Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Naszym celem jest opracowanie organotypowego modelu tkanki płucnej. Dlatego zoptymalizowaliśmy decelularyzację tkanki płucnej bydła i rekonstytucję hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. W tym badaniu staramy się zrozumieć wpływ różnych metod decelularyzacji na właściwości biochemiczne i mechaniczne odtworzonych hydrożeli płucnych.

Jednym z głównych wyzwań związanych z protokołami decelularyzacji jest osiągnięcie stabilności mechanicznej w odtworzonych hydrożelach, co wymaga zrozumienia wpływu decelularyzacji na właściwości mechaniczne. Te właściwości, takie jak sztywność i lepkosprężystość, mają kluczowy wpływ na zachowania komórek. Opracowaliśmy metodologie, które skutecznie decellularyzują płuca bydła, uzyskując powtarzalne hydrożele płucne, które wykazują godne uwagi analogie z macierzą zewnątrzkomórkową ludzkiego płuca.

W związku z tym istnieje znaczna nadzieja w wykorzystaniu natywnych hydrożeli dECM w płucach w celu modelowania choroby w kontekście płuc. Zaprojektowaliśmy tkanki w celu modelowania stanów homeostatycznych i chorobowych, ze szczególnym naciskiem na interakcje macierzy komórkowej. Dlatego jesteśmy zainteresowani zrozumieniem roli organotypowych matryc zewnątrzkomórkowych, zarówno pod względem unikalnej zawartości, jak i mechanicznych aspektów zachowania komórek.

Nasze obecne badania koncentrują się na budowaniu biomimetycznych, specyficznych dla pacjenta modeli organoidowych raka. Na początek usuń zamrożone tkanki płuc bydła z 80 stopni Celsjusza i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej. Wypreparuj tkankę za pomocą sterylnych skalpeli i nożyczek, aby usunąć tchawicę i chrzęstne drogi oddechowe.

Następnie zmiel tkankę na małe kawałki. Umyj tkankę trzykrotnie ultraczystą wodą zawierającą 2% penicyliny i streptomycynę. Zanurzyć próbkę tkanki mielonej w 2% roztworze jodu na jedną minutę.

Następnie wykonaj dwa kolejne prania w sterylnej wodzie destylowanej. Przenieś kawałki tkanki do 50-mililitrowej probówki do znaku 15 mililitrów. Napełnij rurkę do góry wodą destylowaną i zamroź ją w ciekłym azocie na dwie minuty.

Następnie natychmiast przenieś probówkę do zlewki zawierającej wodę o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Po pięciu cyklach zamrażania i rozmrażania inkubować próbkę w 30 mililitrach roztworu DNA przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle mieszając. Zamrozić mokre próbki bezkomórkowej matrycy zewnątrzkomórkowej bez komórek w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Przenieś zamrożone próbki do liofilizatora i pracuj w trybie suszenia w próżni przez trzy do czterech dni, aż do całkowitego wysuszenia. Po liofilizacji próbki należy zmielić na drobny proszek w aparacie do mielenia zawierającym suchy lód. Traktuj tkanki płuc 1%Triton X-100 przez trzy dni przy delikatnej rotacji w temperaturze 4 stopni Celsjusza, zmieniając roztwór co 24 godziny.

Inkubować próbkę w roztworze DNA przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle mieszając. Myj chusteczkę wodą destylowaną przez trzy dni pod ciągłym wałkiem, uzupełniając wodę co 24 godziny. Po ostatnim myciu przeprowadzić liofilizację i kriomielenie, jak pokazano wcześniej.

Strawić 15 miligramów na mililitr sproszkowanych, bezkomórkowych próbek macierzy zewnątrzkomórkowej w jednym miligramie na mililitr roztworu pepsyny w temperaturze pokojowej pod ciągłym mieszaniem przez 48 godzin. Utrzymuj pH roztworu na poziomie 2, aby zapewnić skuteczne trawienie. Odwirować trawienie tkanek w stężeniu 5000 g przez 10 minut i usunąć supernatant.

Włącz reometr discovery HR-2, aby wykonać oscylacyjne pomiary reologiczne. Wlej 250 mikrolitrów roztworu do trawienia przed żelem umieszczonego na lodzie na wstępnie schłodzoną dolną płytę, aby uniknąć szybkiego żelowania. Opuść 20-milimetrową równoległą płytkę, aż roztwór wstępnego żelu utworzy krążek z jednomilimetrową szczeliną między dwiema płytkami.

Ustaw napięcie na 0,1% i częstotliwość na 0,5 herca. Zmierz moduły magazynowania i strat w czasie, podgrzewając dolną płytę do 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zaobserwować kinetykę dylatacji. Po tym, jak wartość modułu zachowania przestanie rosnąć i osiągnie plateau, należy przeprowadzić test odzyskiwania pełzania, aby ocenić zachowanie hydrożeli w zakresie relaksacji naprężeń.

Nałóż jeden pascal sheer stress na hydrożel przez 15 minut i zmierz napięcie. Następnie należy odciążyć próbkę od naprężenia i rejestrować zmianę wartości odkształcenia przez 15 minut. Na koniec narysuj wykres napięcia w funkcji czasu, aby pokazać zachowanie rozluźniające stres

Średni moduł spichrożeniowy i moduł strat hydrożeli wytworzonych metodą zamrażania i rozmrażania wykazały istotnie wyższą sztywność w porównaniu z hydrożelami wytwarzanymi metodą Triton X-100. Testy odzyskiwania pełzania wykazały, że hydrożele otrzymane obiema metodami wykazywały różne reakcje na naprężenia, co wskazuje na różne właściwości lepkosprężyste.