Name: Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj metody dekompozycji tkanki płucnej bydła i rekonstrukcji hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej. Dowiedz się, jak techniki dekompozycji wpływają na właściwości biochemiczne i mechaniczne modeli tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Turecką Radę ds. Badań Naukowych i Technologicznych (TÜBİTAK) (Grant nr 118C238). Cała odpowiedzialność za publikację/artykuł spoczywa na właścicielu publikacji. Otrzymane wsparcie finansowe od TÜBİTAK nie oznacza, że treść publikacji jest zatwierdzona w sensie naukowym przez TÜBİTAK. Autorzy z wdzięcznością dziękują za korzystanie z usług i udogodnień Centrum Badawczego Medycyny Translacyjnej Uniwersytetu Koç (KUTTAM). Rysunki 1 i 2a zostały utworzone przy użyciu Biorender.com.

Świeże rodzime płuca od młodych (1-2 letnich) dawców bydła zostały pozyskane z lokalnej rzeźni i przetransportowane w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku na lodzie do laboratorium. Składanie ofiar ze zwierząt odbywa się w celu ogólnego spożycia mięsa (płuca są wyrzucane jako odpady) i nie jest związane z badaniem ani z nim związane. Potwierdzamy, że rzeźnia jest zgodna z krajowymi przepisami i regulacjami dotyczącymi składania ofiar ze zwierząt. Ponadto potwierdzamy, że wykorzystaliśmy wyłącznie materiał odpadowy, a projekt badawczy nie miał wpływu na liczbę uśmierconych zwierząt.
1. Pobieranie organów i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przechowywać świeżo uzyskane tkanki płucne bydła w temperaturze -80 °C do czasu zakończenia doświadczenia.</li>
	<li>W dniu eksperymentu poczekaj, aż zamrożone tkanki płucne rozmrozą się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyciąć tkanki sterylnymi skalpelami i nożyczkami, aby usunąć tchawicę i chrzęstne drogi oddechowe, a następnie zmielić na małe kawałki (5 mm3).</li>
	<li>Dokładnie umyć ultraczystą wodą zawierającą 2% penicyliny/streptomycyny (P/S) co najmniej 3x.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja tkanek
UWAGA: Rodzime tkanki płuc bydlęcych zostały zdecelularyzowane przy użyciu dwóch różnych protokołów.
<ol>
	<li>Metoda zamrażania i rozmrażania
	<ol>
		<li>Przygotuj próbki tkanek zgodnie z krokiem 1. Zanurzyć zmielone tkanki w 2% roztworze jodu w sterylnej wodzie destylowanej (dH2O) na 1 min. Wykonaj dwa kolejne prania w sterylnym dH2O.</li>
		<li>Przenieś zmielone kawałki tkanek do probówki o pojemności 50 ml do poziomu 15 ml i wykonaj pięć ręcznych cykli zamrażania i rozmrażania za pomocą przenośnego pojemnika na ciekły azot. Napełnij probówki do góry sterylnym dH2O i zamrażaj probówki na 2 minuty w ciekłym azocie. Po 2 minutach natychmiast przenieś je do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Stanowi to 1 cykl zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Inkubować próbki z 30 ml roztworu DNazy (10 U/ml) w 10 mM buforze MgCl2 (pH 7,5) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym wytrząsaniu przy 100 obr./min.</li>
		<li>Kontynuować intensywne mycie sterylnym dH2O przez 3 dni pod ciągłym wstrząsaniem przy 100 obr./min, z uzupełnianiem roztworu co 24 godziny.</li>
		<li>Wykonaj liofilizację i kriomielenie w następujący sposób20: Zamroź mokre próbki dECM w temperaturze -80 °C przez 24 godziny. Przenieś zamrożone próbki do liofilizatora i pracuj w trybie suszenia w próżni przez 3 do 4 dni, aż do całkowitego wysuszenia. Po zakończeniu liofilizacji należy przeprowadzić mielenie próbek na drobny proszek za pomocą urządzenia do mielenia i suchego lodu. 
		UWAGA: Ten drobny proszek jest uważany za konieczny ze względu na jego zwiększoną rozpuszczalność podczas kolejnych etapów procesu trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda Triton-X-100
	<ol>
		<li>Przygotuj próbki tkanek zgodnie z krokiem 1. Leczyć tkanki płuc 1% Triton-X-100 przez 3 dni przy delikatnej rotacji w temperaturze 4 °C. Wymieniaj roztwór co 24 godziny.</li>
		<li>Próbki inkubować z roztworem DNazy (10 U/ml) w 10 mM buforze MgCl2 (pH 7,5) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
		<li>Kontynuować intensywne mycie sterylnym dH2O przez 3 dni na przemian, z uzupełnianiem roztworu co 24 godziny.</li>
		<li>Przeprowadzić liofilizację, a następnie kriomielenie, jak opisano w kroku 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie pepsynami
<ol>
	<li>Trawić sproszkowane próbki dECM w stężeniu 15 mg/ml (w/v) w roztworze pepsyny (1 mg/ml pepsyny w 0,01 M HCl, pH 2). Przeprowadzać proces mineralizacji próbki w temperaturze pokojowej pod ciągłym mieszaniem przez 48 godzin i często utrzymywać pH roztworu w celu skutecznego roztwarzania.</li>
	<li>Przełóż strawione płyny do probówki i odwiruj przy 5000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zebrać supernatant i zneutralizować go oraz zbuforować do warunków fizjologicznych (pH 7, 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)) poprzez dodanie 5M NaOH i 10x PBS. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie stężonych roztworów alkalicznych do regulacji pH kwaśnego trawienia, ponieważ takie podejście pozwala uniknąć niepożądanego zwiększenia objętości, które mogłoby niekorzystnie wpłynąć na żelowanie w kolejnych etapach.</li>
	<li>Przechowywać trawione składniki przed żelem w temperaturze -20 °C do dalszych badań.</li>
</ol>
4. Barwienie histologiczne
<ol>
	<li>Niewielką porcję (5 mm3) próbki tkanki pozbawionej komórek umieścić w 1 ml 3,7% roztworu formaldehydu w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Inkubować tkanki w probówkach zawierających 1 ml 30% roztworu sacharozy w PBS przez 12 godzin w temperaturze 4 °C na stabilnej skale.</li>
	<li>Aby osadzić tkanki w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), wlej 1 ml OCT do krioformy, umieść tkankę na środku krioformy, a następnie wlej 2 ml OCT na wierzch tkanki.</li>
	<li>Umieść krioformy zawierające tkanki na suchym lodzie i zamroź za pomocą ciekłego azotu. Próbki są gotowe, gdy OCT zmieni kolor na biały, co zwykle trwa 3 minuty. Tkanki osadzone w OCT należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Otrzymać skrawki 10 μm w kriostacie w temperaturze -25 °C na szkiełku podstawowym pokrytym poli-L-lizyną i przenieść szkiełko do temperatury pokojowej, aby umożliwić stopienie się przekroju tkanki na szkiełku. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>W celu potwierdzenia braku jąder po decelularyzacji należy wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zgodnie z opisem poniżej.
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zanurzyć szkiełka w PBS i zabarwić je gotowymi do użycia 50 ml roztworu hematoksyliny w słoiku do barwienia na 3 minuty, a następnie przemyć 3 minuty wodą z kranu.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 95% etanolu i zabarwij 50 ml 0,5% alkoholowego roztworu eozyny w słoiku do barwienia na 45 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie na czerwono Syriusza, aby pokazać zachowanie zawartości kolagenu po decelularyzacji.
	<ol>
		<li>Uwodnić szkiełka PBS i zanurzyć je w 50 ml 0,1% czerwieni Syriusza w nasyconym wodnym roztworze kwasu pikrynowego w słoiku do barwienia na 1 godzinę.</li>
		<li>Płucz szkiełka w 0,5% roztworze kwasu octowego przez 5 s i odwadniaj wszystkie szkiełka, mocząc je kolejno w 70%, 95% i 100% etanolu przez 1 minutę każda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować zawartość sGAG w próbkach tkanek, należy wykonać barwienie błękitem Alcian zgodnie z opisem poniżej.
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w 50 ml 1% błękitu alcyjskiego w 3% roztworze kwasu octowego (pH 2,5) w słoiku do barwienia na 30 minut. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty.</li>
		<li>Odwodnić wszystkie szkiełka, mocząc je w 70%, 95% i 100% etanolu sekwencyjnie przez 1 minutę każda. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 0,1 ml podłoża montażowego na wierzch próbek i wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu 10-krotnego powiększenia.</li>
</ol>
5. Charakterystyka mechaniczna
<ol>
	<li>Realizuj oscylacyjne pomiary reologiczne za pomocą reometru o równoległej geometrii płytki.</li>
	<li>Wlać 250 μl roztworu żelu wstępnego trzymanego na lodzie na wstępnie schłodzoną (4 °C) dolną płytkę, aby uniknąć szybkiego żelowania.</li>
	<li>Opuścić płytkę równoległą o średnicy 20 mm, aż roztwór żelu wstępnego utworzy krążek ze szczeliną o szerokości 1 mm między dwiema płytkami.</li>
	<li>Natychmiast rozpocznij pomiar. Zmierz moduły magazynowania i strat w czasie ze stałą częstotliwością i odkształceniem, podgrzewając dolną płytkę do 37 °C przez 30 minut, aby zaobserwować kinetykę żelowania. Użyj stałej częstotliwości 0,5 Hz i 0,1% odkształcenia.</li>
	<li>Wykonaj test odzyskiwania pełzania, gdy wartość modułu przechowywania przestanie rosnąć i osiągnie plateau.</li>
	<li>Przykładać naprężenie ścinające 1 Pa do hydrożelu przez 15 minut, zmierzyć odkształcenie, odciążyć próbkę od naprężenia i rejestrować zmianę wartości odkształcenia przez 15 minut.</li>
	<li>Narysuj wykres napięcia w funkcji czasu, aby pokazać zachowanie rozluźniające stres. Powtórz pomiary dla trzech różnych skrótów dECM jako kontrprób.</li>
</ol>

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
<li>Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vascularized+lung+cancer-on-a-chip+with+lung+extracellular+matrix+hydrogels+for+in+vitro+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening.</a> Cancers (Basel). 13 (16), 3930(2021).</li>
<li>Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+bioengineering%3A+advances+and+challenges+in+lung+decellularization+and+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization.</a> Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).</li>
<li>Roth, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+freeze-thaw+cycles+for+decellularization+of+tendon+tissue+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 13(2017).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).</li>
<li>Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+viscoelasticity+on+cellular+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour.</a> Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Hydrożele pochodzące z narządów stały się obiecującymi modelami, które podsumowują natywną tkankę ECM i naśladują organotypowe funkcje komórkowe. Chociaż pozbawione komórek ECM płuc są często stosowane w inżynierii tkankowej, dokładna charakterystyka składu biomateriału i właściwości mechanicznych przyniesie korzyści w lepszym zrozumieniu, w jaki sposób interakcje komórka-ECM mogą być modulowane w celu modelowania procesów biologicznych podczas homeostazy lub choroby. W szczególności ocena i kontrola właściwości mechanic...

Konwencjonalne warunki hodowli jednowarstwowej nie oferują wiernego odwzorowania rodzimych mikrośrodowisk tkankowych i nie są w stanie zapewnić trójwymiarowego (3D) rusztowania z instruktażowymi ligandami, które umożliwiają interakcje komórka-matryca i komórka-komórka1. Skład i właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są wysoce specyficzne tkankowo, zależne od czasu i ulegają zmianom w stanach patologicznych. Dlatego istnieje zapotrzebowanie na biomimetyczne modele tkanek 3D, które umożliwiają dostrajanie takich cech, modulację zachowania komórkowego i osiągnięcie pożądanej funkcjonalności tkanki. Rodzime biomateriały pochodzące z ECM przyciągają dużą uwagę w inżynierii tkankowej dzięki możliwości bezpośredniego wykorzystania specyficznego tkankowo ECM1,2,3,4,5. Nośniki oparte na ECM są wykorzystywane w wielu zastosowaniach, począwszy od regeneracji tkanek, a skończywszy na opracowywaniu modeli chorób. Są one używane jako rusztowania biomateriałowe do wstrzykiwania lub implantacji4,5, w zastosowaniach do badań przesiewowych leków6,7, w opracowywaniu materiałów indukujących wzrost komórek8,9,10, jako bio-tusze11,12,13, w mikrofluidyce14, oraz w modelach tkanek nowotworowych15,16,17,18,19.
Decelularyzacja tkanek i organów jest popularnym podejściem do generowania rusztowań, które naśladują specyficzne tkankowo ECM. Rekonstytucja zdecelularyzowanych tkanek i narządów w hydrożelach umożliwia osadzanie komórek w biomimetycznych modelach tkanek 3D20. Techniki decelularyzacji koncentrują się głównie na eliminacji składników komórkowych przy zachowaniu składu ECM. Metody fizyczne, takie jak cykle zamrażania i rozmrażania lub procesy chemiczne, takie jak leczenie Triton-X-100, są powszechnie stosowane do decelularyzacji tkanek. Ponadto leczenie DNazą jest preferowane do usuwania resztkowego DNA w celu zminimalizowania odpowiedzi immunologicznych po osadzeniu komórki. Kluczowe znaczenie ma osiągnięcie maksymalnego usuwania komórek i minimalnego upośledzenia ECM w celu optymalizacji procedur decelularyzacji21. Oprócz tych aspektów, charakterystyka właściwości biochemicznych i mechanicznych odtworzonych rusztowań, w tym lepkosprężystości i sztywności, ma kluczowe znaczenie dla ulepszenia inżynieryjnych modeli tkanek 3D pochodzących z natywnych matryc20.
Specyficzny dla narządów ECM w inżynierii tkankowej płuc pozwala naśladować mikrośrodowisko płuc w celu modelowania procesów rozwojowych, homeostatycznych lub patologicznych in vitro i testowania terapii w warunkach fizjo-mimetycznych20,22,23. Wcześniejsze badania wykazały decelularyzację tkanki płucnej kilku gatunków, takich jak szczury, świnie i ludzie, ale metody te nie zostały jeszcze dostosowane do rzadziej stosowanych gatunków, takich jak bydło. Lepsze zrozumienie parametrów procesu decelularyzacji i tego, jak wpływają one na powstałe odtworzone rusztowania ECM pod względem składu biochemicznego i właściwości mechanicznych, pozwoli na lepsze dostrojenie tych aspektów i utoruje drogę do bardziej wiarygodnych modeli tkanek w zdrowiu i chorobie. W tym badaniu decelularyzacja płuc bydła za pomocą dwóch różnych metod, cykli zamrażania i rozmrażania oraz leczenia Triton-X-100, jest wyraźnie opisana, a następnie poprzedzona analizami biochemicznymi i mechanicznymi decelularyzowanych hydrożeli ECM płuc (dECM). Wyniki pokazują, że obie metody zapewniają skuteczną decelularyzację i retencję ligandów ECM. Warto zauważyć, że wybór metody znacząco wpływa na uzyskaną sztywność i lepkosprężystość odtworzonych hydrożeli. Hydrożele pochodzące z bydlęcego dECM wykazują znaczące analogie biochemiczne z macierzą zewnątrzkomórkową ludzkiego płuca i wykazują wiarygodne właściwości żelowania termicznego20. Jak opisano wcześniej, obie metody są odpowiednie dla hodowli 3D komórek raka płuc, zdrowych komórek nabłonka oskrzeli i organoidów płuc pochodzących od pacjenta20.

<table><tbody><tr><td>Etanol bezwzględny</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu alcińskiego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Reometr Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HR-2</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny</td><td>Jasny szkiełko</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia hematykaliną Mayera</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna z błony śluzowej żołądka świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pikrynowy</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>Syriusz Czerwony</td><td>Polysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Coraz popularniejsze staje się stosowanie hydrożeli pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w inżynierii tkankowej, ponieważ mogą one naśladować naturalne środowisko komórek in vitro. Jednak utrzymanie natywnej zawartości biochemicznej ECM, osiągnięcie stabilności mechanicznej i zrozumienie wpływu procesu decelularyzacji na właściwości mechaniczne hydrożeli ECM jest wyzwaniem. W tym miejscu opisano proces decelularyzacji tkanki płucnej bydła przy użyciu dwóch różnych protokołów, dalszą charakterystykę skuteczności decelularyzacji, wytwarzanie odtworzonych decelularyzowanych hydrożeli ECM płuc oraz ocenę ich właściwości mechanicznych i cytokompatybilności. Decelularyzacja płuc bydła prowadzono metodą fizyczną (cykle zamrażania i rozmrażania) lub chemiczną (na bazie detergentów). Barwienie hematoksyliną i eozyną przeprowadzono w celu walidacji decelularyzacji i retencji głównych składników ECM. Do oceny resztkowej zawartości kolagenu i siarczanowych glikozaminoglikanu (sGAG) w próbkach pozbawionych komórek zastosowano odpowiednio techniki barwienia czerwienią Sirius i błękitem alcjanowym. Właściwości mechaniczne decelularyzowanych hydrożeli ECM płuc scharakteryzowano reologią oscylacyjną. Wyniki sugerują, że decellularizowane hydrożele z płuc bydlęcych mogą zapewnić wiarygodny organotypowy<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; kolor:; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> alternatywa dla komercyjnych produktów ECM poprzez zachowanie większości natywnych komponentów ECM. Co więcej, odkrycia te ujawniają, że wybrana metoda decelularyzacji znacząco wpływa na kinetykę żelowania, a także na sztywność i właściwości lepkosprężyste otrzymanych hydrożeli.

Decelularyzacja 
Decelularyzację tkanki płuca bydlęcego w celu wytworzenia hydrożeli dECM, które odtwierzałyby natywne mikrośrodowisko płuc, osiągnięto zarówno za pomocą metod fizycznych (zamrażanie-rozmrażanie), jak i chemicznych (Triton-X-100). Po wycięciu fragmenty tkanki przemyto w dH2O z dodatkiem antybiotyków, aby usunąć patogeny, które mogłyby w późniejszym czasie wpłynąć na sterylność hydrożeli dECM. W metodzie zamrażania-rozmrażania zastosowano łącznie pięć cykli naprzemiennego prz...

Protokół wyjaśnia dwie różne metodologie decelularyzacji stosowane do rodzimych tkanek płucnych bydła, dostarczając wyczerpującego opisu ich charakterystyki.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...

Naszym celem jest opracowanie organotypowego modelu tkanki płucnej. Dlatego zoptymalizowaliśmy decelularyzację tkanki płucnej bydła i rekonstytucję hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. W tym badaniu staramy się zrozumieć wpływ różnych metod decelularyzacji na właściwości biochemiczne i mechaniczne odtworzonych hydrożeli płucnych.Jednym z głównych wyzwań związanych z protokołami decelularyzacji jest osiągnięcie stabilności mechanicznej w odtworzonych hydrożelach, co wymaga zrozumienia wpływu decelularyzacji na właściwości mechaniczne. Te właściwości, takie jak sztywność i lepkosprężystość, mają kluczowy wpływ na zachowania komórek. Opracowaliśmy metodologie, które skutecznie decellularyzują płuca bydła, uzyskując powtarzalne hydrożele płucne, które wykazują godne uwagi analogie z macierzą zewnątrzkomórkową ludzkiego płuca.W związku z tym istnieje znaczna nadzieja w wykorzystaniu natywnych hydrożeli dECM w płucach w celu modelowania choroby w kontekście płuc. Zaprojektowaliśmy tkanki w celu modelowania stanów homeostatycznych i chorobowych, ze szczególnym naciskiem na interakcje macierzy komórkowej. Dlatego jesteśmy zainteresowani zrozumieniem roli organotypowych matryc zewnątrzkomórkowych, zarówno pod względem unikalnej zawartości, jak i mechanicznych aspektów zachowania komórek.Nasze obecne badania koncentrują się na budowaniu biomimetycznych, specyficznych dla pacjenta modeli organoidowych raka. Na początek usuń zamrożone tkanki płuc bydła z 80 stopni Celsjusza i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej. Wypreparuj tkankę za pomocą sterylnych skalpeli i nożyczek, aby usunąć tchawicę i chrzęstne drogi oddechowe.Następnie zmiel tkankę na małe kawałki. Umyj tkankę trzykrotnie ultraczystą wodą zawierającą 2% penicyliny i streptomycynę. Zanurzyć próbkę tkanki mielonej w 2% roztworze jodu na jedną minutę.Następnie wykonaj dwa kolejne prania w sterylnej wodzie destylowanej. Przenieś kawałki tkanki do 50-mililitrowej probówki do znaku 15 mililitrów. Napełnij rurkę do góry wodą destylowaną i zamroź ją w ciekłym azocie na dwie minuty.Następnie natychmiast przenieś probówkę do zlewki zawierającej wodę o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Po pięciu cyklach zamrażania i rozmrażania inkubować próbkę w 30 mililitrach roztworu DNA przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle mieszając. Zamrozić mokre próbki bezkomórkowej matrycy zewnątrzkomórkowej bez komórek w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Przenieś zamrożone próbki do liofilizatora i pracuj w trybie suszenia w próżni przez trzy do czterech dni, aż do całkowitego wysuszenia. Po liofilizacji próbki należy zmielić na drobny proszek w aparacie do mielenia zawierającym suchy lód. Traktuj tkanki płuc 1%Triton X-100 przez trzy dni przy delikatnej rotacji w temperaturze 4 stopni Celsjusza, zmieniając roztwór co 24 godziny.Inkubować próbkę w roztworze DNA przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle mieszając. Myj chusteczkę wodą destylowaną przez trzy dni pod ciągłym wałkiem, uzupełniając wodę co 24 godziny. Po ostatnim myciu przeprowadzić liofilizację i kriomielenie, jak pokazano wcześniej.Strawić 15 miligramów na mililitr sproszkowanych, bezkomórkowych próbek macierzy zewnątrzkomórkowej w jednym miligramie na mililitr roztworu pepsyny w temperaturze pokojowej pod ciągłym mieszaniem przez 48 godzin. Utrzymuj pH roztworu na poziomie 2, aby zapewnić skuteczne trawienie. Odwirować trawienie tkanek w stężeniu 5000 g przez 10 minut i usunąć supernatant.Włącz reometr discovery HR-2, aby wykonać oscylacyjne pomiary reologiczne. Wlej 250 mikrolitrów roztworu do trawienia przed żelem umieszczonego na lodzie na wstępnie schłodzoną dolną płytę, aby uniknąć szybkiego żelowania. Opuść 20-milimetrową równoległą płytkę, aż roztwór wstępnego żelu utworzy krążek z jednomilimetrową szczeliną między dwiema płytkami.Ustaw napięcie na 0,1% i częstotliwość na 0,5 herca. Zmierz moduły magazynowania i strat w czasie, podgrzewając dolną płytę do 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zaobserwować kinetykę dylatacji. Po tym, jak wartość modułu zachowania przestanie rosnąć i osiągnie plateau, należy przeprowadzić test odzyskiwania pełzania, aby ocenić zachowanie hydrożeli w zakresie relaksacji naprężeń.Nałóż jeden pascal sheer stress na hydrożel przez 15 minut i zmierz napięcie. Następnie należy odciążyć próbkę od naprężenia i rejestrować zmianę wartości odkształcenia przez 15 minut. Na koniec narysuj wykres napięcia w funkcji czasu, aby pokazać zachowanie rozluźniające stres.Średni moduł spichrożeniowy i moduł strat hydrożeli wytworzonych metodą zamrażania i rozmrażania wykazały istotnie wyższą sztywność w porównaniu z hydrożelami wytwarzanymi metodą Triton X-100. Testy odzyskiwania pełzania wykazały, że hydrożele otrzymane obiema metodami wykazywały różne reakcje na naprężenia, co wskazuje na różne właściwości lepkosprężyste.

development-characterization-decellularized-lung-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Ten film opisuje technikę pozyskiwania hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez decelularyzację mysich poduszeczek tłuszczowych po napromienianiu ex vivo do badań in vitro. Ten hydrożel pomaga naśladować środowisko tkanki piersi in vivo po radioterapii w celu zbadania zachowania komórek nowotworowych.

Decellularyzacja poduszek tłuszczowych sutka: wyprowadzanie hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej z poduszek tłuszczowych sutka

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerki, aby zachować naturalny skład strukturalny i biochemiczny macierzy zewnątrzkomórkowej nerki (ECM). Opisano proces wytwarzania i jego zastosowania. Na koniec omówiono perspektywę wykorzystania tego hydrożelu do wspomagania specyficznej dla nerek regeneracji komórek i tkanek oraz bioinżynierii.

Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i późniejszego tworzenia hydrożelu mysich poduszeczek tłuszczowych sutka po napromieniowaniu ex vivo.

Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Ten artykuł przedstawia nową metodę syntezy hydrożeli decelularnej chrząstki zewnątrzkomórkowej (DC-ECM). Hydrożele DC-ECM mają doskonałą biokompatybilność i zapewniają doskonałe mikrośrodowisko do wzrostu komórek. Dlatego mogą być idealnymi rusztowaniami komórkowymi i biologicznymi systemami dostarczania.

Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz.

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Poznaj metody dekompozycji tkanki płucnej bydła i rekonstrukcji hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej. Dowiedz się, jak techniki dekompozycji wpływają na właściwości biochemiczne i mechaniczne modeli tkankowych.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Przeglądaj więcej filmów