Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji
9 listopada 2018
Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.
Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu problemów związanych ze skutecznością, wydajnością odzysku i czystością pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych przy użyciu podejścia wirowania ultrafiltracyjnego. Bezpośrednio porównaliśmy tę technikę z techniką ultrawirowania i oczyszczania w gradieniu gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, wydajna i odpowiednia dla próbek o małej objętości, takich jak mysi płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
Co ważniejsze, zapewnia wysoką czystość i znacznie wyższą skalowalność w porównaniu z metodą izolacji ultrawirowania. Procedurę zademonstruje pan Norman Garrett III, pracownik naukowy mojego laboratorium. Na początek włóż angiocewnik o rozmiarze 22 do tchawicy myszy poddanej eutanazji.
Podłącz strzykawkę z insuliną z jednym mililitrem lodowatego sterylnego DPBS i wkropl jeden mililitr do obu płuc. Powoli wyjmować tłok strzykawki w celu pobrania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub płynu BAL. I dozować płyn BAL do stożkowej rurki na lodzie.
Następnie wyciągnij płyn BAL z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy. Odwirować płyn BAL o temperaturze 400 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i odwirować go w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie zebrać supernatant i natychmiast przejść do etapów izolacji EV. Najpierw przefiltruj super natant przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra. Następnie zrównoważyć filtr odśrodkowy sterylnym DPBS przez 10 minut.
Następnie odwirować jednostkę odśrodkową w temperaturze 15 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Napełnij filtr 15 mililitrami płynu BAL. I odwirować go w temperaturze 3000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przemyć retentat 14 mililitrami sterylnego DPBS, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą w temperaturze 3 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć DPBS i stężyć retentat. Aby zebrać skoncentrowane EV pochodzące z płynu BAL, włóż pipeter do dolnej części jednostki filtrującej i wyjmij próbkę ruchem zamiatania na boki.
Następnie podwielokrotnie EV pochodzące z płynu BAL i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Alternatywnie, zacznij od przeniesienia poprzednio nabytego supernatantu do probówki ultrawirówkowej. I odwirować go w temperaturze 10 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie zebrać supernatant i odwirować. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulat EV w 200 mikrolitrach DPBS. Następnie wymieszaj zawieszenie EV z 300 mikrolitrami 50% roztworu roboczego joduksanolu.
I przenieś go do 15-mililitrowej probówki ultrawirówkowej. Następnie dodaj roztwór buforowy zgodnie z protokołem tekstowym, aby utworzyć gradient gęstości wyporu i odwiruj go w temperaturze 100 000 G przez trzy godziny i 50 minut. Zbierz 15% i 25% frakcje jodiksanolu i rozcieńcz je w DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 mililitrów.
Przenieś frakcje do nowej probówki ultrawirówki i odwiruj w temperaturze 100 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 mikrolitrach sterylnego DPBS. Aby rozpocząć analizę śledzenia nanocząstek, rozcieńczyć próbkę EV w jednym mililitrze DPBS.
I załaduj próbkę do strzykawki insulinowej. Następnie podłącz strzykawkę do pompy strzykawkowej i zmierz liczbę cząstek oraz rozmiar. Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na jeden.
Następnie użyj czytnika płytek, aby określić ilościowo ilość białka w próbce EV za pomocą detekcji kolorymetrycznej. Rozpuścić równą ilość białka EV z każdej próbki za pomocą buforu ładującego blotting i DTT. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Załaduj próbki do żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę przez 35 minut. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu. Następnie zablokuj membranę pięcioprocentowym odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, delikatnie kołysząc.
Inkubuj błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc przez noc. Opracuj błonę, inkubując błonę z przeciwciałem łączącym HRP przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć membranę przez 10 minut trzykrotnie buforem TBST.
Na koniec opracuj membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP przed przystąpieniem do obrazowania. Aby rozpocząć cytometrię przepływową, rozcieńczyć EV pochodzące z płynu BAL w 49 mikrolitrach buforu barwiącego PEB. Następnie dodaj trzy przeciwciała do każdej z próbek, a następnie inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem przez 60 minut w ciemności.
Na koniec rozcieńczyć próbki 40 mikrolitrami przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej. W tym protokole EV wyizolowano z mysiego płynu BAL przy użyciu metod UFC i UC-DGC. EV pochodzące z płynu BAL od normalnych myszy wyizolowanych metodą UFC wykazywały mniejsze rozmiary i bardziej równomierny rozkład rozmiarów niż UC-DGC-EV.
Technika UFC miała również znacznie wyższą całkowitą liczbę cząstek w porównaniu z techniką UC-DGC. Całkowite odzysk białka mierzony w miligramach UFC-EV był również wyższy niż w UC-DGC-EV, co wskazuje, że technika UFC jest bardziej efektywna pod względem czasu i wysiłku. Wreszcie, EV pochodzące z płynu BAL zostały również dodatkowo scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Zarówno UFC-EV, jak i UC-DGC-EV wyrażały CD63, CD9 i CD81. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ponownym nawodnieniu membrany jednostki ultrafiltracji za pomocą DPBS. Po nawodnieniu membrany urządzenie musi być przez cały czas mokre, aż do użycia.
Pobieranie retentatu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z jednostki filtrującej może być trudne. Upewnij się, że końcówka pipety jest przesunięta na boki, aby odzyskać większość EV z jednostki filtrującej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się izolacją pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do zbadania funkcji biologicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach u małych zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynu z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych myszy: centryfugację z ultrafiltracją oraz ultracentryfugację z centryfugacją w gradiencie gęstości. Obie metody zostały porównane pod kątem wydajności, stopnia odzysku oraz czystości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi
Wprowadzenie
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej.
- Metody izolacji wpływają na jakość i wydajność otrzymywanych pęcherzyków.
- Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego stanowi cenne źródło do badania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych związanych z płucami.
- Analiza porównawcza technik izolacji może przyczynić się do poprawy wyników badań.
Cel badania
- Ocena wydajności i skalowalności ultrafiltrowania w wirowaniu.
- Porównanie tej metody z tradycyjnymi metodami ultrawirowania.
- Ocena czystości wyizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
Zastosowane metody
- Centryfugacja ultrafiltracyjna do izolacji pęcherzyków.
- Ultrawirowanie z gradientem gęstości w celu porównania.
- Ilościowe oznaczenie i charakterystyka wyizolowanych pęcherzyków.
- Wykorzystanie próbek płynu z przepłukiwania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy.
Główne wyniki
- Centryfugacja z ultrafiltracją zapewnia wyższą czystość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Metoda ta jest bardziej skalowalna w przypadku próbek o małej objętości.
- Wydajność oraz stopień odzysku uległy znaczącej poprawie.
- Bezpośrednie porównanie podkreśla zalety względem metod tradycyjnych.
Wnioski
- Centryfugacja z ultrafiltracją stanowi skuteczną alternatywę dla izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Oferuje ona prostotę i wydajność dla badaczy.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres zastosowań tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna i skalowalna izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z małymi objętościami próbek biologicznych stanowi krytyczne wąskie gardło w badaniach nad biomarkerami i wczesnymi fazami chorób układu oddechowego. Technika ultrafiltrowania wirowego (UFC) umożliwia uzyskanie wyższej wydajności i czystości EVs z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy, co wspiera rzetelną charakterystykę w dalszych etapach analiz oraz badania translacyjne. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną i przyspiesza podejmowanie decyzji w ramach portfolio w procesach badawczo-rozwojowych skupionych na układzie oddechowym i pęcherzykach zewnątrzkomórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia wysokowydajną izolację EV do badań nad szlakami sygnalizacyjnymi w płucach opartych na hipotezach.
- Poprawia proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie czystszych populacji EV do analiz mechanistycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dzięki powtarzalnemu odzyskiwaniu EV z próbek o małej objętości.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie standaryzowanych próbek EV do ilościowych analiz następczych.
- Zwiększa powtarzalność analiz poprzez minimalizację strat próbek i zanieczyszczeń.
- Poprawia skalowalność i przepustowość w procesach przesiewowych przy użyciu ograniczonej ilości materiału biologicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wsparcie badań nad biomarkerami EV w modelach mysich istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Umożliwia niezawodną izolację EV na potrzeby badań translacyjnych nad patofizjologią płuc.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem kandydatów na biomarkery oparte na EV dzięki spójnej jakości próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda UFC integruje etapy wczesnego odkrywania i badań przedklinicznych, umożliwiając niezawodną izolację EV do dalszych analiz molekularnych, proteomicznych i funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i analizę szlaków sygnałowych poprzez dostarczanie wysokiej czystości EV z próbek o małej objętości.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe preparaty EV do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia dokładny pomiar liczby cząsteczek EV, rozkładu wielkości oraz zawartości białek na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Wspiera odkrywanie i walidację biomarkerów w mysich modelach chorób płuc.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, zestandaryzowany schemat izolacji EV, który można dostosować do różnych programów badawczych nad układem oddechowym i pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na EV.
- Wartość operacyjna: Usprawnia izolację EV dzięki lepszej standaryzacji, powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne kapitałowo rozwijanie zasobów związanych z EV.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów biomarkerów oddechowych i EV z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji EV oraz w analitycznych technikach następczych, takich jak śledzenie nanocząstek i cytometria przepływowa.
- Wymaga dostępu do urządzeń do ultrafiltracji, wirówek oraz aparatury do kwantyfikacji białek.
- Wymaga standaryzacji protokołów obsługi i przetwarzania próbek pomiędzy zespołami.
- Metoda może być dostosowana do innych biologicznych płynów o małej objętości po optymalizacji protokołu.
- Kluczowe dla maksymalizacji wydajności i czystości EV jest ostrożne obchodzenie się z membraną oraz odzyskiwanie próbek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:15
Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Preparation
2:21
Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid
4:56
Extracellular Vesicle Quantification
5:35
Detection of BALF-derived Extracellular Vesicles
7:16
Results: UFC Method Demonstrates Higher Total Particle Counts and Protein Recover
8:25
Conclusion
