Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Ogólnym celem tej metody wytwarzania niestandardowych hydrożeli jest badanie komórek i warunków hodowli, które odtwarzają złożoność macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie płuc, takie jak to, w jaki sposób komórki płuc wchodzą w interakcje z ECM w zdrowych i patologicznych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że hydrożele ECM płuc można dostosować do danego zastosowania w hodowli 2D lub 3D.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na złożoność technik decelularyzacji, czasami wymagających wielu osób i dbałości o szczegóły, aby zoptymalizować ilość żywej tkanki. W przypadku tego protokołu należy przygotować płuco świni do decelularyzacji. Szczegóły dotyczące jego przygotowania znajdują się w protokole tekstowym.

Po przygotowaniu płuc użyj ręcznej pompy, która jest kaniulowana, aby pasowała do tętnicy płucnej. Najpierw przelej około jednego litra wody do układu krwionośnego, a następnie 1,5 litra do tchawicy. Zrób to trzy razy, zwiększając objętość wody ukrwiającej się podczas usuwania zanieczyszczeń komórkowych.

Następnie należy wykonać perfuzję tkanki za pomocą Triton X-100, również za pomocą pompki ręcznej. Następnie zanurz tkankę w kąpieli z roztworem Triton X-100 w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny. Po 24 godzinach spłucz naczynia krwionośne i tchawicę trzykrotnie wodą destylowaną.

Po płukaniu użyj ręcznej pompki, aby przeperfundować tkankę za pomocą deoksycholanu. A następnie zanurz tkankę w deoksycholanie na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia spłucz tkankę trzykrotnie wodą destylowaną, tak jak poprzednio.

Po płukaniu użyj pompki ręcznej, aby perfundować tkankę przefiltrowanym chlorkiem sodu. Następnie zanurz tkankę w przefiltrowanym chlorku sodu na godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po kąpieli trzykrotnie przepłucz naczynia krwionośne i tchawicę wodą destylowaną do spłukania.

Po płukaniu należy przetoczyć perfuzję tkanki roztworem DNazy, a następnie zanurzyć ją w roztworze DNazy na godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie wykonaj pięciokrotną perfuzję układu krwionośnego i tchawicy za pomocą PBS, a nie wody. Teraz, używając tylko nieprzezroczystej białej tkanki, odetnij wszystkie kanaliki o średnicy dwóch milimetrów lub większej.

Znajdują się one głównie wokół wnęki i przyśrodkowej części płuc. Pozostaw nienaruszone strefy oddechowe, które znajdują się głównie na obrzeżach. Po usunięciu kanalików rozetnij tkankę na odcinki o długości jednego cala lub mniejsze.

Orientacja tych bloków nie jest ważna. Po odsączeniu bloków tkanek przenieś je do 50-mililitrowej stożkowej rurki i zamroź w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Kilka bloków można odłożyć na bok do badania histologicznego, aby potwierdzić usunięcie komórek i zanieczyszczeń.

Aby przetworzyć tkankę płucną na bezkomórkowy proszek, zastąp pokrywę na zamrożonej rurce z bibułą filtracyjną i zabezpiecz ją elastyczną opaską. Następnie liofilizuj tkankę, aż cały nadmiar płynu zniknie za pomocą liofilizatora zgodnie ze wskazówkami producenta. Następnie przechowuj tkankę w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie można ją zmielić.

Aby przygotować młyn, najpierw załaduj go ciekłym azotem, pozostawiając miejsce na rurkę młyna. Następnie z rurki młyna wyjmij pręt młyna magnetycznego i przykryj spód rurki chusteczką. Następnie wymień pręt młyna i luźno zapakuj więcej chusteczek, aby napełnić rurkę.

Następnie zamknij rurkę młyna, umieść ją w zamrażarce/młynku i napełnij młynek ciekłym azotem do maksymalnej pojemności. Teraz uruchom młyn na około pięć minut z szybkością zagłuszania około 600 na minutę. Następnie przechowuj zdecelularowany proszek w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Aby wytworzyć materiał przed żelem, dodaj zdecelularyzowany proszek tkankowy i pepsynę do stożkowej probówki. Następnie dodaj 0,01 molowego kwasu solnego do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 1% decelularizowanego proszku tkankowego i 0,01% pepsyny. Roztwór ten należy przechowywać w ciągłym mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 48 godzin w celu strawienia tkanek.

Po 48 godzinach umieść roztwór na lodzie na pięć minut. Teraz dostosuj pH roztworu do 7,4 za pomocą zimnego 0,1-molowego wodorotlenku sodu, a następnie doprowadź stężenie PBS roztworu do 1X, dodając 10X PBS. Mamy pewne doświadczenie w zmianie czasów i pH żelu wstępnego.

Istnieje pewna elastyczność w zakresie, który można zastosować, ale właściwości mogą się radykalnie zmienić, jeśli procedura zostanie zmieniona w niewielkim stopniu. Roztwór nie jest uważany za żel wstępny i może być stosowany do powlekania niepoddanych obróbce płytek w celu utworzenia hydrożeli do tworzenia komórek, do tworzenia hydrożeli do tworzenia komórek lub może być dalej modyfikowany przed utworzeniem hydrożeli w celu zwiększenia sztywności hydrożeli. Do hodowli komórek na dwuwymiarowej mikroporowatej powłoce żelowej dodać 20 mikrolitrów roztworu żelu wstępnego do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej niepoddanej obróbce.

Następnie wstaw płytkę do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby białka zostały wchłonięte na płytkę. Następnego dnia odessać roztwór żelu wstępnego i przepłukać studzienki PBS. Następnie dodaj 3 200 komórek do każdej studzienki i uzupełnij objętość pożywki w każdym dołku do 100 mikrolitrów.

Płytki można następnie inkubować. Aby uzyskać trójwymiarową hodowlę komórkową z komórkami wewnątrz mikroporowatego żelu, ponownie zawieś interesujące komórki w ilości miliona na mililitr w roztworze wstępnym żelu. Następnie szybko dozuj 16 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki, aby utworzyć hodowlę komórkową 3D o grubości około 500 mikronów.

Żel utworzy się w ciągu 30 minut po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po uformowaniu się żeli dodaj pożywkę do studzienek do oznaczeń 100 mikrolitrów. W przypadku trójwymiarowej hodowli komórkowej z komórkami na wierzchu mikroporowatego żelu, dodaj 100 mikrolitrów roztworu żelu wstępnego do dołków niepoddanej działaniu 96-dołkowej płytki.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu żelowania. Gdy żele się uformują, dodaj 3 200 komórek w pożywce o pojemności 100 mikrolitrów na wierzchu hydrożeli i przystąp do inkubacji płytki. Hydrożele wyprodukowano z normalnych płuc świń, szczurów i myszy przy użyciu opisanej metody.

Badania reologiczne potwierdziły, że ponad 90% żelowania następuje w pierwszych minutach po osiągnięciu 37 stopni Celsjusza. Utworzone hydrożele były stabilne przez długi czas w PBS, ale przyczepianie się i proliferacja komórek mogą się zmieniać z czasem. Roztwór żelu wstępnego został przetestowany jako kod poprawiający przyczepianie komórek.

Przyczepienie i proliferację komórek śródbłonka żyły pępowinowej mierzono za pomocą MTTSA. Poprawę zaobserwowano po pokryciu studni ECM. Podczas tworzenia żeli 3D dodanie Genipiny zwiększyło sieciowanie hydrożelu.

Korzystając z przemiatania częstotliwości na reometrze, sztywność hydrożelu była bezpośrednio skorelowana ze stężeniem Genipin, przy czym mediana i najbardziej istotne stężenie wynosiło 0,01%Testując sztywniejsze żele, zmierzono proliferację komórek jako wyższą za pomocą MTTSA na żelach o zwiększonym sieciowaniu. Po opanowaniu decelularyzacja może być wykonana w ciągu ośmiu godzin w ciągu czterech dni. Roztwór żelu wstępnego można przygotować w ciągu jednej godziny przez dwa dni, a tworzenie żelu można osiągnąć w ciągu dwóch godzin w ciągu dwóch dni.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak AFM, plamy zachodnie, barwienie i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak moduł sprężystości, skład białka i odpowiedź komórkowa na materiał.