Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Nasze badanie izoluje, oczyszcza i charakteryzuje bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Naszym celem jest dostosowanie separacji pojazdów typu BEV od zanieczyszczeń i zapewnienie wiarygodnej metody dla badaczy. Nasz protokół skraca czas wirowania z 18 do siedmiu godzin.

Tryb top-down poprawia separację BEV i zmniejsza zanieczyszczenie lipoproteinami. Nasza metoda upraszcza separację pojazdów typu BEV, ustanawiając standard dla przyszłych badań. Może być stosowany do innych płynów ustrojowych z odpowiednią modyfikacją, poszerzając naszą wiedzę i ułatwiając badanie pojazdów typu BEV, ujawniając ich nieodłączną heterogeniczność w ludzkim ciele.

Na początek weź przygotowane próbki kału ludzkiego. Schłodzić szybkoobrotową wirówkę z chłodzeniem do czterech stopni Celsjusza. Użyj PBS, aby dostosować wagę probówek z próbkami do 0,1 grama i odwirować je w temperaturze 3 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą plastikowej pipety przenieś supernatant do dwóch 50-mililitrowych probówek, pozostawiając jeden mililitr. Następnie odwirować supernatant w temperaturze 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 mililitrów odessać supernatant i wyjąć igłę ze strzykawki.

Przefiltruj ciecz przez filtry 0,22 mikrometra do 50-mililitrowych probówek. Następnie przetrzyj wiadro 75% alkoholem, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia. Przenieść około 30 mililitrów przefiltrowanego supernatantu kałowego do probówki ultrawirówkowej.

Napełnij probówkę około ośmioma mililitrami PBS, pozostawiając trzymilimetrową przerwę od otworu probówki. Umieść dwie probówki do ultrawirówek w przeciwległych wiadrach do ultrawirowania i wyrównaj wagę dwóch wiader za pomocą PBS. Załaduj wszystkie wiadra na wirnik, niezależnie od tego, czy są załadowane rurami.

Umieść próbki w wirówce, rozpocznij próżnię i wiruj je w temperaturze 160 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jak tylko wirowanie zakończy się odwirowywanie zwolnij próżnię w komorze i otwórz drzwiczki ultrawirówki. Następnie natychmiast wyjmij wirnik.

Przenieś wiadra z wirnika na stojak i podnieś rurki za pomocą szczypiec. Wyrzucić supernatant i zachować widoczne brązowe granulki. Dodaj jeden mililitr wstępnie schłodzonego PBS, aby całkowicie zawiesić granulki.

Napełnij probówkę około 37 mililitrami PBS, pozostawiając trzymilimetrową przerwę od otworu. Po wykonaniu kolejnej rundy ultrawirowania wyrzucić supernatant i pozostawić probówkę odwróconą do góry dnem na pięć minut. Usuń pozostały roztwór z wewnętrznej ściany za pomocą wycieraczek.

Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, dodaj 1,2 mililitra wstępnie schłodzonego PBS w celu ponownego zawieszenia granulek i wymieszaj je przez pipetowanie. Przenieś 1,2 mililitra roztworu PBS BEV z jednej probówki ultrawirówki do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Na początek weź 500 mikrolitrów przygotowanego roztworu PBS BEV.

Połącz go z trzema mililitrami PBS i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Umieść 31-mililitrową probówkę ultrawirówki na piankowej płytce z otworami i oznacz probówkę strzałką w dół. Następnie trzymaj pionowo pipetę o pojemności 1 000 mikrolitrów i dodaj trzy mililitry 50% roztworu jodiksanolu na dno probówki.

Umieść uchwyt na rurkę nieco powyżej poziomu płytki piankowej poniżej otworu rurki i przechyl rurkę pod kątem 70 stopni. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj trzy mililitry 40% roztworu jodu na 50% roztwór jodu. Następnie nałóż trzy mililitry 20% roztworu jodiksanolu na 40% roztwór jodiksanolu.

Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj trzy mililitry 10% roztworu jodiksanolu na przygotowany 20% roztwór jodiksanolu. Następnie dodaj 3,5 mililitra roztworu PBS BEV na 10% roztwór jodiksanolu i delikatnie ustaw probówki w pozycji pionowej. Teraz umieść 31-mililitrową probówkę ultrawirówki na piankowej płytce z otworami i oznacz ją strzałką w górę.

Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj pionowo 2,5 mililitra 60% roztworu podstawowego jodiksanolu na dno probówki i połącz go z 500 mikrolitrami roztworu PBS BEV, aby uzyskać trzy mililitry 50% roztworu jodiksanolu BEV. Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując. Następnie, po ułożeniu kolejno 40, 20 i 10% roztworu jodu, użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby dodać 3,5 mililitra PBS na wierzch 10% roztworu jodu.

Dostosuj wagę dwóch probówek z PBS do całkowitej wagi w zakresie plus/minus 0,005 grama. Następnie umieść probówki w wiadrach i odwiruj je w temperaturze 160 000 G przez siedem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipetora zbierz frakcje uzyskane w trybie ultrawirowania gradientowego sekwencyjnie od góry do dołu względem ściany bocznej do 10 oddzielnych probówek ultrawirówek o pojemności 38,5 mililitra.

Następnie ultraodwirować frakcje w temperaturze 160 000G przez 70 minut w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant i odwrócić probówki ultrawirówkowe na pięć minut. Następnie ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach wstępnie schłodzonego PBS za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Przenieś roztwór PBS BEV do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Oznaczyć frakcje od F1 do F10 jako uzyskane z jednego gradientowego trybu ultrawirowania i przystąpić do analizy.