Name: Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Protokół skraca czas wirowania i poprawia separację od zanieczyszczeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); kluczowy projekt Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82230080); Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFA1300604); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (81871735, 82272438 i 82002245); Fundusz Nauk Przyrodniczych Guangdong dla wybitnych młodych uczonych (2023B1515020058); Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong (2021A1515011639);Główny Państwowy Program Rozwoju Badań Podstawowych Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong w Chinach (ZR2020ZD11); Fundacja Naukowa z tytułem doktora (2022M720059); Wybitny Program Rozwoju Młodzieży Szpitala Nanfang Południowego Uniwersytetu Medycznego (2022J001).

Enhanced Bacterial Extracellular Vesicles Isolation for Microbiota Multi-Omics

<ol><li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+gut+microbiome+in+health%3A+establishment+and+resilience+of+microbiota+over+a+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime.</a> Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).</li>
<li>de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+and+health%3A+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome and health: mechanistic insights.</a> Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).</li>
<li>Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome%3A+New+biomarkers+in+early+screening+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).</li>
<li>Paik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+bacteria+produce+%CE%A4%28%CE%97%2917-modulating+bile+acid+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites.</a> Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).</li>
<li>Parada Venegas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+%28SCFAs%29-mediated+gut+epithelial+and+immune+regulation+and+its+relevance+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).</li>
<li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut+microbiota+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">The Gut microbiota and Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota-brain+axis+in+behaviour+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+and+Gram-positive+bacterial+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tremendous+biomedical+potential+of+bacterial+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).</li>
<li>Coumans, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+extracellular+vesicle+isolation+methods+from+human+stool+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).</li>
<li>Park, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+changes+in+stool%2C+saliva%2C+serum%2C+and+urine+before+and+after+anti-TNF-%CE%B1+therapy+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).</li>
<li>Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+bacterial+extracellular+vesicles+in+human+body+fluids+by+orthogonal+biophysical+separation+and+biochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization.</a> Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).</li>
<li>Tulkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+systemic+LPS-positive+bacterial+extracellular+vesicles+in+patients+with+intestinal+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction.</a> Gut. 69 (1), 191-193 (2020).</li>
<li>Kang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota%2C+especially+Akkermansia+muciniphila%2C+protect+the+progression+of+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> PloS one. 8 (10), 76520(2013).</li>
<li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+we+looking+at%3F+Extracellular+vesicles%2C+lipoproteins%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li>
<li>Correll, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+small+extracellular+vesicle+isolation+from+expressed+prostatic+secretions+in+urine+for+in-depth+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+bacterial+extracellular+vesicles%3A+important+players+in+regulating+intestinal+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment.</a> Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).</li>
<li>Alberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota+in+inflammatory+bowel+disease+and+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palacky%2C+Olomouc%2C+Czech+Republic%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).</li>
<li>Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gut+microbiota-derived+extracellular+vesicles+on+obesity+and+diabetes+and+their+potential+modulation+through+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet.</a> Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).</li>
<li>Lajqi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota-derived+small+extracellular+vesicles+endorse+memory-like+inflammatory+responses+in+murine+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils.</a> Biomedicines. 10 (2), 442(2022).</li>
<li>Lee, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+vesicle+of+gut+microbial+Paenalcaligenes+hominis+is+a+risk+factor+for+vagus+nerve-mediated+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment.</a> Microbiome. 8 (1), 107(2020).</li>
<li>Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+eukaryotic+extracellular+vesicles+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+new+players+in+the+gut-liver+axis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+enhance+tau+phosphorylation+and+contribute+to+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).</li>
<li>Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+bacterial+membrane+vesicle+production%2C+purification%2C+quantification%2C+and+examination+of+their+immunogenic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions.</a> Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).</li>
<li>Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+isolation%2C+and+characterization+of+bioengineered+bacterial+extracellular+membrane+vesicles+derived+from+Bacteroides+thetaiotaomicron+and+their+use+in+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development.</a> Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).</li>
<li>Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+isolation+of+extracellular+vesicles+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles.</a> Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).</li>
<li>Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+salivary+extracellular+vesicles+by+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+their+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stool+consistency+is+strongly+associated+with+gut+microbiota+richness+and+composition%2C+enterotypes+and+bacterial+growth+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates.</a> Gut. 65 (1), 57-62 (2016).</li>
<li>Wen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+extracellular+vesicles%3A+A+position+paper+by+the+Microbial+Vesicles+Task+Force+of+the+Chinese+Society+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles.</a> Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to dwuwarstwowe nanocząstki lipidowe wydzielane przez bakterie, przenoszące bogactwo białek, lipidów, kwasów nukleinowych i innych bioaktywnych cząsteczek, przyczyniających się do pośredniczenia w funkcjonalnym działaniu bakterii20. Udowodniono, że BEV pochodzące z jelit biorą udział w rozwoju chorób, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego, a także wpływają na ogólny metabolizm i pośredniczą w upośledzo...

Jelito jest powszechnie uznawane za narząd, w którym występuje najwięcej mikroorganizmów w ludzkim ciele, z ponad 90% bakterii biorących udział w kolonizacji i namnażaniu1,2. Liczne dowody wykazały, że mikrobiota jelitowa moduluje mikrośrodowisko jelitowe i jednocześnie oddziałuje na dysfunkcje odległych narządów, głównie poprzez uszkodzoną barierę jelitową3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na korelację między brakiem równowagi mikrobioty jelitowej a postępem nieswoistego zapalenia jelit (IBD)5,6, a także zaburzenia poznawcze na osi jelitowo-mózgowej5,6,7,8. Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) wytwarzane przez bakterie odgrywają znaczącą rolę w tych procesach patologicznych.
BEV to nanoskalowe cząsteczki zawierające pochodne bakterii, o średnicach od 20 do 400 nm. Wykazano, że ułatwiają one interakcje między bakteriami a ich organizmami gospodarza9,10. Pomimo swojej niewidoczności, cząstki te przyciągają coraz większą uwagę badaczy ze względu na ich potencjalne szerokie zastosowania jako biomarkery diagnostyczne, cele terapeutyczne i nośniki dostarczania leków11. Ludzki kał, często używany jako próbki biologiczne do badania BEV, głównie pozyskiwany z bakterii jelitowych, zawiera złożoną mieszaninę między innymi wody, bakterii, lipidów, białek, niestrawionych resztek pokarmowych i złuszczonych komórek nabłonka. Skomplikowany skład kału stanowi wyzwanie dla izolacji i czystości pojazdów typu BEV, utrudniając w ten sposób kompleksową, obiektywną i realistyczną analizę pojazdów typu BEV. W związku z tym skuteczne strategie minimalizacji zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniem komponentów i zwiększenia wydajności pojazdów typu BEV okazały się krytycznymi kwestiami wymagającymi natychmiastowej uwagi.
Istniejące strategie izolacji w dużej mierze opierają się na technikach takich jak ultraszybkie wirowanie (UC), wirowanie w gradiacji gęstości (DGC) i chromatografia wykluczania wielkości (SEC)12,13,14,15,16,17. Obecnie DGC jest jedną z najpowszechniej stosowanych metod separacji BEV, obejmującą dwa tryby sedymentacji i pływania, "Top-down" i "Bottom-up", które są określane przez początkową pozycję obciążenia próbki. Metodologie te różnicują pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od innych składników na podstawie różnic w wielkości i gęstości, uzyskując zmienną czystość i wskaźniki odzysku. Wcześniejsze badania wykazały, że strategie jednego podejścia są niewystarczające do odpowiedniego oddzielenia EV od rozpuszczalnych białek w próbkach płynów ustrojowych, takich jak lipoproteiny we krwi18 i białko Tamm-Horsfall w moczu19. Ponadto rozkład wielkości eukariotycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EEV) często pokrywa się z rozkładem wielkości BEV, co wymaga dalszych ulepszeń metodologicznych w celu optymalizacji wydajności BEV. W związku z tym postęp w badaniach nad pojazdami typu BEV zależy od opracowania skutecznych metodologii separacji i oczyszczania. Warto zauważyć, że Tulkens i wsp15 zastosowali ortogonalną strategię biofizyczną do oddzielenia kałowych pojazdów BEV od EEV, w których czas wirowania w trybie DGC typu bottom-up wynosił do 18 godzin. W przeciwieństwie do tego, to badanie skróciło go do 7 godzin, znacznie oszczędzając czas ultrawirowania gradientowego i upraszczając proces.
W obecnym badaniu, wyizolowaliśmy i oczyściliśmy kałowe BEV przy użyciu dwóch trybów DGC w zoptymalizowanych warunkach buforowych, po wzbogaceniu BEV o zakres różnicowych prędkości wirowania, od niskiej do ekstremalnie wysokiej prędkości. Oceny oparte na morfologii, wielkości cząstek i stężeniu wykazały godną pochwały wydajność tej ulepszonej metody. Badanie to może posłużyć jako podstawa dla przyszłych badań, rozszerzając ich zastosowania na szerszą dziedzinę i oferując wgląd w niejednorodność pojazdów typu BEV w ludzkim ciele. Przyczynia się również do standaryzacji technik separacji i analizy BEV.

<table><tbody><tr><td>1 % (w/v) aldehyd glutarowy (przygotowany z 2,5 % roztworu podstawowego w wodzie dejonizowanej)</td><td>ACMEC</td><td>AP1126</td><td>Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.3</td></tr><tr><td>1 % (w/v) metyloceluloza (przygotowana z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.6</td></tr><tr><td>1,5 % (m/v) octan uranylu (przygotowany z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej)</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td>Obserwacja morfologiczna dla pojazdów typu BEV wykorzystujących TEM w kroku 8.3.5</td></tr><tr><td>1000 &mu; L, 200 &mu; L, 10 i mu; L Pipeta</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313, KG1212, KG1011</td><td>Przenieść roztwór</td></tr><tr><td>5 % (w/v) roztwór albuminy surowicy bydlęcej (przygotowany z oryginalnego proszku w buforze TBST)</td><td>Fdbio science</td><td>FD0030</td><td>Stosowany w western blotting do blokowania w kroku 8.5.6</td></tr><tr><td>5 i razy bufor ładujący</td><td>Fdbio science</td><td>FD006</td><td>Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwie Coomassie na etapie 8.5.1</td></tr><tr><td>75 % (v/v) alkoholu</td><td>LIRCON</td><td>LIRCON-500 mL</td><td>Dezynfekcja powierzchni</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Rar</td><td>A8096</td><td>Zmierz wartości absorbancji&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Calnexin</td><td>Abcam</td><td>ab92573</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD9</td><td>Abcam</td><td>ab236630</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-flagelinowe</td><td>Sino Biological</td><td>40067-MM06</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Integryna beta 1</td><td>Abcam</td><td>ab30394</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-LPS</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-83152</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-LTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>MA1-7402</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-OmpA</td><td>CUSABIO</td><td>CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/</td> <td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-synteninowe</td><td>Abcam</td><td>ab133267</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TSG101</td><td>Abcam</td><td>ab125011</td><td>Western blotting (przeciwciało pierwotne)</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>ZEALWAY</td><td>GR110DP</td><td>Sterylizacja materiałów eksploatacyjnych i pożywek użytych w eksperymencie</td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL104</td><td>Zrównoważyć próbkę probówki załadowaną testem</td></tr><tr><td>PBS Kwas bicynchoninowy&nbsp;</td><td>Fdbio science</td><td>FD2001</td><td>Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td>https://app.biorender.com</td><td>Wykonaj schematyczny przebieg izolacji i oczyszczania BEV pokazany na rysunku 1</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Haier</td><td>HR1200- II B2</td><td>Wykonaj procedury dotyczące obchodzenia się z próbkami kału</td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R; Rotor F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000</td><td>Wstępny proces dla BEV (Krok 3)</td></tr><tr><td>Aparat chemiluminescencyjny</td><td>BIO-OI</td><td>OI600SE-MF</td><td>Używany w western blotting do wykrywania sygnału w Kroku 8.5.12</td></tr><tr><td>Cytacja 5</td> Detektor mikropłytek <td>BioTek</td><td>F01</td><td>do pomiaru wartości absorbancji (Krok 8.1) i fluorescencji (Rysunek 6)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipoproteina o niskiej gęstości</td><td>ACMEC</td><td>AC12038</td><td>Definicja rozkładu składników zakłócających&nbsp;</td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy</td><td>Bio-rad</td><td>1658033</td><td>Stosowany w western blotting do separacji i transferu białek na etapie 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5</td></tr><tr><td>Zestaw do ulepszonej chemiluminescencji HRP&nbsp;</td><td>Fdbio science</td><td>FD8020</td><td>Używany w western blotting do wykrywania sygnału w kroku 8.5.12</td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC8739</td><td>Izoluj pojazdy typu BEV jako kontrolę pozytywną. Protokół: Rozpuść 25 g proszku LB w 1 l wody dejonizowanej i autoklaw. Przenieś 800 &mu; L konserwowanych Escherichia coli do pożywki. Uprawiaj w 37 stopniach; C w wytrząsarce inkubatora. Następnie odwirować 3 000 i razy; g przez 20 min przy 4 stopniach; C, 12 000 i razy; g przez 30 min przy 4 stopniach; C, przefiltrować supernatant przez 0,22 &mu; m membrany i przeprowadzić ultraszybkie wirowanie przy 160 000 &; g przez 70 minut w temperaturze 4 stopni C. Osad zdefiniowany jako surowe BEV z Escherichia coli zawieszono w 1,2 ml PBS (Krok 3, 4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 ml</td><td>KIRGEN</td><td>KG2811</td> Proces <td>wstępny dla BEV (krok 3)</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia białka Feto</td><td>Absci</td><td>ab.001.50</td><td>Barwienie na niebiesko Coomassie w kroku 8.5.4</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Biosharp</td><td>BS-TFP-070B</td><td>Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3 (Blotting the solution)</td></tr><tr><td>Siatki miedziane na podłożu Formvar/Carbon&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TEM-FCF200CU50</td><td>Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3</td></tr><tr><td>Proszek HEPES</td><td>Meilunbio</td><td>MB6078</td><td>Przygotuj jodiksanolu o różnych stężeniach do wirowania w gradionym gradieniu gęstości</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Fdbio science</td><td>FDM007</td><td>Western blotting (przeciwciało wtórne)</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Fdbio nauka</td><td>FDR007</td><td>Western blotting (przeciwciało wtórne)</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>Qiangwen</td><td>DHZ-L</td><td>Uprawa Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes&handel; Delikatne chusteczki do zadań</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>Wytrzyj wewnętrzną ściankę probówki ultrawirówki w kroku 4.15</td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Hopebio</td><td>HB0128</td><td>Uprawiaj Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa (-80 &deg; C)</td> <td>Haier</td><td>DW-86L338J</td><td>Przechowuj próbki</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Alalddin</td><td>M116118</td><td>Stosowany w western blot do aktywacji membrany PVDF w kroku 8.5.5</td></tr><tr><td>Mikroprobówki 1,5 ml</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211</td><td>Odzyskaj frakcje po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości</td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2 ml</td><td>KIRGEN</td><td>KG2911</td><td>Odzysk frakcji po wirowaniu w gradifikacji gęstości</td></tr><tr><td>Mikro probówki 5 ml</td><td>BBI</td><td>F610888-0001</td><td>Odzyskiwanie frakcji po wirowaniu w gradiacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Multiskan MK3</td><td>Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2</td></tr><tr><td>Filtr miliporowy 0,22 &mu; m</td><td>Merck millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Filtracja, sterylizacja; Materiał: polieterosulfon, PES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GHTECH</td><td>1.01307.040</td><td>Roztwór do wirowania w gradiencie gęstości</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>GHTECH</td><td>1.01394.068</td><td>Roztwór wirujący w gradiencie gęstości (korekta pH)</td></tr><tr><td>Optima&trade; XPN-100</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94469</td><td>Ultrawirowanie do izolacji pojazdów typu BEV na etapie 4, 7</td></tr><tr><td>OptiPrep&trade;</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>1893</td><td>Roztwór podstawowy do wirowania w gradiacji gęstości</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Youning</td><td>CS-100</td><td>Rozpuszczanie kału w kroku 2</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Procell</td><td>PB180327</td><td>Rozpuszczanie kału w kroku 2</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267, 3120000259</td><td>Przenieś roztwór</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>ABCbio</td><td>ABC217003-4</td><td>Usunąć supernatant podczas przetwarzania wstępnego na etapie 3.4</td></tr><tr><td>Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010, IPVH00010</td><td>Stosowany w western blotting do przenoszenia białek na etapie 8.5.5</td></tr><tr><td>Prefabrykowany żel poliakrylamidowy, 4&ndash; 20% 15 dołków</td><td>ACE</td><td>F15420Gel</td><td>Stosowany w western blotting do separacji białek w kroku 8.5.2, 8.5.3</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Fdbio science</td><td>FD0040</td><td>Stosowany w western blotting na etapie 8.5.8</td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>Fdbio science</td><td>FD0672</td><td>Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwieniu Coomassie w kroku 8.5</td></tr><tr><td>Szybki roztwór do bibułowania białkami</td><td>UBIO</td><td>UW0500</td><td>Stosowany w western blotting do przenoszenia białka na kroku 8.5.5</td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti Rotor z łyżką wahadłową Beckman</td><td>Coulter</td><td>369650</td><td>Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7</td></tr><tr><td>Strzykawka 20 mL, 50 mL&nbsp;</td><td>Jetway</td><td>ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL</td><td>transferowe i usuwają supernatant w procesie wstępnego przetwarzania</td></tr><tr><td>Proszek TBS</td><td>Fdbioscience</td><td>FD1021</td><td>Używany w western blot na kroku 8.5</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>H-7650</td><td>Obserwacja morfologiczna dla BEV na kroku 8.3</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fdbio science</td><td>FD0020</td><td>Używany w western blot na kroku 8.5</td></tr><tr><td>Probówka ultrawirówkowa</td><td>Beckman</td><td>326823, 355642</td><td>Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7</td></tr><tr><td>Ultra-czysta ławka</td><td>AIRTECH</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>Zapoznaj się z procedurami dotyczącymi obchodzenia się z cieczami</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Bluepard</td><td>CU600</td><td>Używany do pomiaru zawartości białka w BEV w kroku 8.2.5</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>S/N 21-734, oprogramowanie ZetaView (wersja 8.05.14 SP7)</td><td>Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) do pomiaru wielkości cząstek i koncentracji BEV w kroku 8.4</td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to nanopęcherzyki pochodzące od bakterii, które odgrywają aktywną rolę w komunikacji bakteria-bakteria i bakteria-gospodarz, przenosząc bioaktywne cząsteczki, takie jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe odziedziczone po bakteriach rodzicielskich. Wirusy BEV pochodzące z mikrobioty jelitowej działają w obrębie przewodu pokarmowego i mogą docierać do odległych narządów, co ma istotne implikacje dla fizjologii i patologii. Badania teoretyczne, które badają rodzaje, ilości i rolę BEV pochodzących z ludzkiego kału, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia wydzielania i funkcji BEV z mikrobioty jelitowej. Badania te wymagają również ulepszenia obecnej strategii izolowania i oczyszczania pojazdów typu BEV.
To badanie zoptymalizowało proces izolacji i oczyszczania pojazdów typu BEV, ustanawiając dwa tryby wirowania w gradiacji gęstości (DGC): Top-down i Bottom-up. Wzbogacony rozkład BEV określono we frakcjach od 6 do 8 (F6-F8). Skuteczność tego podejścia oceniono na podstawie morfologii cząstek, wielkości, stężenia i zawartości białka. Obliczono wskaźniki odzysku cząstek i białek, a także przeanalizowano obecność określonych markerów w celu porównania odzysku i czystości dwóch trybów DGC. Wyniki wykazały, że tryb wirowania od góry do dołu miał niższy poziom zanieczyszczenia i osiągnął wskaźnik odzysku oraz czystość podobną do trybu oddolnego. Czas wirowania wynoszący 7 godzin był wystarczający do osiągnięcia stężenia BEV w kale wynoszącego 108/mg.
Oprócz kału, ta metoda może być stosowana do innych rodzajów płynów ustrojowych z odpowiednią modyfikacją zgodnie z różnicami w składnikach i lepkości. Podsumowując, ten szczegółowy i niezawodny protokół ułatwiłby standaryzowaną izolację i oczyszczanie pojazdów typu BEV, a tym samym położyłby podwaliny pod późniejsze analizy multiomiczne i eksperymenty funkcjonalne.

Wyznaczenie rozkładu frakcji wzbogaconych w BEV 
Aby wyznaczyć rozkład frakcji wzbogaconych w bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEVs), ustalono kontrolę ślepą do pomiaru wartości absorbancji przy OD 340 nm, a gęstość każdej frakcji obliczono na podstawie pomiarów oraz wytycznych dla jodiksanolu (Krok 8.1). Tabela 2 przedstawia wyniki gęstości, wykazując, że frakcje od F4 do F9 wykazywały gęstość w zakresie typowo powiązanym z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi. Wynik ten sugerowa...

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host ...

Nasze badanie izoluje, oczyszcza i charakteryzuje bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Naszym celem jest dostosowanie separacji pojazdów typu BEV od zanieczyszczeń i zapewnienie wiarygodnej metody dla badaczy. Nasz protokół skraca czas wirowania z 18 do siedmiu godzin.Tryb top-down poprawia separację BEV i zmniejsza zanieczyszczenie lipoproteinami. Nasza metoda upraszcza separację pojazdów typu BEV, ustanawiając standard dla przyszłych badań. Może być stosowany do innych płynów ustrojowych z odpowiednią modyfikacją, poszerzając naszą wiedzę i ułatwiając badanie pojazdów typu BEV, ujawniając ich nieodłączną heterogeniczność w ludzkim ciele.Na początek weź przygotowane próbki kału ludzkiego. Schłodzić szybkoobrotową wirówkę z chłodzeniem do czterech stopni Celsjusza. Użyj PBS, aby dostosować wagę probówek z próbkami do 0,1 grama i odwirować je w temperaturze 3 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Za pomocą plastikowej pipety przenieś supernatant do dwóch 50-mililitrowych probówek, pozostawiając jeden mililitr. Następnie odwirować supernatant w temperaturze 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 mililitrów odessać supernatant i wyjąć igłę ze strzykawki.Przefiltruj ciecz przez filtry 0,22 mikrometra do 50-mililitrowych probówek. Następnie przetrzyj wiadro 75% alkoholem, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia. Przenieść około 30 mililitrów przefiltrowanego supernatantu kałowego do probówki ultrawirówkowej.Napełnij probówkę około ośmioma mililitrami PBS, pozostawiając trzymilimetrową przerwę od otworu probówki. Umieść dwie probówki do ultrawirówek w przeciwległych wiadrach do ultrawirowania i wyrównaj wagę dwóch wiader za pomocą PBS. Załaduj wszystkie wiadra na wirnik, niezależnie od tego, czy są załadowane rurami.Umieść próbki w wirówce, rozpocznij próżnię i wiruj je w temperaturze 160 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jak tylko wirowanie zakończy się odwirowywanie zwolnij próżnię w komorze i otwórz drzwiczki ultrawirówki. Następnie natychmiast wyjmij wirnik.Przenieś wiadra z wirnika na stojak i podnieś rurki za pomocą szczypiec. Wyrzucić supernatant i zachować widoczne brązowe granulki. Dodaj jeden mililitr wstępnie schłodzonego PBS, aby całkowicie zawiesić granulki.Napełnij probówkę około 37 mililitrami PBS, pozostawiając trzymilimetrową przerwę od otworu. Po wykonaniu kolejnej rundy ultrawirowania wyrzucić supernatant i pozostawić probówkę odwróconą do góry dnem na pięć minut. Usuń pozostały roztwór z wewnętrznej ściany za pomocą wycieraczek.Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, dodaj 1,2 mililitra wstępnie schłodzonego PBS w celu ponownego zawieszenia granulek i wymieszaj je przez pipetowanie. Przenieś 1,2 mililitra roztworu PBS BEV z jednej probówki ultrawirówki do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Na początek weź 500 mikrolitrów przygotowanego roztworu PBS BEV.Połącz go z trzema mililitrami PBS i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Umieść 31-mililitrową probówkę ultrawirówki na piankowej płytce z otworami i oznacz probówkę strzałką w dół. Następnie trzymaj pionowo pipetę o pojemności 1 000 mikrolitrów i dodaj trzy mililitry 50% roztworu jodiksanolu na dno probówki.Umieść uchwyt na rurkę nieco powyżej poziomu płytki piankowej poniżej otworu rurki i przechyl rurkę pod kątem 70 stopni. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj trzy mililitry 40% roztworu jodu na 50% roztwór jodu. Następnie nałóż trzy mililitry 20% roztworu jodiksanolu na 40% roztwór jodiksanolu.Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj trzy mililitry 10% roztworu jodiksanolu na przygotowany 20% roztwór jodiksanolu. Następnie dodaj 3,5 mililitra roztworu PBS BEV na 10% roztwór jodiksanolu i delikatnie ustaw probówki w pozycji pionowej. Teraz umieść 31-mililitrową probówkę ultrawirówki na piankowej płytce z otworami i oznacz ją strzałką w górę.Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj pionowo 2,5 mililitra 60% roztworu podstawowego jodiksanolu na dno probówki i połącz go z 500 mikrolitrami roztworu PBS BEV, aby uzyskać trzy mililitry 50% roztworu jodiksanolu BEV. Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując. Następnie, po ułożeniu kolejno 40, 20 i 10% roztworu jodu, użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby dodać 3,5 mililitra PBS na wierzch 10% roztworu jodu.Dostosuj wagę dwóch probówek z PBS do całkowitej wagi w zakresie plus/minus 0,005 grama. Następnie umieść probówki w wiadrach i odwiruj je w temperaturze 160 000 G przez siedem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipetora zbierz frakcje uzyskane w trybie ultrawirowania gradientowego sekwencyjnie od góry do dołu względem ściany bocznej do 10 oddzielnych probówek ultrawirówek o pojemności 38,5 mililitra.Następnie ultraodwirować frakcje w temperaturze 160 000G przez 70 minut w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant i odwrócić probówki ultrawirówkowe na pięć minut. Następnie ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach wstępnie schłodzonego PBS za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Przenieś roztwór PBS BEV do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Oznaczyć frakcje od F1 do F10 jako uzyskane z jednego gradientowego trybu ultrawirowania i przystąpić do analizy.

isolation-purification-bacterial-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Poznaj metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Protokół skraca czas wirowania i poprawia separację od zanieczyszczeń.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Przeglądaj więcej filmów