Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie wszechstronnego podejścia do projektowania bioatramentów hydrożelowych, które mogą być ekstrudowane za pomocą urządzeń do biodruku. Bioatramenty te mogą być następnie wykorzystane do wytwarzania trójwymiarowych konstruktów tkankowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biodruku, takie jak sposób kontrolowania właściwości mechanicznych niezbędnych do uzyskania materiału, który można ekstrudować przy użyciu biodrukarki.

Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie dostępnych komercyjnie komponentów połączonych w sposób modułowy w celu stworzenia prostego i skutecznego bioatramentu z hydrożelu nadającego się do biodruku. Zastosowania tych technologii obejmują tworzenie trójwymiarowych organoidów tkankowych, które mogą być wykorzystywane do dokładnego modelowania wpływu leków, toksyn i chorób. Chociaż metoda ta może stanowić podstawę do biodruku 3D konstruktów wątroby, może ona być zastosowana również do innych typów tkanek, takich jak mięśnie, płuca i jelito grube.

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności ze względu na liczbę różnych odczynników stosowanych do tworzenia bioatramentu hydrożelowego, jednak w rzeczywistości procedura ta jest dość prosta. Przebieg procedury zaprezentuje Young-Joon Seol, postdoc w naszym zespole. Na początek należy przygotować trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla danej tkanki, która zostanie wykorzystana w formulacji hydrożelu, zgodnie z opisem zawartym w innym źródle.

Następnie rozpuścić fotoinicjator w wodzie, zachowując stosunek masy do objętości na poziomie 0,1%. Aby przygotować bioatramenty do hydrożelu, najpierw rozpuścić podstawowe komponenty materiałowe z zestawów do hydrożelu z kwasu hialuronowego w oddzielnych alikwotach wodnego roztworu fotoinicjatora. Następnie połączyć roztwór ECM, 2% tiolowanego kwasu hialuronowego, 2% tiolowanej żelatyny, sieciujące oraz pożywkę do hodowli hepatocytów w proporcjach przedstawionych tutaj. Aby poprawić właściwości ekstruzyjne bioatramentu, dodać do mieszaniny 1,5 mg/mL niemodyfikowanego kwasu hialuronowego oraz 30 mg/mL żelatyny.

Następnie wymieszaj powstałą mieszaninę za pomocą wortexa na wysokich obrotach przez dziesięć sekund przed użyciem. Przed przetestowaniem bioatramentu w urządzeniu do biodruku należy najpierw sprawdzić właściwości ekstruzji na stole laboratoryjnym. Używając standardowej strzykawki, nanieś próbkę bioatramentu, a następnie przymocuj do strzykawki igłę o rozmiarze od 20 do 30 G.

Pozostaw biotusz do czasu sieciowania, a następnie przetłocz go przez igłę, aby uzyskać gładkie filamenty hydrożelu. Jeśli formulacja pozwala na utworzenie filamentu z niewielką liczbą grudek lub bez nich, jest ona gotowa do biodruku. Aby załadować przygotowane biotusze do biodrukarki, pipetuj je do sterylnych wkładów drukarki.

Pozostaw je na 30 minut przed ekstruzją, ponieważ bioink przejdzie spontaniczną pierwszą fazę sieciowania wewnątrz wkładu. Następnie umieść wkład w urządzeniu do drukowania i podłącz do niego pneumatyczne źródło ciśnienia. Przygotuj prosty wzór, taki jak ta siatka linii równoległych o wymiarach siedem na siedem milimetrów, aby wydrukować go w celu oceny kompatybilności ekstruzyjnej.

Podczas gdy głowica drukująca porusza się w płaszczyźnie XY z prędkością około 300 millimeters per minute, należy przyłożyć ciśnienie 20 kilopascals do wkładu, aby wycisnąć bioatrament. Jeśli wyciśnięte materiały są grudkowate lub nieregularne, należy zmniejszyć ilość dodanego sieciującego w celu zmiękczenia materiału sieciowanego w pierwszym etapie. Prawidłowo przygotowany bioatrament powinien być wyciskany płynnie, co pozwala na precyzyjne nanoszenie i tworzenie struktur.

Przygotuj trójwymiarowe sferoidy z pierwotnych komórek wątroby na płytce 96-dołkowej, stosując metodę wiszących kropel zgodnie z opisem w załączonym protokole tekstowym. Po trzech dniach hodowli zbierz sferoidy wątrobowe z płytki do wiszących kropel za pomocą pipety i przenieś je do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Pozostaw sferoidy na jedną lub dwie minuty, aby osiąły dno probówki stożkowej.

Następnie ostrożnie odessaj medium za pomocą pipety. Przenieś od 110 do 125 procent pożądanej objętości drukowanego konstruktu 3D z nowo przygotowanego roztworu bioatramentu hydrożelowego do probówki stożkowej zawierającej sferoidy. Następnie ostrożnie pipetuj sferoidy w górę i w dół, aby zawiesić je ponownie w roztworze bioatramentu hydrożelowego.

Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny, przenieś roztwór sferoidów do wkładu biodrukarki za pomocą pipety i pozostaw roztwór na 30 minut w celu przeprowadzenia pierwszego etapu sieciowania. Po zakończeniu tego etapu sieciowania, użyj urządzenia do biodruku, aby stworzyć pożądane struktury hydrożelowe zawierające pierwotne sferoidy wątroby. Po nałożeniu każdej warstwy poddaj wydrukowany bioatrament działaniu światła UV przez dwie do czterech sekund, aby zainicjować wtórny mechanizm sieciowania.

Działanie to ustabilizuje konstrukty i zwiększy ich sztywność do pożądanego poziomu. Stężenie alkinu PEG w roztworze kontroluje całkowitą gęstość sieciowania, a tym samym w głównej mierze warunkuje sztywność końcowego konstruktu. Po biodruku, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, zaobserwowano wysoką żywotność komórek w konstruktach wątrobowych.

W optymalnych warunkach środowiskowych żywotność powinna przekraczać 85%. Ponadto, po zabarwieniu konstruktów na markery charakterystyczne dla tkanki wątroby, zaobserwowano pozytywną ekspresję CYP3A4 (izoformy cytochromu P450), wewnątrzkomórkowej albuminy, E-kadheryny (białka adhezji międzykomórkowej nabłonka) oraz DPP4 (białka wykazującego wysoką ekspresję w wątrobie). Po zbadaniu poziomu mocznika i albuminy w pożywce hodowlanej stwierdzono, że konstrukt wydzielał zarówno mocznik, jak i albuminę na stałym poziomie w ciągu 14 dni. Sugeruje to ponadto, że bioatramenty hydrożelowe specyficzne dla danej tkanki pomagają w utrzymaniu funkcji komórek wątroby.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces może zająć około dwóch godzin. Zależy to jednak często od rodzaju zastosowanego urządzenia do biodruku. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zaprezentowane kroki często wymagają dostosowania, aby były kompatybilne z innymi typami tkanek lub urządzeniami do biodruku.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można stworzyć inne formulacje biotuszu hydrożelowego w celu wsparcia biodruku innych typów tkanek. Rozwój tych technologii pomógł utorować drogę do tworzenia wieloorganoidalnych platform typu body-on-a-chip do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zacząć projektować materiały, które mogą być wykorzystane do biodruku trójwymiarowych konstruktów tkankowych z zastosowaniem wieloetapowego sieciowania.

Należy pamiętać, że praca z promieniowaniem ultrafioletowym może być niezwykle niebezpieczna dla wzroku, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak używanie gogli ochronnych z filtrem UV.