Name: Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę tworzenia hydrożeli z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D. Technika dekompozycji tkanki wieprzowej umożliwia badanie interakcji komórek płucnych z ECM w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować farmom Smithfield za przekazanie nienaruszonej tkanki płucnej świni. Chcielibyśmy również podziękować dr Hu Yang, dr Christinie Tang oraz Oddziałowi Chirurgii Plastycznej VCU za umożliwienie nam korzystania z ich sprzętu. Próbki hydrożelu i tkanek przygotowano do SEM w Zakładzie Anatomii i Mikroskopii Neurobiologii VCU, przy wsparciu częściowo ze środków NIH-NINDS Center Core Grant 5 P30 NS047463, a częściowo z finansowania z NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30 CA016059. Obrazowanie SEM próbek w VCU Nanotechnology Core Characterization Facility (NCC). Praca ta została sfinansowana przez National Science Foundation, CMMI 1351162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>rozwiązanie</td>
			<td>Sterylny filtr</td>
			<td>Wskazówki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiH2O</td>
			<td>tak</td>
			<td>DiH2O; Sterylne z filtrem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1% roztwór Triton X-100</td>
			<td>tak</td>
			<td>Pod wyciągiem dodać 100 μl roztworu Triton-X 100 do 100 ml DiH2O i mieszać aż do rozpuszczenia; 
			sterylny filtr.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% roztwór deoksycholanu</td>
			<td>tak</td>
			<td>Pod wyciągiem dodać 2 g roztworu deoksycholanu sodu 
			na 100 ml DiH2O i mieszać aż do rozpuszczenia; Sterylny filtr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaCl</td>
			<td>tak</td>
			<td>Dodać 58,44 g NaCl do 1 l DiH2O; mieszać aż do rozpuszczenia; 
			sterylny filtr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozwiązanie DNazy</td>
			<td>tak</td>
			<td>Dodać 12 000 jednostek DNazy do 1 L DiH2O; Dodać 0,156 g MgSO4 
			(bezwodny) i 0,222 g CaCl2; mieszać aż do rozpuszczenia; sterylny filtr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pbs</td>
			<td>tak</td>
			<td>Kombajn 27,2 g Na2HPO4 · 7H2O (dwuzasadowy siedmiowodny), 
			80 g NaCl i 2 g KCl z 10 L DiH2O; mieszać aż do rozpuszczenia; dostosować pH do 7,4; sterylny filtr</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Roztwory wymagane do decelularyzacji tkanek. Wykonaj powyższe rozwiązania dla procesu decelularyzacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Na jedno płuco świni potrzeba około 2,5 l.
1. Tworzenie hydrożelu
<ol>
	<li>Decelularyzacja płuc świń (na podstawie odniesień9,10)
	<ol>
		<li>Uzyskać en bloc normalne płuco świni z rzeźni, z nienaruszonym sercem i naczyniami krwionośnymi.</li>
		<li>Użyj nożyczek do tkanek lub skalpela, aby wypreparować serce, przecinając naczynia krwionośne jak najbliżej serca, pozostałe naczynia krwionośne zostaną wykorzystane w późniejszych krokach do perfuzji.</li>
		<li>Ostrożnie wypreparuj tkankę łączną otaczającą tchawicę, oskrzela i naczynia krwionośne za pomocą skalpela lub nożyczek. 
		UWAGA: Określ najlepsze płuco do użycia w pozostałej części zabiegu, wybierając płuco bez dużych nacięć lub nakłuć przez opłucną oraz dużej ilości niedodmy lub niedrożności naczyń, które mogą utrudniać skuteczność procesu decelularyzacji.</li>
		<li>Odetnij nieoptymalne płuco, pozostawiając jak najwięcej oskrzeli przyczepionych do tchawicy (serce, tkanka łączna i płaty usuniętego płuca mogą zostać usunięte). Powinno pozostać jedno płuco połączone z tchawicą i układem naczyniowym. 
		UWAGA: W razie potrzeby zachowaj skrawki do histologii. 9</li>
		<li>Zamknij odłączone oskrzela za pomocą klamer lub szwu, aby zapobiec nadmiernemu przepływowi wstecznemu.</li>
	</ol>
	<ol start="6">
		<li>Przygotować roztwory do decelularyzacji i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą potrzebne (tabela 1).</li>
		<li>Za pomocą ręcznej pompki kaniulowanej w celu dopasowania do tętnicy płucnej, wykonaj 3-krotną perfuzję tkanki płucnej wodą DI zarówno przez tętnicę płucną, jak i tchawicę. Za każdym razem najpierw ukrwić naczynia krwionośne. Zacznij od około 1 l do układu krwionośnego i 1,5 l do tchawicy na każdą perfuzję, ale w miarę usuwania resztek komórkowych więcej płynu może być przetłaczane przez system.</li>
		<li>Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy za pomocą roztworu Triton X-100.</li>
		<li>Zanurzyć tkankę płucną w roztworze Triton X-100 na 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.</li>
		<li>Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy roztworem deoksycholanu.</li>
		<li>Zanurzyć skrawki tkanki w deoksycholanie na 24 godziny w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.</li>
		<li>Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy roztworem NaCl.</li>
		<li>Zanurzyć tkankę w przefiltrowanym roztworze NaCl na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.</li>
		<li>Ukrwić zarówno naczynia krwionośne, jak i tchawicę roztworem DNazy.</li>
		<li>Zanurzyć tkankę w przefiltrowanym roztworze DNazy na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Perfuzja zarówno układu krwionośnego, jak i tchawicy 5 razy za pomocą PBS.</li>
		<li>Wyciąć zauważalną tkankę chrzęstną, tchawicę i wszystkie kanaliki o średnicy 2 mm lub większej (znajdujące się głównie wokół wnęki i przyśrodkowej części płuc) z przewodzenia dróg oddechowych, pozostawiając tylko strefy oddechowe (głównie obszary obwodowe).</li>
		<li>Wypreparuj tkankę na odcinki o długości 1 cala lub mniejsze. Orientacja tkanki nie ma znaczenia dla tego kroku.</li>
		<li>Odlej nadmiar płynu i umieść chusteczkę w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Zamrozić tkankę w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W razie potrzeby zachowaj skrawki do badania histologicznego, aby zapewnić usunięcie komórek i resztek komórkowych. Do charakterystyki używamy H&E, α-galaktozydazy, pikogreenu, hydroksyproliny, ninhydryny, błękitu alciańskiego, SDS-PAGE i spektrometrii mas. 9</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie płuc
	<ol>
		<li>Zdjąć pokrywki z zamrożonych probówek zawierających pozbawioną komórek tkankę płucną.</li>
		<li>Umieść bibułę filtracyjną na otworze rurki i zabezpiecz gumką. 
		UWAGA: Probówkę i zawartość należy nadal zamrozić, w przeciwnym razie umieścić w temperaturze -80 °C do momentu zamrożenia.</li>
		<li>Liofilizuj tkankę, aż cały nadmiar płynu zniknie, używając liofilizatora zgodnie ze wskazówkami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do zmielenia.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem dodaj ciekły azot do młyna zamrażarki, aby schłodzić izolację i elementy wewnętrzne do warunków pracy.</li>
		<li>Wyjmij magnetyczny pręt młyna z rurki młyna i dodaj chusteczkę do przykrycia dna.</li>
		<li>Wymień listwę młynka i dodaj luźno upakowaną chusteczkę. Belka młyna powinna nadal poruszać się swobodnie.</li>
		<li>Zamknij rurkę młyna i umieść w młynie zamrażarki.</li>
		<li>Napełnij ciekły azot do linii maksymalnego napełnienia.</li>
		<li>Zamrażarka zmielić całą tkankę na drobny proszek (około 5 minut, szybkość zaklinania ~600 min-1), w cylindrze z poliwęglanu z udarem ze stali nierdzewnej, a także zatyczkami końcowymi ze stali nierdzewnej za pomocą młyna zamrażarki zgodnie ze wskazówkami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie mikroporowatego żelu (8 mg/ml) (na podstawie pozycji9,11)
	<ol>
		<li>Dodać 1% (w/v) decelularizowanego proszku i 0,1% (w/v) pepsyny do 0,01 M HCl, pod stałym mieszaniem (powinno być w stanie zobaczyć przepływ na najwyższym poziomie cieczy), w temperaturze pokojowej, przez 48 godz. 
		UWAGA: Proszek jest naładowany statycznie, więc dodanie HCl po proszku daje możliwość zmycia nadmiaru ze ścianek rurki.</li>
		<li>Po trawieniu przez 48 godzin umieścić roztwór i odczynniki na lodzie na 5 minut.</li>
		<li>Używając schłodzonego 10% (v/v) 0,1 M NaOH i 11,11% (v/v) 10x PBS (aby doprowadzić cały roztwór do 1x stężenia), doprowadzić strawiony roztwór białkowy do fizjologicznego pH 7,4, 
		UWAGA: Roztwór można teraz przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. W razie potrzeby przeprowadzić kinetykę żelowania za pomocą reometrii9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sieciowanie hydrożeli w celu poprawy wytrzymałości mechanicznej
<ol>
	<li>Roztwory 1%, 0,1% i 0,01% w/v roztworu sieciującego genipinę przygotowano poprzez rozpuszczenie niezbędnej ilości proszku genipiny w 10% DMSO.</li>
	<li>Wiruj roztwór co 15 minut przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać roztwór genipiny, aby przykryć hydrożele ECM (100 μl na każde dołek płytki 96-dołkowej), które zostały wcześniej zebrane w części 1.3.4.</li>
	<li>Pozostaw każdy hydrożel ECM do usieciowania na 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Spłucz hydrożel ECM 3 razy za pomocą PBS, aż roztwór myjący przestanie być niebieski. Usieciowane hydrożele będą następnie gotowe do dalszej charakterystyki i badań nad kulturami komórkowymi.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa z mikroporowatym żelem
<ol>
	<li>Dwuwymiarowa powłoka
	<ol>
		<li>Używając roztworu z ppkt 1.3.3, dodać 20 μl roztworu preżelu do każdego dołka z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej niepoddanej działaniu środka.</li>
		<li>Wstaw do lodówki na noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić adsorpcję białka na płytce.</li>
		<li>Odessać roztwór żelu wstępnego i spłukać PBS.</li>
		<li>Komórki pasażowe9.</li>
		<li>Dodaj 10 000 komórek/cm2 do studzienek.</li>
		<li>Zwiększyć ilość pożywki do 100 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trójwymiarowa hodowla komórkowa9
	<ol>
		<li>Używając roztworu z ppkt 1.3.3, zawiesić granulowane komórki do stężenia 1 000 000 komórek/ml roztworu preżelu.</li>
		<li>Szybko dozuj 16 μl zawiesiny komórek preżelu do każdego dołka 96-dołkowej płytki, aby utworzyć hydrożel o grubości ~500 μm do hodowli komórek 3D.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby powstał żel.</li>
		<li>Dodać 100 μl pożywki na wierzch uformowanych hydrożeli i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trójwymiarowa hodowla komórkowa na żelach o zmiennej sztywności
	<ol>
		<li>Używając roztworu z ppkt 1.3.3, odpipetować 100 μl roztworu preżelu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut do powstania żelu. 
		Uwaga: W tym miejscu można zastosować kroki sieciowania z części 2.</li>
		<li>Komórki pasażowe9.</li>
		<li>Dodaj 10 000 komórek/cm2 do studzienek.</li>
		<li>Zwiększyć ilość pożywki do 100 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z integralnych aspektów biologii jest samoorganizacja cząsteczek w hierarchiczne struktury, które wykonują określone zadanie. 13 W laboratorium samoorganizacja zależy od wielu czynników, takich jak stężenie soli, pH i czas trawienia. Jak pokazano, samoorganizujący się hydrożel powstaje, gdy rozpuszczone białka wracają do temperatury fizjologicznej. Powstały hydrożel jest zdolny do promowania przyczepiania się i proliferacji komórek in vitro.
Odpowiedź komórkowa na sy...

Tłumaczenie wyników in vitro na potrzeby kliniczne jest jednym z najtrudniejszych problemów, przed którymi stoją badacze biomedyczni. Badania in vitro nad plastikowymi hodowlami tkankowymi są łatwiejsze, wygodniejsze i utrzymują wysoką żywotność komórek. 1 Takie podejście jest rozsądnym punktem wyjścia, ale wyniki mają ograniczone przełożenie kliniczne. Coraz częściej laboratoria wykorzystują konstrukty trójwymiarowe, które zastępują tradycyjne metody dwuwymiarowe. Dostępne są recenzje dla wielu środowisk trójwymiarowych, od rusztowań biologicznych po rusztowania polimerowe. 2,3
Struktury biologiczne mogą naśladować cechy środowisk in vivo, ponieważ zawierają wiele składników białkowych i glikozaminoglikanu natywnej matrycy i zapewniają znajome miejsca wiązania dla komórek, do których mogą się przyczepić i rozpoznać. Wykazano, że materiały pochodzące z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są zdolnymi rusztowaniami do przyczepiania się i proliferacji komórek. 4 Jednym z wyzwań, które ogranicza stosowanie platform hydrożelowych ECM, są ich z natury słabe właściwości mechaniczne po żelowaniu. Tkanka natywna często ma właściwości mechaniczne, które są wielkości wyższe niż hydrożele. Nietoksyczne środki sieciujące mogą zwiększać właściwości mechaniczne hydrożeli, aby lepiej naśladować rodzime środowisko tkankowe. Genipin jest nietoksycznym, naturalnym środkiem sieciującym pochodzącym z roślin gardenii, posiadającym zdolność do ścisłego dostosowywania właściwości mechanicznych ECM do zmian stężenia genipiny5,6. 
Prawie wszystkie komórki w ciele istnieją i organizują się na ECM, które albo produkują, albo utrzymują. Nowe skupienie się na uniwersalnym znaczeniu ECM w organizacji, stanie i funkcji każdego narządu lub układu zapoczątkowało produkcję platform opartych na matrycach do badań in vitro. Podśluzówka jelita cienkiego świni jest najszerzej przebadanym rusztowaniem pochodzenia naturalnego i jest używana do regeneracji ścięgien, więzadeł, mięśni szkieletowych4, a nawet kości7. Matryce z innych narządów i gatunków dawców również wykazały dobry potencjał regeneracji tkanek. Zastosowanie obcych komponentów ECM powoduje minimalne problemy z immunomodulacją. Po wyeliminowaniu materii komórkowej gospodarza, pozostały ECM będzie podobny pod względem zawartości aminokwasów i organizacji do wszystkich innych gatunków ssaków8. Coraz częściej mówi się, że najlepszym sposobem badania interakcji między komórką a ECM in vitro jest wykorzystanie rusztowań ECM specyficznych dla narządów. Każdy narząd zapewnia unikalną kompozycję białek i proteoglikanów, aby stworzyć nisze komórkowe. Nisze zapewniają strukturalny, funkcjonalny, a nawet enzymatyczny rozkład macierzy zewnątrzkomórkowej, przyczyniając się do sygnalizacji biofizycznej. Aby uzyskać mikrośrodowisko in vitro najbardziej zbliżone do mikrośrodowiska in vivo, zastosowanie ECM specyficznego dla tkanek zoptymalizowałoby nisze komórkowe do badań. 
Celem tego protokołu jest dostarczenie metody tworzenia hydrożelowego rusztowania unikalnego dla ECM płuc. Metoda ta stanowi platformę do badań in vitro nad interakcjami komórka płuca z ECM.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Stosować w dygestoriach z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Stosować w kapturze z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Brak</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Brak</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Stosować w dygestoriach z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Stosować w dygestorium z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-151</td><td>Brak</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pompka ręczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td> N<td>/A</td></tr><tr><td>Zlewka podyplomowa</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Używać rękawic kriogenicznych i oczu ochrona.</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Używaj rękawiczek.</td></tr><tr><td>Reometr</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Używać rękawic i ochrony oczu.</td></tr></tbody></table>

przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3d

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia wieloskładnikowych hydrożeli do hodowli komórek płuc in vitro. Zaczynając od zdrowej en bloc tkanki płucnej świni, szczura lub myszy, tkanka jest perfundowana i zanurzana w kolejnych detergentach chemicznych w celu usunięcia resztek komórkowych. Porównanie histologiczne tkanki przed i po przetworzeniu potwierdza usunięcie ponad 95% dwuniciowego DNA, a barwienie alfa galaktozydazą sugeruje, że większość resztek komórkowych została usunięta. Po decelularyzacji tkanka jest liofilizowana, a następnie kriomielona na proszek. Proszek matrycy jest trawiony przez 48 godzin w kwaśnym roztworze do wytrawiania pepsyny, a następnie neutralizowany w celu utworzenia roztworu preżelu. Żelowanie roztworu preżelu może być wywołane przez inkubację w temperaturze 37 °C i może być stosowane natychmiast po neutralizacji lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Powłoki można formować przy użyciu roztworu preżelu na nieobrobionej płytce do mocowania komórek. Komórki mogą być zawieszone w żelu wstępnym przed samoorganizacją w celu uzyskania kultury 3D, posianej na powierzchni utworzonego żelu, z którego komórki mogą migrować przez rusztowanie, lub posianej na powłokach. Zmiany w przedstawionej strategii mogą mieć wpływ na temperaturę, wytrzymałość lub rozmiary fragmentów białka. Poza tworzeniem hydrożelu, sztywność hydrożelu można zwiększyć za pomocą genipiny.

Stosując tę metodę, otrzymaliśmy hydrożele z prawidłowych płuc świni, szczura oraz myszy (Rysunek 1). Przetworzone płuca dostarczają szacunkowo odpowiednio 5 mg, 40 mg i 10 g proszku ECM. Przegląd procesu przedstawiono na Rysunku 2. Kluczowe obserwacje podczas procesu obejmują: biały wygląd płuc po płukaniu z deoksycholanu; po utworzeniu preżelu roztwór powinien być mętny i pozostawać jednorodny przez wiele miesięcy, jeśli jest przechowywany w 4 °C. Dołąc...

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Ogólnym celem tej metody wytwarzania spersonalizowanych hydrożeli jest badanie komórek i warunków hodowli, które odzwierciedlają złożoność macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu pulmonologii, takie jak sposób, w jaki komórki płuc oddziałują z ECM w warunkach zdrowych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dostosowania hydrożeli ECM płuc do konkretnego zastosowania w hodowli 2D lub 3D.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na złożoność technik decelularyzacji, które niekiedy wymagają zaangażowania kilku osób oraz szczególnej dbałości o szczegóły w celu optymalizacji ilości żywej tkanki. Do wykonania niniejszego protokołu należy przygotować płuco świńskie do decelularyzacji. Szczegółowe informacje na temat jego przygotowania znajdują się w protokole tekstowym.Po przygotowaniu płuca należy użyć pompy ręcznej z kaniulą dopasowaną do tętnicy płucnej. Najpierw należy wprowadzić około jednego litra wody do naczyń krwionośnych, a następnie 1,5 litra do tchawicy. Czynność tę należy powtórzyć trzykrotnie, zwiększając objętość perfuzowanej wody w miarę usuwania resztek komórkowych.Następnie, używając pompy ręcznej, przeprowadź perfuzję tkanki roztworem Triton X-100. Potem zanurz tkankę w kąpieli z roztworem Triton X-100 w temperaturze czterech stopni Celsius za 24 godziny. Po 24 godzinach trzykrotnie przepłucz naczynia krwionośne i tchawicę wodą destylowaną.Po płukaniu użyj pompy ręcznej, aby przemyć tkankę deoksycholanem. Następnie zanurz tkankę w deoksycholanie na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wypłucz tkankę trzy razy wodą destylowaną, tak jak wcześniej.Po płukaniu należy użyć pompy ręcznej, aby przepłukać tkankę przefiltrowanym chlorkiem sodu. Następnie tkankę zanurza się w przefiltrowanym chlorku sodu na jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Po kąpieli naczynia krwionośne oraz tchawicę przepłukuje się trzy razy wodą destylowaną w celu oczyszczenia.Po płukaniu przeprowadź perfuzję tkanki roztworem DNazy, a następnie zanurz ją w roztworze DNazy na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie przeprowadź pięciokrotną perfuzję naczyń krwionośnych i tchawicy przy użyciu PBS, a nie wody. Następnie, używając wyłącznie nieprzezroczystej białej tkanki, wypreparuj wszystkie cewki o średnicy dwóch milimetrów lub większej.Występują one głównie wokół wnęki i w przyśrodkowych częściach płuc. Pozostaw nienaruszone strefy oddechowe, które znajdują się głównie w obwodzie. Po usunięciu rurek podziel tkankę na sekcje o wielkości jednego cala lub mniejsze.Orientacja tych bloków nie ma znaczenia. Po odsączeniu bloków tkankowych należy przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zamrozić w temperaturze 80 °C. Kilka bloków można odłożyć do badań histologicznych w celu potwierdzenia usunięcia komórek i zanieczyszczeń.Aby przetworzyć tkankę płucną na zdecelularyzowany proszek, należy zastąpić pokrywkę probówki z zamrożoną tkanką papierem filtracyjnym i zabezpieczyć go gumką recepturką. Następnie tkankę należy liofilizować w liofilizatorze zgodnie z instrukcjami producenta, aż do całkowitego usunięcia nadmiaru cieczy. Następnie tkankę należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu jej zmielenia.Aby przygotować młyn, należy najpierw napełnić go ciekłym azotem, pozostawiając miejsce na probówkę do mielenia. Następnie z probówki należy wyjąć magnetyczny pręt mielący i przykryć dno probówki tkanką. Po tym należy ponownie umieścić pręt mielący i luźno dołożyć więcej tkanki, aby wypełnić probówkę.Następnie zamknąć probówkę do mielenia, umieścić ją w zamrażarce/młynku i wypełnić młynek ciekłym azotem do maksymalnej pojemności. Teraz uruchomić młynek na około pięć minut z częstotliwością uderzeń wynoszącą około 600 na minutę. Następnie przechowywać zdecelularyzowany proszek w temperaturze -80 °C do momentu użycia.Aby przygotować materiał przedżelowy, należy dodać sproszkowaną tkankę zdecelularyzowaną oraz pepsynę do probówki stożkowej. Następnie do probówki należy dodać 0,01 molarny kwas solny, aby uzyskać końcowe stężenie 1% sproszkowanej tkanki zdecelularyzowanej i 0,01% pepsyny. Roztwór ten należy utrzymywać w stałym mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 48 godzin w celu strawienia tkanek.Po 48 godzinach umieścić roztwór w lodzie na pięć minut. Następnie dostosować pH roztworu do wartości 7,4, używając zimnego 0,1 molarnego wodorotlenku sodu, a potem doprowadzić stężenie PBS w roztworze do 1X poprzez dodanie 10X PBS. Posiadamy doświadczenie w modyfikowaniu czasu oraz pH pre-żelu.Zakres ten jest w pewnym stopniu elastyczny, jednak właściwości mogą ulec gwałtownej zmianie nawet przy niewielkich modyfikacjach procedury. Roztwór nie jest uznawany za pre-żel i może być stosowany do powlekania niepowlekanych płytek w celu tworzenia hydrożeli, na których hoduje się komórki, lub hydrożeli, w których hoduje się komórki; może być również dodatkowo modyfikowany przed formowaniem hydrożeli w celu zwiększenia ich sztywności. Aby hodować komórki na dwuwymiarowej mikroporowatej powłoce żelowej, należy dodać 20 µL roztworu pre-żelu do dołków niepowlekanej 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek.Następnie należy przechowywać płytkę w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C, aby białka zostały zaabsorbowane na powierzchni płytki. Następnego dnia należy odessać roztwór pre-żelowy i przepłukać dołki roztworem PBS. Następnie do każdego dołka należy dodać 3 200 komórek i uzupełnić objętość medium w każdym dołku do 100 µL.Następnie można inkubować płytki. W przypadku trójwymiarowej hodowli komórkowej z komórkami wewnątrz żelu mikroporowatego, należy resuspendować odpowiednie komórki w stężeniu jeden milion na mililitr w roztworze przedżelowym. Następnie szybko nanieść 16 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej, aby utworzyć trójwymiarową hodowlę komórkową o grubości około 500 µm.Żel utworzy się w ciągu 30 minut po inkubacji w temperaturze 37 °C. Po utworzeniu się żeli, należy dopełnić studzienki pożywką do poziomu 100 µl. W przypadku trójwymiarowej hodowli komórkowej z komórkami na powierzchni żelu mikroporowatego, należy dodać 100 µl roztworu przedżelowego do studzienek niepowlekanej płytki 96-dołkowej.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez 30 minut do czasu żelowania. Po utworzeniu się żeli, nanieś 3 200 komórek w 100 µL pożywki na powierzchnię hydrożeli i przystąp do inkubacji płytki. Hydrożele przygotowano z prawidłowych płuc świni, szczura i myszy zgodnie z opisaną metodą.Badania reologiczne potwierdziły, że ponad 90% żelowania zachodzi w pierwszych minutach po osiągnięciu 37 °C. Powstałe hydrożele były stabilne przez długi czas w PBS, jednak adhezja i proliferacja komórek mogą zmieniać się w czasie. Roztwór przedżelowy został przetestowany jako powłoka w celu poprawy adhezji komórek.Przyczepność i proliferację ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej mierzono za pomocą testu MTTSA. Poprawę zaobserwowano po pokryciu dołków ECM. Podczas przygotowywania żeli 3D dodanie genipiny zwiększyło stopień sieciowania hydrożelu.Wykorzystując pomiary zmiennej częstotliwości na reometrze, wykazano bezpośrednią korelację sztywności hydrożelu z stężeniem genipiny, przy czym stężenie medianowe i najbardziej istotne wyniosło 0,01%. Podczas testowania sztywniejszych żeli, za pomocą testu MTTS stwierdzono wyższą proliferację komórek na żelach o zwiększonym stopniu sieciowania. Po opanowaniu procedury, decelularyzacja może zostać przeprowadzona w ciągu ośmiu godzin rozłożonych na cztery dni. Roztwór przedżelowy można przygotować w ciągu jednej godziny w ciągu dwóch dni, a formowanie żelu może zostać zrealizowane w ciągu dwóch godzin w ciągu dwóch dni.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak AFM, western blot, barwienie i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, dotyczące np. modułu sprężystości, składu białkowego oraz odpowiedzi komórkowej na materiał.

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Poznaj metodę tworzenia hydrożeli z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D. Technika dekompozycji tkanki wieprzowej umożliwia badanie interakcji komórek płucnych z ECM w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Przeglądaj więcej filmów