu wirowania ultrafiltracji. Ta metoda zapewnia wyższą czystość i skalowalność w porównaniu z tradycyjną ultrawirowanią.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Przeglądaj więcej filmów