Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak wpływ interakcji macierzy komórkowej na siarczany. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona pierwszy materiał, który dokładnie odzwierciedla natywne mikrośrodowiska biochemiczne kory nerkowej. Wyłóż kaptur do hodowli tkankowych podkładką pod spód.

Umieść jednolitrową zlewkę zawierającą mieszadło, sterylne naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 150 milimetrów i całą nerkę w kapturze. Napełnij zlewkę 500 mililitrami 1% roztworu SDS. Umieść nerkę w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej.

Usuń cały tłuszcz okołonerkowy, lekko goląc okolice torebki nerkowej skalpelem. Następnie wykonaj płytkie nacięcie o długości od 8 do 10 centymetrów w poprzek górnego końca nerki, aby otworzyć torebkę nerkową bez uszkadzania leżącej poniżej tkanki kory. Użyj dwóch klamer hemostatu, aby usunąć torebkę nerkową, odrywając ją od tkanki kory mózgowej.

Przeciąć nerkę wzdłuż płaszczyzny czołowej za pomocą skalpela wzdłuż bocznej strony nerki. Odizoluj tkankę kory z obu połówek, wycinając obszar rdzenia skalpelem. Następnie pokrój tkankę kory na 0,5 centymetra sześcienne kawałki i usuń wszelkie duże, widoczne naczynia.

Aby wyizolować macierz zewnątrzkomórkową z nerki, umieść pokrojoną w kostkę tkankę kory mózgowej w zlewce zawierającej roztwór SDS. Przykryj zlewkę autoklawowaną folią aluminiową i umieść ją na płytce mieszającej z prędkością około 400 obr./min, poza kapturem do hodowli tkankowych. Po 24 godzinach mieszania umieścić zlewkę w kapturze do hodowli tkankowych.

Dodaj sterylne sitko do komórek o średnicy 40 mikronów wykonane z siatki nylonowej. A następnie napełnij oddzielną 1000-mililitrową zlewkę 200 mililitrami wybielacza i umieść ją w kapturze do hodowli tkankowych. Roztwór SDS przelać przez sitko do komórek do zlewki zawierającej wybielacz.

Odpipetować pozostały roztwór SDS, aż w zlewce pozostanie tylko pozbawiona komórek tkanka i sitko do komórek. Pozostaw sitko do komórek w zlewce i dodaj 500 mililitrów świeżego roztworu SDS. Przykryj zlewkę tą samą folią aluminiową i umieść na talerzu mieszającym z tą samą prędkością co poprzednio.

Po decelularyzacji i umyciu przenieś zdecelularyzowaną tkankę, zwaną od tego momentu ECM nerki, do 30-mililitrowej wolnostojącej stożkowej rurki. I napełnij go wodą klasy hodowli komórkowej, aż cała tkanka zostanie zanurzona. Najpierw użyj homogenizatora tkankowego do homogenizacji ECM nerki w stożkowej probówce przez dwie minuty, aż do uzyskania nieprzezroczystego roztworu bez widocznych kawałków ECM.

Następnie zanurz stożkową rurkę zawierającą ECM nerki w ciekłym azocie, aż wrzenie otaczające rurkę przestanie się utrzymywać. Przechowuj ECM nerki w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby liofilizować zamrożoną tkankę pozbawioną komórek, lekko poluzuj stożkową nasadkę rurki, aby umożliwić wymianę gazową, i umieść probówkę w maszynie do liofilizacji.

Liofilizuj ECM nerki przez trzy dni lub do momentu, gdy będzie przypominać drobny, biały proszek. Aby chemicznie strawić i rozpuścić żel, dodaj starannie zważoną pepsynę żołądkową świń i 0,01 normalnego kwasu solnego do scyntylacyjnego środka zawierającego mieszadło. Mieszaj z prędkością około 500 obr./min, aż cała pepsyna się rozpuści.

Następnie przenieś liofilizowany ECM nerki do scyntylacji vile i pozostaw roztwór na płytce mieszającej z prędkością około 500 obr./min na trzy dni, aby uzyskać podstawowy hydrożel ECM nerki. W kapturze do hodowli tkankowej odpipetuj wymagane objętości pożywki do hodowli komórkowych, jednego normalnego wodorotlenku sodu i suplementu M199, do sterylnej 30-mililitrowej, wolnostojącej stożkowej probówki. Wymieszaj roztwór odczynnika neutralizującego za pomocą mikroszpatułki.

Użyj sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby przenieść odpowiednią objętość podstawowego hydrożelu ECM nerki do roztworu odczynnika neutralizującego. Za pomocą mikroszpatułki delikatnie wymieszaj roztwór, aż do uzyskania jednorodnego w kolorze roztworu hydrożelu. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, mieszając powoli i delikatnie.

Aby włączyć komórki do hydrożelu ECM nerki, należy ponownie zawiesić trzysta tysięcy komórek w 10 mikrolitrach pożywki na każdy hydrożel. Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do końcowego żelu ECM nerki. Mieszaj roztwór mikroszpatułką, aż komórki zostaną równomiernie rozprowadzone.

Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby napełnić żądane urządzenie do hodowli komórkowej hydrożelem ECM nerki. Pozostaw żel do zastygnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę przed przeniesieniem lub posianiem komórek do ECM nerki w urządzeniu do hodowli komórkowej. Analiza pozbawionej komórek tkanki kory mózgowej za pomocą spektrometrii mas ujawniła obecność białek związanych z blaszką bazylii, przy czym kolagen-IV i kolagen-I są najsilniej reprezentowane.

Zachowano łańcuchy kolagenu IV, A1 i A2, wszechobecne we wszystkich błonach podstawnych. Wykryto również łańcuchy kolagenu IV, A3 i A5, obecne tylko w błonach podstawnych kłębuszków nerkowych. Wykryto również powszechne formy iso Laminin i Collagen-I.

Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego okołokanalikowego nerki lub HKMEC, hodowane na kolagenie I, ECM nerki i żelu z mieszaniną 1:1, wykazały różnice w fenotypie. HKMEC hodowane na Collagen-I, wykazywały jednolitą ekspresję CD31, widoczną na czerwono. Podczas gdy HKMEC hodowane na dwóch żelach zawierających ECM nerki wykazywały zmniejszoną ekspresję CD31 w nierównomiernym rozmieszczeniu.

Wydaje się, że typ matrycy nie wpływa na ekspresję VWF, pokazany na zielono. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o pełnej homogenizacji pozbawionej komórek tkanki kory nerkowej. Ponadto podczas mieszania żelu z odczynnikami neutralizującymi należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Systemy mikrofizjologiczne pozwalają na badanie funkcji narządów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Stworzenie takich systemów wymaga implementacji komórek, matryc i bodźców. Wyprodukowany tutaj hydrożel kECM pozwoli nam na badanie takich układów, które rekapitulują mikrośrodowiska nerkowe.