Name: Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj protokół wytwarzania hydrożelu z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej, który zachowuje rodzimy skład biochemiczny. Ta metoda wspiera badania nad regeneracją tkanek nerkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lynn and Mike Garvey Imaging Laboratory w Instytucie Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej oraz LifeCenter NorthWest. Chcieliby również podziękować za wsparcie finansowe w postaci grantów National Institutes of Health, UH2/UH3 TR000504 (dla J.H.) i DP2DK102258 (dla Y.Z.), stypendium szkoleniowego NIH T32 DK0007467 (dla R.J.N.) oraz nieograniczonego daru od Northwest Kidney Centers dla Instytutu Badań nad Nerkami.

Ludzkie nerki zostały wyizolowane przez LifeCenter Northwest zgodnie z wytycznymi etycznymi ustanowionymi przez Association of Organ Procurement Organizations. Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i hodowli komórkowych określonymi przez University of Washington.
1. Przygotowanie tkanki ludzkiej nerki
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu do decelularyzacji
	<ol>
		<li>Sterylizować zlew o pojemności 50 mL oraz mieszadło magnetyczne 70 x 10 mm.</li>
		<li>W zlewie przygotować roztwór dodecylosiarczanu sodu (SDS) w stężeniu 1:10 (masa:objętość) w autoklawowanej wodzie dejonizowanej. Pozostawić roztwór na mieszadle magnetycznym przy prędkości ok. 20 rpm przez 24 h lub do całkowitego rozpuszczenia SDS. 
		Uwaga: Zazwyczaj 250 mL 1% roztworu SDS wystarcza do decelularyzacji jednej ludzkiej nerki.</li>
		<li>Przenieść roztwór do sterylnego filtra próżniowego 50 mL i przefiltrować go do sterylnych, szczelnych pojemników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka tkanki nerkowej
	<ol>
		<li>Umyć i autoklawować pęsetę, dwa zaciski hemostatyczne, nożyce ogólnego przeznaczenia, dwa uchwyty do ostrzy skalpela, zlew 10 mL przykryty folią aluminiową oraz mieszadło magnetyczne 36 x 9 mm.</li>
		<li>Wyłożyć dywanik chłonny w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Umieścić w komorze zlew, sterylnąy naczynie do hodowli tkankowej (150 x 25 mm) oraz cały organ nerki. Napełnić zlew 50 mL 1% roztworu SDS. 
		Uwaga: Ludzkie nerki otrzymano w lodu z LifeCenter NorthWest.</li>
		<li>Umieścić nerkę w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej (Rysunek 1A). Usunąć całą tkankę tłuszczową okołonerkową, delikatnie zeskrobując ją wokół torebki nerki za pomocą skalpela (Rysunek 1B).</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonać płytkie nacięcie o długości 8-10 cm w górnej części nerki, na tyle głębokie, aby przerwać ciągłość torebki nerkowej, ale nie uszkodzić leżącej pod nią tkanki kory. Usunąć torebkę nerkową, oddzielając ją od tkanki kory za pomocą dwóch zacisków hemostatycznych (Rysunek 1C).</li>
		<li>Przeciąć nerkę wzdłuż płaszczyzny czołowej, prowadząc skalpel wzdłuż bocznej strony nerki (Rysunek 1D). Wyizolować tkankę kory z obu połówek, wycinając region rdzeniowy skalpelem (Rysunek 1E), a następnie pokroić tkankę kory na kawałki o objętości 0,5 cm3 (Rysunek 1F). Usunąć wszystkie duże widoczne naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej
	<ol>
		<li>W komorze do hodowli tkankowej napełnić zlew 10 mL 50 mL 1% roztworu SDS. Umieścić pokrojoną tkankę kory oraz mieszadło magnetyczne w zlewie z roztworem SDS. Przykryć zlew autoklawowaną folią aluminiową i umieścić na mieszadle magnetycznym przy prędkości ok. 40 rpm poza komorą do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Po 24 h przetrzymywania tkanki kory na mieszadle, przenieść zlew do komory do hodowli tkankowej i dodać sterylne sitko komórkowe 40 µm wykonane z nylonowej siatki. Napełnić osobny zlew 10 mL 20 mL wybielacza i umieścić go w komorze do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Odessać roztwór SDS przez sitko komórkowe do zlewu z wybielaczem. Odessać cały roztwór SDS, aż w zlewie pozostanie jedynie decelularyzowana tkanka i sitko komórkowe. 
		Uwaga: Sitko komórkowe powinno zapobiegać usuwaniu tkanki podczas aspiracji roztworu.</li>
		<li>Pozostawić sitko komórkowe w zlewie i napełnić go 500 mL świeżego roztworu SDS. Przykryć zlew tą samą folią aluminiową i umieścić na mieszadle magnetycznym z taką samą prędkością jak poprzednio.</li>
		<li>Powtarzać kroki 1.3.1-1.3.3 co 24 godziny ze świeżym roztworem SDS przez łącznie pięć dni.</li>
		<li>Płukać decelularyzowaną tkankę autoklawowaną wodą DI co 24 h przez łącznie 3 dni, stosując technikę opisaną w krokach 1.3.1-1.3.3.</li>
		<li>Płukać decelularyzowaną tkankę wodą klasy do hodowli komórkowych co 24 h przez łącznie 2 dni, stosując technikę opisaną w krokach 1.3.1-1.3.3.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.3.1-1.3.2. Przenieść decelularyzowaną tkankę (od tego momentu określaną jako kECM) do 30 mL samostojącej probówki stożkowej i napełnić ją wodą klasy do hodowli komórkowych tak, aby cała tkanka była zanurzona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu zapasu hydrożelu
<ol>
	<li>Mechaniczne przetwarzanie tkanki decelularyzowanej
	<ol>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy mechanicznie zhomogenizować kECM w probówce stożkowej za pomocą homogenizatora do tkanek przez 2 min. 
		Uwaga: Zhomogenizowana kECM powinna przypominać nieprzezroczysty roztwór bez widocznych fragmentów ECM.</li>
		<li>Zanurz probówkę stożkową zawierającą kECM w ciekłym azocie, aż do momentu ustania wrzenia wokół probówki. Przechowuj kECM w temperaturze -4 ˚C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liofilizacja zamrożonej tkanki zdecelularyzowanej
	<ol>
		<li>Lekko poluzować zakrętkę probówki stożkowej, aby umożliwić wymianę gazową, a następnie umieścić probówkę w liofilizatorze. Liofilizować kECM przez trzy dni lub do momentu, aż przyjmie postać drobnego białego proszku. Przechowywać w temperaturze -4 ˚C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemiczna digestia i solubilizacja żelu
	<ol>
		<li>Zautoklawować fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 ml wraz z nakrętką, mieszadło magnetyczne o wymiarach 15,9 x 7,9 mm oraz jedną parę pęset z cienkimi końcówkami.</li>
		<li>Zważ liofilizowaną kECM i oblicz objętość HCl oraz masę pepsyny niezbędną do rozpuszczenia kECM w celu przygotowania roztworu o stężeniu 3% (30 mg/ml), korzystając z następujących równań, gdzie mpepsyna masa pepsyny, mtkanka jest masą liofilizowanego tkanki, a VHCl objętość 0,01 N HCl wynosi: 
		<img alt="Równanie pomiaru pepsyny, \(m_{pepsin}(mg)=\frac{m_{tissue}(mg)}{10}\); wzór w badaniu biochemicznym." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		<img alt="Wzór na objętość kwasu solnowodoru, \(V_{HCl}\), stosowany w analizie tkanek; równanie w mililitrach." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza do fiolki scyntylacyjnej należy dodać pepsynę żołądkową wieprzową, 0,01 N HCl oraz mieszadło magnetyczne, a następnie pozostawić na mieszalce magnetycznej przy prędkości około 50 obr./min aż do całkowitego rozpuszczenia pepsyny. Następnie należy przenieść liofilizowaną kECM do fiolki scyntylacyjnej i pozostawić roztwór na mieszalce magnetycznej przy prędkości około 50 obr./min przez trzy dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Żelowanie hydrożelu
<ol>
	<li>Przygotowanie hydrożelu z macierzy pozakomórkowej (ECM) nerki
	<ol>
		<li>Przeprowadź żelowanie hydrożelu poprzez zmieszanie roztworu zapasu hydrożelu kECM z 1 N NaOH, 10-krotnym suplementem do pożywki (M19) oraz pożywką do hodowli komórek. Wszystkie roztwory należy przechowywać w lodzie. 
		Uwaga: Do hodowli komórkowej zastosowano końcowe stężenia żelu wynoszące 7,5 mg/ml. Do przedstawionych eksperymentów z hodowlą komórkową wystarczyła ilość 1 ml żelu kECM.</li>
		<li>Wyznacz objętość otrzymanego żelu kECM zdatnego do użycia oraz objętość wymaganego hydrożelu kECM z zapasu, korzystając z poniższego równania, gdzie Vostateczny czy objętość wytworzonego żelu, Vroztwór zapasowy kECM potrzebna objętość roztworu gęstego hydrożelu kECM, Croztwór stokowy kECM jest stężeniem roztworu zapasowego hydrożelu kECM, a Costateczny jaka jest koncentracja końcowego żelu: 
		<img alt="Równanie stężenia roztworu, wzór V_stock=C_final*V_final/C_stock, schemat chemiczny." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Wyznaczyć objętość niezbędnych odczynników neutralizujących, korzystając z poniższych równań, gdzie VNaOH jest objętość 1 N NaOH, V10X czy objętość suplementu do pożywki M19 10X wynosi, i V1X objętość pożywki hodowlanej wynosi: 
		<img alt="Wzór na równowagę statyczną, równanie chemiczne V_NaOH=0.02*V_stock kECM, analiza edukacyjna." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
		<img alt="Równanie rozcieńczenia V&lt;sub&gt;10X&lt;/sub&gt;=0,1*V&lt;sub&gt;stock&lt;/sub&gt; do przygotowywania buforów, wzór chemiczny." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> 
		<img alt="Równanie bilansu objętości dla przygotowywania roztworów chemicznych, obejmujące V1X, Vfinal i VstockKECM." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"></li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść pipetą odczynniki neutralizujące (NaOH, M19 oraz pożywkę do hodowli komórkowej) do sterylnej, samostojącej probówki stożkowej o pojemności 30 ml. Wymieszać roztwór odczynnika neutralizującego za pomocą mikrospatułki.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej strzykawki o objętości 1 ml przenieś odpowiednią objętość roztworu stokowego hydrożelu kECM do roztworu odczynnika neutralizującego. Użyj mikroszpatułki, aby delikatnie wymieszać roztwór, aż do uzyskania jednorodnego pod względem koloru roztworu hydrożelu. 
		Uwaga: Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, należy mieszać roztwór powoli i delikatnie.</li>
		<li>Aby włączyć komórki do hydrożelu kECM, należy odjąć 10 µL pożywek do hodowli komórkowych (V1X) z obliczeń objętości roztworu neutralizującego w kroku 3.1.1.3.
		<ol>
			<li>Resuspender komórki w 10 µL pożywek do hodowli komórkowej. Wyznaczyć liczbę komórek do zawieszenia, korzystając z następującego równania, gdzie #komórki oznacza liczbę komórek do zawieszenia oraz Vostateczny czy objętość otrzymanego żelu wynosi: 
			<img alt="Równanie liczby komórek, \( \#komórek = 30 0 \frac{komórek}{mL} \times V_{końcowe}(mL) \); obliczenia według wzoru." src="/files/ftp_upload/58314/58314eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 7"> 
			Uwaga: 30 0 komórek/ml to stężenie komórek zastosowane w żelu kECM.</li>
			<li>Pipetuj 10 µL zawiesiny komórkowej do końcowego żelu kECM po zmieszaniu roztworu zapasowego kECM z roztworem odczynnika neutralizującego. Mieszać roztwór mikroszpatułką aż do równomiernego rozłożenia komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając strzykawki o pojemności 1 ml, napełnij wybrany aparat do hodowli komórek hydrożelem kECM.</li>
	<li>Pozostawić żel do stężenia w temperaturze 37 ˚C przez 1 h przed przeniesieniem lub wysianiem komórek.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Matryce dostarczają ważnych wskazówek mechanicznych i chemicznych, które regulują zachowanie komórki. Syntetyczne hydrożele są w stanie wspierać złożone trójwymiarowe wzory, ale nie zapewniają różnorodnych sygnałów zewnątrzkomórkowych występujących w mikrośrodowiskach macierzy fizjologicznej. Hydrożele pochodzące z natywnego ECM są idealnymi materiałami zarówno do badań in vivo, jak i in vitro. W poprzednich badaniach wykorzystano bezkomórkowe hydrożele ECM do powlekania syntetycznych biomateriałów w ce...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) dostarcza ważnych biofizycznych i biochemicznych wskazówek do utrzymania homeostazy tkanek. Złożony skład molekularny reguluje zarówno właściwości strukturalne, jak i funkcjonalne tkanki. Białka strukturalne zapewniają komórkom świadomość przestrzenną i umożliwiają adhezję i migrację1. Związane ligandy oddziałują z receptorami na powierzchni komórki, aby kontrolować zachowanie komórki2. ECM nerki zawiera mnóstwo cząsteczek, których skład i struktura różnią się w zależności od lokalizacji anatomicznej, etapu rozwoju i stanu choroby3,4. Rekapitulacja złożoności ECM jest kluczowym aspektem w badaniu komórek pochodzących z nerek in vitro.
Poprzednie próby replikacji mikrośrodowisk ECM skupiały się na decellularizacji całej tkanki w celu stworzenia rusztowań zdolnych do recellularizacji. Decelularyzacja została przeprowadzona za pomocą detergentów chemicznych, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS) lub detergenty niejonowe, i wykorzystuje metody perfuzji całego narządu lub zanurzenia i mieszania5,6,7,8,9,10,11,12,13. Prezentowane tutaj rusztowania zachowują strukturalne i biochemiczne wskazówki znajdujące się w natywnej tkance ECM; Co więcej, recelularyzacja komórkami specyficznymi dla dawcy ma znaczenie kliniczne w chirurgii rekonstrukcyjnej14,15,16,17,18,19. Rusztowania te są jednak pozbawione elastyczności strukturalnej i dlatego są niekompatybilne z wieloma obecnie stosowanymi urządzeniami do badań in vitro. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wiele grup dalej przetwarzało zdecelularyzowany ECM na hydrożele20,21,22,23,24. Te hydrożele są kompatybilne z formowaniem wtryskowym i biotuszem oraz omijają ograniczenia przestrzenne w skali mikrometrycznej, które rusztowania bezkomórkowe nakładają na komórki. Ponadto zachowany jest skład molekularny i proporcje występujące w natywnym ECM3,25. Tutaj demonstrujemy metodę wytwarzania hydrożelu pochodzącego z kory nerkowej ECM (kECM).
Celem tego protokołu jest wyprodukowanie hydrożelu, który replikuje mikrośrodowisko obszaru kory nerkowej. Tkanka kory nerkowej jest decelularyzacja w 1% roztworze SDS pod ciągłym mieszaniem w celu usunięcia materii komórkowej. SDS jest powszechnie stosowany do decelularyzacji tkanek ze względu na jego zdolność do szybkiego usuwania immunologicznego materiału komórkowego6,7,9,26. kECM jest następnie poddawany mechanicznej homogenizacji i liofilizacji5,6,9,11,26. Solubilizacja w mocnym kwasie z pepsyną daje końcowy roztwór podstawowy hydrożelu20,27. Natywne białka kECM, które są ważne dla wsparcia strukturalnego i transdukcji sygnału, są zachowywane3,25. Hydrożel może być również żelowany z dokładnością do jednego rzędu wielkości rodzimej ludzkiej kory nerkowej28,29,30. Macierz ta zapewnia środowisko fizjologiczne, które zostało wykorzystane do utrzymania stanu spoczynku komórek specyficznych dla nerek w porównaniu z hydrożelami z innych białek macierzy. Co więcej, składem matrycy można manipulować, na przykład poprzez dodanie kolagenu-I, w celu modelowania środowisk chorobowych do badania zwłóknienia nerek i innych chorób nerek31,32.

<table><tbody><tr><td>Przygotowanie tkanki nerkowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5000 mL Zlewka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z740589</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny H2O</td><td></td><td></td><td>Autoklawizowany DI H2O</td></tr><tr><td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-512-128</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy 500 ml</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420D</td><td></td></tr><tr><td>1000 ml Zlewka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10031L</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4642</td><td>Można użyć dowolnych podobnych kleszczyków</td></tr><tr><td>Zacisk hemostat z uchwytem nożycowym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168866</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>rękojeść do skalpela, nr 4</td><td>VWR</td><td>25859-000</td><td>Można użyć każdej podobnej rękojeści skalpela</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela, nr 20</td><td>VWR</td><td>25860-020</td><td>Można użyć dowolnego podobnego ostrza skalpela</td></tr><tr><td>Mieszadło (38,1 x 9,5 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-513-52</td><td></td></tr><tr><td>Chłonny podkład</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalny worek na zagrożenia biologiczne</td><td>VWR</td><td>14220-026</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek (40 um)</td><td>Fisher Science</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon wodny klasy hodowli komórkowych</td><td></td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Wolnostojąca rurka</td><td>VWR</td><td>89012-778</td><td></td></tr><tr><td><mocny> Produkcja homogenizatora tkankowego ECM Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>Polytron</td><td>PCU-20110</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>20 ml szklane fiolki scyntylacyjne i nakrętka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7130</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar (15,9 x 8 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-513-62</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna z błony śluzowej żołądka świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>0,01 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Rozcieńczyć do 0,01 N HCl za pomocą kultury komórkowej woda</td></tr><tr><td>Nerki ECM Gelation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (sterylny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Rozcieńczyć do 1 N w wodzie klasy hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka stożkowa</td><td>ThermoFisher</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>11330.032</td><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco: Mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F12)</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, selen, roztwór pirogronianu sodu ( ITS-A) 100X</td><td>Life Technologies</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Strzykawka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192325</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z193208</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) dostarcza ważnych biofizycznych i biochemicznych wskazówek do utrzymania homeostazy tkanek. Obecne syntetyczne hydrożele oferują solidne mechaniczne wsparcie dla hodowli komórkowych in vitro, ale brakuje im niezbędnego składu białek i ligandów, aby wywołać fizjologiczne zachowanie komórek. Manuskrypt ten opisuje metodę wytwarzania hydrożelu pochodzącego z ECM kory nerkowej o odpowiedniej wytrzymałości mechanicznej i wspierającym składzie biochemicznym. Hydrożel jest wytwarzany przez mechaniczną homogenizację i solubilizację pozbawionej komórek ludzkiej kory nerkowej ECM. Macierz zachowuje natywne proporcje białka ECM w korze nerkowej, jednocześnie umożliwiając żelowanie do fizjologicznych sztywności mechanicznych. Hydrożel służy jako substrat, na którym komórki pochodzące z kory nerkowej mogą być utrzymywane w warunkach fizjologicznych. Co więcej, składem hydrożelu można manipulować w celu modelowania chorego środowiska, co umożliwia przyszłe badania nad chorobami nerek.

Hydrożel kECM stanowi macierz do hodowli komórek nerek o składzie chemicznym zbliżonym do natywnego mikrośrodowiska nerek. Aby wytworzyć hydrożel, tkankę kory nerek izoluje się mechanicznie z całego narządu i tnie na kawałki (Rycina 1). Decelularyzacja przy użyciu detergentu chemicznego (Rycina 2A.1-A.3) i następujące po niej płukanie wodą w celu usunięcia cząsteczek detergentu (Rycina 2A</st...

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerki, aby zachować naturalny skład strukturalny i biochemiczny macierzy zewnątrzkomórkowej nerki (ECM). Opisano proces wytwarzania i jego zastosowania. Na koniec omówiono perspektywę wykorzystania tego hydrożelu do wspomagania specyficznej dla nerek regeneracji komórek i tkanek oraz bioinżynierii.

Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak wpływ interakcji macierzy komórkowej na siarczany. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona pierwszy materiał, który dokładnie odzwierciedla natywne mikrośrodowiska biochemiczne kory nerkowej. Wyłóż kaptur do hodowli tkankowych podkładką pod spód.Umieść jednolitrową zlewkę zawierającą mieszadło, sterylne naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 150 milimetrów i całą nerkę w kapturze. Napełnij zlewkę 500 mililitrami 1% roztworu SDS. Umieść nerkę w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej.Usuń cały tłuszcz okołonerkowy, lekko goląc okolice torebki nerkowej skalpelem. Następnie wykonaj płytkie nacięcie o długości od 8 do 10 centymetrów w poprzek górnego końca nerki, aby otworzyć torebkę nerkową bez uszkadzania leżącej poniżej tkanki kory. Użyj dwóch klamer hemostatu, aby usunąć torebkę nerkową, odrywając ją od tkanki kory mózgowej.Przeciąć nerkę wzdłuż płaszczyzny czołowej za pomocą skalpela wzdłuż bocznej strony nerki. Odizoluj tkankę kory z obu połówek, wycinając obszar rdzenia skalpelem. Następnie pokrój tkankę kory na 0,5 centymetra sześcienne kawałki i usuń wszelkie duże, widoczne naczynia.Aby wyizolować macierz zewnątrzkomórkową z nerki, umieść pokrojoną w kostkę tkankę kory mózgowej w zlewce zawierającej roztwór SDS. Przykryj zlewkę autoklawowaną folią aluminiową i umieść ją na płytce mieszającej z prędkością około 400 obr./min, poza kapturem do hodowli tkankowych. Po 24 godzinach mieszania umieścić zlewkę w kapturze do hodowli tkankowych.Dodaj sterylne sitko do komórek o średnicy 40 mikronów wykonane z siatki nylonowej. A następnie napełnij oddzielną 1000-mililitrową zlewkę 200 mililitrami wybielacza i umieść ją w kapturze do hodowli tkankowych. Roztwór SDS przelać przez sitko do komórek do zlewki zawierającej wybielacz.Odpipetować pozostały roztwór SDS, aż w zlewce pozostanie tylko pozbawiona komórek tkanka i sitko do komórek. Pozostaw sitko do komórek w zlewce i dodaj 500 mililitrów świeżego roztworu SDS. Przykryj zlewkę tą samą folią aluminiową i umieść na talerzu mieszającym z tą samą prędkością co poprzednio.Po decelularyzacji i umyciu przenieś zdecelularyzowaną tkankę, zwaną od tego momentu ECM nerki, do 30-mililitrowej wolnostojącej stożkowej rurki. I napełnij go wodą klasy hodowli komórkowej, aż cała tkanka zostanie zanurzona. Najpierw użyj homogenizatora tkankowego do homogenizacji ECM nerki w stożkowej probówce przez dwie minuty, aż do uzyskania nieprzezroczystego roztworu bez widocznych kawałków ECM.Następnie zanurz stożkową rurkę zawierającą ECM nerki w ciekłym azocie, aż wrzenie otaczające rurkę przestanie się utrzymywać. Przechowuj ECM nerki w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby liofilizować zamrożoną tkankę pozbawioną komórek, lekko poluzuj stożkową nasadkę rurki, aby umożliwić wymianę gazową, i umieść probówkę w maszynie do liofilizacji.Liofilizuj ECM nerki przez trzy dni lub do momentu, gdy będzie przypominać drobny, biały proszek. Aby chemicznie strawić i rozpuścić żel, dodaj starannie zważoną pepsynę żołądkową świń i 0,01 normalnego kwasu solnego do scyntylacyjnego środka zawierającego mieszadło. Mieszaj z prędkością około 500 obr./min, aż cała pepsyna się rozpuści.Następnie przenieś liofilizowany ECM nerki do scyntylacji vile i pozostaw roztwór na płytce mieszającej z prędkością około 500 obr./min na trzy dni, aby uzyskać podstawowy hydrożel ECM nerki. W kapturze do hodowli tkankowej odpipetuj wymagane objętości pożywki do hodowli komórkowych, jednego normalnego wodorotlenku sodu i suplementu M199, do sterylnej 30-mililitrowej, wolnostojącej stożkowej probówki. Wymieszaj roztwór odczynnika neutralizującego za pomocą mikroszpatułki.Użyj sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby przenieść odpowiednią objętość podstawowego hydrożelu ECM nerki do roztworu odczynnika neutralizującego. Za pomocą mikroszpatułki delikatnie wymieszaj roztwór, aż do uzyskania jednorodnego w kolorze roztworu hydrożelu. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, mieszając powoli i delikatnie.Aby włączyć komórki do hydrożelu ECM nerki, należy ponownie zawiesić trzysta tysięcy komórek w 10 mikrolitrach pożywki na każdy hydrożel. Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do końcowego żelu ECM nerki. Mieszaj roztwór mikroszpatułką, aż komórki zostaną równomiernie rozprowadzone.Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby napełnić żądane urządzenie do hodowli komórkowej hydrożelem ECM nerki. Pozostaw żel do zastygnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę przed przeniesieniem lub posianiem komórek do ECM nerki w urządzeniu do hodowli komórkowej. Analiza pozbawionej komórek tkanki kory mózgowej za pomocą spektrometrii mas ujawniła obecność białek związanych z blaszką bazylii, przy czym kolagen-IV i kolagen-I są najsilniej reprezentowane.Zachowano łańcuchy kolagenu IV, A1 i A2, wszechobecne we wszystkich błonach podstawnych. Wykryto również łańcuchy kolagenu IV, A3 i A5, obecne tylko w błonach podstawnych kłębuszków nerkowych. Wykryto również powszechne formy iso Laminin i Collagen-I.Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego okołokanalikowego nerki lub HKMEC, hodowane na kolagenie I, ECM nerki i żelu z mieszaniną 1:1, wykazały różnice w fenotypie. HKMEC hodowane na Collagen-I, wykazywały jednolitą ekspresję CD31, widoczną na czerwono. Podczas gdy HKMEC hodowane na dwóch żelach zawierających ECM nerki wykazywały zmniejszoną ekspresję CD31 w nierównomiernym rozmieszczeniu.Wydaje się, że typ matrycy nie wpływa na ekspresję VWF, pokazany na zielono. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o pełnej homogenizacji pozbawionej komórek tkanki kory nerkowej. Ponadto podczas mieszania żelu z odczynnikami neutralizującymi należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza.Systemy mikrofizjologiczne pozwalają na badanie funkcji narządów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Stworzenie takich systemów wymaga implementacji komórek, matryc i bodźców. Wyprodukowany tutaj hydrożel kECM pozwoli nam na badanie takich układów, które rekapitulują mikrośrodowiska nerkowe.

fabricating-a-kidney-cortex-extracellular-matrix-derived-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Ten artykuł przedstawia nową metodę syntezy hydrożeli decelularnej chrząstki zewnątrzkomórkowej (DC-ECM). Hydrożele DC-ECM mają doskonałą biokompatybilność i zapewniają doskonałe mikrośrodowisko do wzrostu komórek. Dlatego mogą być idealnymi rusztowaniami komórkowymi i biologicznymi systemami dostarczania.

Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Protokół wyjaśnia dwie różne metodologie decelularyzacji stosowane do rodzimych tkanek płucnych bydła, dostarczając wyczerpującego opisu ich charakterystyki.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Poznaj protokół wytwarzania hydrożelu z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej, który zachowuje rodzimy skład biochemiczny. Ta metoda wspiera badania nad regeneracją tkanek nerkowych.

Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Przeglądaj więcej filmów