Name: Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę bioprintingu komórkowych konstruktów 3D przy użyciu hydrożelowego biotuszu naśladującego tkankę. Technika umożliwia tworzenie funkcjonalnych organoidów do badań in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie przez Defense Threat Reduction Agency (DTRA) w ramach kontraktu Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) nr N6601-13-C-2027. Publikacja niniejszego materiału nie jest równoznaczna z aprobatą rządu dla zawartych w nim ustaleń lub wniosków.

1. Preparaty i przygotowanie hydrożelowego biotuszu
<ol>
	<li>W celu uzyskania specyficznych dla tkanek profili biochemicznych należy przygotować specyficzne tkankowo roztwory trawienia ECM, jak opisano wcześniej dla wątroby. 20 
	Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, ten ekstrakt ECM będzie zawierał 40% końcowej objętości biotuszu hydrożelowego, która jest stosowana. Można przygotować kilkaset mililitrów roztworu mineralizującego ECM, podzielić go na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przed preparatem hydrożelowym należy rozpuścić fotoinicjator, 2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon, w wodzie o stężeniu 0,1% w/v. 
	Uwaga: Objętości w zakresie 50-100 ml można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w osłonie przed światłem w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Aby utworzyć biotusze hydrożelowe, najpierw rozpuść składniki materiału bazowego z zestawów hydrożelowych kwasu hialuronowego (HA) w roztworze wodno-fotoinicjatora.
	<ol>
		<li>Tiolowany kwas hialuronowy i tioloowaną żelatynę rozpuścić oddzielnie w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2) do uzyskania 2% w/v roztworów.</li>
		<li>Rozpuść dikrylan glikolu polietylenowego (PEGDA), środek sieciujący w zestawach hydrożelowych, w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2), aby uzyskać 8% roztwór w/v.</li>
		<li>Rozpuść glikol polietylenowy (PEG) 8-ramienny alkin (10 kDa MW) w roztworze wodno-fotoinicjatora (krok 1.2), aby uzyskać 8% roztwór w/v.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólnie rzecz biorąc, formuj hydrożele według poniższego schematu, chociaż możliwe jest dodatkowe dostosowanie.
	<ol>
		<li>Połącz 4 części 2% tiolowanego HA, 4 części 2% tiolowanej żelatyny, 1 część środka sieciującego 1, 1 część środka sieciującego 2 z 8 częściami tkankowego roztworu ECM i 2 częściami pożywki do hodowli hepatocytów (HCM) (lub 10 częściami wody jako generyczny hydrożel niespecyficzny dla tkanki). 
		Uwaga: Można dodać dodatkowy niemodyfikowany kwas hialuronowy lub żelatynę, aby biotusz wytłaczał się płynniej. Zostało to opisane poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiruj powstałą mieszaninę na wysokich obrotach (prędkość 10 z 10) przez 10 sekund, aby wymieszać przed użyciem.</li>
	<li>Stosowanie biotuszu hydrożelowego
	<ol>
		<li>W przypadku testów wytłaczania lub biodruku należy przenieść mieszaninę do strzykawki lub wkładu do drukarki i pozostawić do spontanicznego sieciowania przez 30 minut (etap 1 sieciowanie) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku pomiarów reologicznych przenieść mieszaninę na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i pozostawić do sieciowania przez 30 min. 
		Uwaga: Mieszanina natychmiast zaczyna sieciować poprzez tworzenie wiązań tiolowo-akrylowych i zacznie zwiększać lepkość. Mieszaninę należy przenieść do strzykawki, wkładu drukującego lub miejsca docelowego w ciągu 10 minut, aby uniknąć zatkania pipety lub strzykawki podczas przenoszenia.</li>
		<li>Gdy pożądane jest wtórne sieciowanie (etap 2), należy napromienić usieciowane żele etapu 1 światłem ultrafioletowym (365 nm, 18 W/cm2) w celu zainicjowania reakcji polimeryzacji tiolowo-alkinowej. 
		Uwaga: Czas naświetlania zależy od powierzchni materiału. Ogólnie rzecz biorąc, centymetr kwadratowy materiału wymaga tylko 1-2 sekund ekspozycji na promieniowanie UV przy tej mocy promieniowania UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testowanie kompatybilności drukarki
<ol>
	<li>Przed testami integracyjnymi z urządzeniami biodrukującymi, przetestuj charakterystykę wytłaczania na stanowisku laboratoryjnym za pomocą prostych testów wytłaczania przy użyciu standardowych strzykawek i końcówek igieł o małej średnicy (rozmiar 20-30).
	<ol>
		<li>Przepchnij biotusz przez standardową strzykawkę, aby uzyskać gładko wytłaczane włókna hydrożelu z niewielką liczbą wybrzuszeń lub bez wybrzuszeń. Wyciąganie linii lub prostych wzorów jest wystarczające, aby określić sukces.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu integracji z biodrukarką należy załadować preparaty biotuszu, pipetując je do wkładów do drukarki i odczekać 30 minut, aż biotusz przejdzie spontaniczne sieciowanie w etapie 1 we wjeździe. 
	Uwaga: Objętość biotuszu zależy od konkretnego zastosowania i powinna być określona przez użytkownika. Wkłady do drukarek mogą przypominać lub być strzykawkami, które są kompatybilne z urządzeniem bioprinter.</li>
	<li>Oceń kompatybilność ekstruzji dla biodruku, drukując prosty wzór przy użyciu biotuszu. Na przykład wydrukuj wzór o wymiarach 7 x 7 mm składający się z równoległych linii. Zastosuj nacisk (np. nacisk pneumatyczny 20 kPa), podczas gdy głowica drukująca porusza się w płaszczyźnie X-Y z prędkością około 300 mm/min. 
	Uwaga: Można stosować dysze głowic drukujących o różnych średnicach, ale dysze stożkowe z otworami o średnicy 400-500 μM są optymalne do drukowania sferoid w zakresie 250-350 μm.
	<ol>
		<li>Jeśli wytłaczane materiały są grudkowate lub nieregularne, patrz krok 2.4 lub zmniejsz ilość PEGDA, aby zmiękczyć materiał usieciowany etapu 1. Odpowiednio przygotowane receptury biotuszu wytłaczają się płynnie, umożliwiając precyzyjne osadzanie w pożądanych wzorach lub architekturach. 
		Uwaga: Opisane procedury biodrukowania wykorzystują niestandardowe urządzenie do biodruku 3D zaprojektowane specjalnie do drukowania konstruktów tkankowych. 32 W związku z tym poszczególne parametry drukowania różnią się znacznie w zależności od typu urządzenia i wymagają testowania przez użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby poprawić właściwości ekstruzji, należy uzupełnić niemodyfikowany kwas hialuronowy i żelatynę do biotuszów (odpowiednio 1,5 mg/ml i 30 mg/ml).</li>
</ol>
3. Walidacja za pomocą Bioprinting z podstawowymi konstruktami wątroby
<ol>
	<li>Przygotuj sferoidy wątroby 3-D z pierwotnymi komórkami za pomocą metod zawieszania kropli jako składnika komórkowego33 
	Uwaga: Bioprinting można wykonać bez sferoid, ale zamiast tego z pojedynczymi komórkami zawieszonymi w hydrożelowych biotuszach. Sferoidy są tutaj wykorzystywane do przyspieszania interakcji komórka-komórka i konstruowania funkcjonalności. Liczba zastosowanych sferoid lub komórek zależy od konkretnego zastosowania i powinna być określona przez użytkownika. Czynności te należy wykonywać w sterylnych warunkach, przy użyciu sterylnych materiałów.
	<ol>
		<li>Przygotować HCM, dodając rozmrożoną zawartość zestawu składników suplementu HCM do podłoża podstawowego hepatocytów (HBM) i sterylnie filtrując.
		<ol>
			<li>Rozmrozić składniki suplementu do uzyskania płynu.</li>
			<li>Dodać składniki suplementu (kwas askorbinowy, 0,5 ml; albumina surowicy bydlęcej [bez kwasów tłuszczowych], 10 ml; siarczan gentamycyny/amfoterycyna B, 0,5 ml; 21-hemibursztynian hydrokortyzonu, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu, 0,5 ml; przenoszenie, 0,5 ml) do 500 ml HBM.</li>
			<li>Sterylny filtr przez filtr 0,45 μm lub 0,22 μm za pomocą filtra butelkowego lub filtra strzykawkowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ gęstość komórek pierwotnych ludzkich hepatocytów, komórek Kupffera i komórek gwiaździstych, licząc na hemocytometrze po rozmrożeniu każdego typu komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Połącz pierwotne ludzkie hepatocyty, komórki Kupffera i komórki gwiaździste w stosunku 80:10:10 do liczby komórek w pożywce HCM, która została podgrzana do 37 °C w stożkowej probówce. 
		Uwaga: Objętość nośnika, który ma być używany, zależy od ogólnej liczby komórek specyficznej dla aplikacji i powinna być określona przez użytkownika.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 520 x g w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant, pozostawiając osad komórkowy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce HCM, aby uzyskać zawiesinę komórkową zawierającą 1,000 komórek na 40 μl pożywki. Całkowita objętość zależy od liczby wytwarzanych sferoid.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek na wiszące płytki kroplowe w formacie 96-dołkowym. Dodaj w sumie około 1000 komórek do każdej studzienki w HCM i utrzymuj w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 przez 3 dni, podczas których tworzą się wielokomórkowe sferoidy.</li>
		<li>Zebrać sferoidy wątroby z wiszącej płytki kroplowej za pomocą pipetora. Przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sferoidy wątroby Bioprint w biotuszu hydrożelowym specyficznym dla wątroby
	<ol>
		<li>Przygotuj preparat biotuszu hydrożelowego zawierającego ECM wątroby, jak opisano w kroku 1, wykorzystując 8% PEGDA i 8% 8% alkinu PEG jako środki sieciujące. Użyj tej kombinacji ze względu na jej zdolność do uzyskania hydrożelu o module sprężystości zbliżonym do natywnej tkanki wątroby.</li>
		<li>Niech sferoidy osiądą na dnie stożkowej rurki, w której zostały umieszczone w kroku 3.1.7. Różni się to w zależności od wielkości i gęstości sferoidy, ale zwykle występuje w ciągu 1-2 minut. Usunąć wszystkie podłoża ostrożnie odsysając je lub używając pipetora.</li>
		<li>Przenieś żądaną objętość świeżo przygotowanego roztworu hydrożelowego biotuszu do stożkowej rurki zawierającej sferoidy. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiednia objętość jest o 10%-25% większa niż objętość konstrukcji 3D, która ma zostać wydrukowana. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić sferoidy w hydrożelowym roztworze biotuszu. Przenieść do wkładu z biodrukarką za pomocą pipetora lub pipety serologicznej.</li>
		<li>Wewnątrz wkładu do biodrukarki pozwól, aby roztwór przeszedł pierwszy etap sieciowania (reakcja tiolowo-akrylowa) przez 30 min. 
		Uwaga: W zależności od rozmiaru sferoidy, może być konieczne powolne obracanie wkładu lub może być konieczne wymieszanie zawartości ze sterylną szpatułką, aby utrzymać sferoidy rozprowadzone w całym biotuszu podczas sieciowania na etapie 1. Jest to mniej konieczne w przypadku biotuszów przygotowanych z zawieszonych komórek zamiast sferoidów. 
		Uwaga: Po etapie sieciowania 1 użytkownicy mają do dyspozycji kilkugodzinne okno operacyjne. Zaleca się jednak szybkie przeprowadzenie procesu biodrukowania, aby poprawić żywotność komórek.</li>
		<li>Po usieciowaniu etapu 1 użyj urządzenia do biodrukowania, aby utworzyć pożądane struktury hydrożelowe zawierające pierwotne sferoidy wątroby (lub inne komórki). 
		Uwaga: Ta technologia zapewnia system do biofabrykacji szerokiej gamy konstrukcji. Parametry takie jak objętość całkowita, liczba komórek lub sferoid, geometria drukowanej struktury i podłoże, na którym drukowane są konstrukcje, są w dużym stopniu zależne od celów użytkownika.</li>
		<li>Po osadzeniu do żądanej konfiguracji podawaj światło UV przez 2-4 sekundy, aby zainicjować wtórny mechanizm sieciowania, stabilizując konstrukcje i zwiększając sztywność do pożądanego poziomu. 
		Uwaga: Stężenie PEG-alkinu, a tym samym ogólna końcowa gęstość usieciowania, przede wszystkim kontroluje końcową sztywność konstrukcji.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.4 i 3.2.5, aby utworzyć konstrukcje wielowarstwowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Visconti, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+organ+printing%3A+engineering+an+intra-organ+branched+vascular+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree.</a> Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+and+prototyping+of+tissues+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing and prototyping of tissues and scaffolds.</a> Science. 338, 921-926 (2012).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrices+for+skeletal+tissue+engineering%3A+state-of-the-art+and+novel+application+in+organ+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing.</a> Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).</li>
<li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+organ+printing+2%3A+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+A+Discov+Mol+Cell+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMironov%2C+V+%22Regen+Med%22">Regen Med</a>. 3, 93-103 (2008).</li>
<li>Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+integration+with+3-d+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for integration with 3-d bioprinting.</a> Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+vessel-like+constructs+using+hyaluronan+hydrogels+crosslinked+with+tetrahedral+polyethylene+glycol+tetracrylates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates.</a> Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).</li>
<li>Bertassoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+bioprinting+of+cell-laden+methacrylated+gelatin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels.</a> Biofabrication. 6, 024105(2014).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+crosslinked+gold+nanoparticle+-+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels.</a> Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+two-step+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinted+amniotic+fluid-derived+stem+cells+accelerate+healing+of+large+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+printing+of+mechanically+and+biologically+improved+constructs+for+cartilage+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications.</a> Biofabrication. 5, 015001(2013).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+heterogeneous+tissue+constructs+containing+multiple+cell+types+prepared+by+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 34, 130-139 (2013).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+versus+lyophilized+forms+of+porcine+extracellular+matrix+derived+from+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder.</a> J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+synthetic+ECM+hydrogels+for+3-D+in+vitro+maintenance+of+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function.</a> Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).</li>
<li>Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+ECM+scaffolds+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Injectable ECM scaffolds for cardiac repair.</a> Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).</li>
<li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+comm%22%5BJournal%5D)">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nat comm. 5, 3935(2014).</li>
<li>Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+properties+of+cross-linked+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering.</a> Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).</li>
<li>Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cardiomyocytes+beat+best+on+a+matrix+with+heart-like+elasticity%3A+scar-like+rigidity+inhibits+beating%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating.</a> J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+collagen-coated+gels+that+maximize+in+vitro+myogenesis+of+stem+cells+by+matching+the+lateral+elasticity+of+in+vivo+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle.</a> Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).</li>
<li>Lozoya, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+stem%2Fprogenitor+phenotype+by+microenvironment+stiffness+in+hydrogel+models+of+the+human+liver+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche.</a> Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+provides+mechanical+signals+for+the+expansion+of+hemopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).</li>
<li>Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+controls+cell+proliferation%2C+surface+marker+expression+and+motile+phenotype+in+amniotic+fluid-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+Engineering+hydrogels+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication.</a> Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).</li>
<li>Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. , 2012/00889238 A1 (2011).</li>
<li>Drewitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+production+and+drug+sensitivity+testing+using+scaffold-free+spherical+tumor+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues.</a> Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel+bioink+toolkit+for+mimicking+native+tissue+biochemical+and+mechanical+properties+in+bioprinted+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs.</a> Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).</li>
<li>Peattie, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+in+vivo+angiogenesis+by+cytokine-loaded+hyaluronic+acid+hydrogel+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants.</a> Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+with+naturally+derived+scaffolds+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+vivo+with+adipose-derived+stem+cells+on+naturally+derived+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+synthetic+extracellular+matrix+on+vocal+fold+lamina+propria+gene+expression+in+early+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing.</a> Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+tissue+repair+in+vivo+using+a+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+defect+repair+with+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+an+injectable%2C+in+situ%2C+cross-linked+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+repair+of+cortical+bone+defects+using+a+synthetic+extracellular+matrix+to+deliver+human+demineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix.</a> J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+extracellular+matrices+with+cleavable+crosslinkers+for+cell+expansion+and+easy+cell+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery.</a> Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).</li>
<li>Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+10.14%2C+Use+of+hyaluronan-derived+hydrogels+for+three-dimensional+cell+culture+and+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).</li>
<li>Xu, X., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+growth+and+angiogenesis+by+a+lysophosphatidic+acid+antagonist+in+an+engineered+three-dimensional+lung+cancer+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model.</a> Cancer. 116, 1739-1750 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+orthotopic+cancer+models+in+mice+using+cell-loaded%2C+injectable%2C+cross-linked+hyaluronan-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels.</a> Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Tumor+Hybrid+Organoids+for+Modeling+Tumor+Growth+and+Drug+Response+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro.</a> Ann Biomed Eng. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka elementów, które należy wziąć pod uwagę podczas próby biofabrykacji konstruktów tkanek 3D, do ewentualnego zastosowania u ludzi lub do zastosowań przesiewowych in vitro . Zastosowanie odpowiednich komponentów komórkowych określa potencjalną funkcjonalność końcową, podczas gdy samo urządzenie do biofabrykacji określa ogólną metodologię osiągnięcia konstruktu końcowego. Trzeci składnik, biomateriał, jest równie ważny, ponieważ pełni podwójną rolę. W szczególności komponent biomateriałowy musi być ko...

W ostatnich latach dostępne stały się różne technologie, które zaspokajają zapotrzebowanie na alternatywne źródła funkcjonalnych organów i tkanek poprzez ich produkcję lub biofabrykację. Bioprinting okazał się jedną z najbardziej obiecujących z tych technologii. Bioprinting można traktować jako formę robotycznego wytwarzania przyrostowego części biologicznych, które można wykorzystać do budowy lub modelowania żywotnych struktur przypominających narządy lub tkanki w 3 wymiarach. 1 W większości przypadków biodruk wykorzystuje trójwymiarowe (3-D) urządzenie drukujące, które jest kierowane przez komputer w celu osadzenia komórek i biomateriałów w precyzyjnych pozycjach, odtwarzając w ten sposób anatomicznie naśladujące architektury fizjologiczne. 2 Urządzenia te drukują "biotusz", który może mieć postać agregatów komórkowych, komórek zamkniętych w hydrożelach lub lepkich płynach lub mikronośników wysiewanych przez komórki, a także bezkomórkowych polimerów, które zapewniają strukturę mechaniczną lub działają jako bezkomórkowe symbole zastępcze. 3,4 Po procesie biodrukowania otrzymana struktura może zostać dojrzała do postaci funkcjonalnych struktur tkankowych lub narządowych i wykorzystana do zamierzonego zastosowania końcowego. 5,6 Do tej pory nie wydrukowano kompletnego, w pełni funkcjonalnego narządu wielkości człowieka, ale pozostaje on głównym długoterminowym celem badań i rozwoju biodruku. 2 Jednak małe "organoidowe" konstrukty tkankowe są obecnie wdrażane w wielu zastosowaniach, w tym w modelowaniu patologii, opracowywaniu leków i badaniach toksykologicznych.
Jedną z głównych przeszkód, które napotkali badacze podczas stosowania technologii biodruku, jest to, że bardzo niewiele materiałów zostało opracowanych z myślą o konkretnym celu biodruku. Aby skutecznie odnieść sukces w biodruku, biomateriał musi spełniać 4 podstawowe wymagania. Biomateriał musi posiadać: 1) odpowiednie właściwości mechaniczne, aby umożliwić osadzanie (czy to wytłaczanie przez dyszę w postaci żelu, czy za pomocą drukarki atramentowej w postaci kropli), 2) zdolność do zachowania swojego kształtu jako składnika struktury 3D po osadzeniu, 3) zdolność do kontrolowania przez użytkownika 2 wcześniejszych cech, oraz 4) przyjazne i wspierające środowisko dla komórek na wszystkich etapach procedury biodruku. 7 Historycznie rzecz biorąc, prace biodrukarskie często próbowały wykorzystywać istniejące tradycyjne biomateriały w urządzeniach do biodruku, nie biorąc pod uwagę ich kompatybilności, zamiast zaprojektować biomateriał tak, aby posiadał właściwości niezbędne do biodruku i późniejszych zastosowań po drukowaniu.
Ostatnio opracowano różne rodzaje biotuszów, aby lepiej współpracować ze sprzętem do osadzania i produkcji. Standardowe systemy hydrożelowe stwarzają poważne problemy, ponieważ na ogół występują jako roztwory płynów prekursorowych o niewystarczających właściwościach mechanicznych lub spolimeryzowane hydrożele, które po wydrukowaniu mogą zatkać dysze lub ulec rozpadowi w procesie wytłaczania. Nasz zespół, a także inni, zbadali różne preparaty hydrożelowe w celu rozwiązania tych problemów związanych z biodrukowaniem, w tym drukowanie sferoidów komórkowych w podłożach hydrożelowych,5,8 wytłaczanie komórek i włókien hydrożelowych z probówek mikrokapilarnych,9-11 ekstrudowalne hydrożele z nanocząstek kwasu hialuronowego (HA)-złota o dynamicznych właściwościach sieciowania,12 czasowa kontrola sztywności hydrożelu za pomocą fotopolimeryzowanego metakrylowanu HA i żelatyny, 13 sieciowanie na bazie fibrynogenu i trombiny,14,15 żele alginianowo-kolagenowe z jonową wymianą,16 a ostatnio szybkie sieciowanie inicjowane światłem ultrafioletowym (UV),17
Te przykłady pokazują możliwość generowania materiałów, które można skutecznie drukować biologicznie. Jednak oprócz integracji ze sprzętem, aby z powodzeniem generować żywotne i funkcjonalne konstrukty tkankowe 3D, biomateriały muszą zawierać biochemiczne i mechaniczne wskazówki, które pomagają w utrzymaniu żywotności i funkcji komórek. Te dodatkowe czynniki, profile biochemiczne i mechaniczne, mogą mieć znaczący wpływ na pomyślne funkcjonowanie biodrukowanych konstruktów tkankowych.
Zarówno komórki, jak i natywna macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) są odpowiedzialne za dostarczanie innym komórkom szerokiego zakresu cząsteczek sygnałowych, takich jak czynniki wzrostu i inne cytokiny. Kombinacja tych sygnałów różni się w zależności od tkanki, ale może być niezwykle silna i wpływowa w regulacji zachowania komórek i tkanek. 18 Z powodzeniem zbadano wykorzystanie specyficznych tkankowo komponentów ECM z różnych narządów i zastosowanie ich jako hydrożelu lub jako części hydrożelu. 19-21 To podejście, które polega na decelularyzacji danej tkanki, sproszkowaniu jej i rozpuszczeniu, może być wykorzystane do wytwarzania specyficznych dla tkanki sygnałów biochemicznych z dowolnej tkanki i może być włączone do konstruktów hydrożelowych 3D. 22 Rozdział 22
Dodatkowo, jest szeroko udokumentowane, że tkanki w ciele mają szeroki zakres sztywności. 23 W związku z tym możliwość dostrajania właściwości mechanicznych biomateriałów, takich jak moduł sprężystości E' lub moduł sprężystości przy ścinaniu G', jest użytecznym narzędziem w inżynierii tkankowej. Jak opisano powyżej, kontrola nad właściwościami mechanicznymi biotuszu pozwala na biowytwarzanie oparte na wytłaczaniu przy użyciu miękkiego żelu, który można następnie dalej manipulować poprzez wtórne sieciowanie w późniejszym momencie, przy którym można osiągnąć poziomy modułu sprężystości odpowiadające typowi narządu docelowego. Na przykład, biomateriały można dostosować tak, aby odpowiadały sztywności 5-10 kPa, jak w przypadku natywnej wątroby,23 lub odpowiadały sztywności 10-15 kPa, jak w przypadku natywnej tkanki serca,24,25 teoretycznie zwiększając zdolność tych organoidów do funkcjonowania w podobny sposób, jak ich natywne odpowiedniki tkankowe. Wpływ sztywności środowiska na fenotyp komórki został zbadany w ostatnich latach, szczególnie w odniesieniu do komórek macierzystych. Engler i in. wykazali, że elastyczność substratu pomogła w kierowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kierunku linii o elastyczności tkanki dopasowanej do elastyczności substratu. 25 Koncepcja ta była dalej badana pod kątem różnicowania w mięśnie, czynność serca, fenotyp wątroby, proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych i utrzymanie potencjału terapeutycznego komórek macierzystych. 24,26-29 Zdolność do dostrojenia hydrożelu do różnych modułów sprężystości jest ważną cechą biomateriału, który będzie używany do biofabrykacji konstruktów tkankowych. Rozdział 30
Tutaj opisujemy protokół, który reprezentuje wszechstronne podejście stosowane w naszym laboratorium do sformułowania systemu hydrożelowego, który może być biodrukowany przez ekstruzję i dostosowany tak, aby 1) zawierał profil biochemiczny określonego typu tkanki i 2) naśladował moduł sprężystości tego typu tkanki. Wychodząc naprzeciw tym wymaganiom, dążymy do dostarczenia materiału, który może podsumować fizykochemiczne i biologiczne cechy tkanek in vivo. 31 Opisany w niniejszym dokumencie modułowy system kompozytów hydrożelowych wykorzystuje podejście polegające na sieciowaniu wielokrotnym w celu uzyskania wytłaczanych biotuszów i umożliwia wtórne sieciowanie w celu stabilizacji i zwiększa sztywność produktów końcowych w celu dopasowania do różnych typów tkanek. Dostosowanie biochemiczne jest spełnione dzięki zastosowaniu specyficznych dla tkanek komponentów ECM. Jako demonstrację wykorzystujemy specyficzną dla wątroby odmianę tego systemu hydrożelowego do biodruku funkcjonalnych konstruktów organoidów wątrobowych. Opisany protokół wykorzystuje niestandardowe urządzenie do biodruku 3D. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można dostosować do większości drukarek opartych na wytłaczaniu, konkretne parametry drukowania różnią się znacznie dla każdego typu urządzenia i wymagają przetestowania przez użytkownika.

<table><tbody><tr><td>Kwas hialuronowy</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw hydrożelu kwasu hialuronowego i żelatyny (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Zestaw zawiera składniki Heprasil (tiolowany i heparynizowany kwas hialuronowy), Gelin-S (tiolowany żelatyna) oraz Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&nbsp; kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie hepatocyty</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki gwiaździste wątroby</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki Kupffera</td><td>Technologie życia</td><td>HUKCCS</td> Hepatocyty <td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla hepatocytów Zestaw suplementów</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kit (zawiera kwas askorbinowy, 0,5&nbsp; Ml; Albumina surowicy bydlęcej [bez kwasów tłuszczowych], 10&nbsp; Ml; siarczan gentamycyny/amfoterycyna B, 0,5&nbsp; Ml; hydrokortyzon 21-hemibursztynian, 0,5&nbsp; Ml; insulina, 0,5&nbsp; Ml; ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu, 0,5&nbsp; Ml; przenoszenie, 0,5&nbsp; ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Inni producenci są ok.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Inni producenci są w porządku.</td></tr><tr><td>Świeże tkanki zwłok świń</td><td>n/</td><td>a n/d</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>dowolny</td><td>n/d</td><td></td></tr><tr><td>Młyn zamrażarczy</td><td>dowolny</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biodrukarka</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>Opisana tutaj biodrukarka została zbudowana na zamówienie we własnym zakresie. Ogólnie rzecz biorąc, inne urządzenia są odpowiednie, pod warunkiem, że obsługują sterowany komputerowo druk materiałów hydrożelowych oparty na wytłaczaniu.</td></tr><tr><td>Wisząca płytka do hodowli kropelkowej</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>Platforma hodowli 3D InSphero GravityPlus</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting pojawił się jako wszechstronne podejście do tworzenia konstruktów organów inżynierii tkankowej. Konstrukty te mają potencjalne zastosowanie jako zamienniki narządów do implantacji u pacjentów, a także, gdy są tworzone na mniejszą skalę, jako modelowe "organoidy", które mogą być używane w systemach in vitro do badań przesiewowych leków i toksykologii.
Pomimo rozwoju szerokiej gamy urządzeń do biodruku, zastosowanie technologii biodruku może być ograniczone przez dostępność materiałów, które zarówno przyspieszają procedury bioprintingu, jak i wspierają żywotność i funkcję komórek, dostarczając wskazówek specyficznych dla tkanki. Tutaj opisujemy wszechstronny system hydrożelowy na bazie kwasu hialuronowego (HA) i żelatyny, składający się z wielopunktowego, 2-etapowego protokołu sieciowania, który może dostarczać specyficzne dla tkanek sygnały biochemiczne i naśladować właściwości mechaniczne tkanek in vivo. 
Czynniki biochemiczne są dostarczane przez włączenie materiałów macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzących z tkanek, które zawierają silne czynniki wzrostu. Właściwości mechaniczne tkanek to kontrolowane kombinacje środków sieciujących na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych, geometriach (liniowych lub wieloramiennych) i grupach funkcyjnych w celu uzyskania wytłaczanych biotuszów i końcowych wartości sztywności na ścinanie w szerokim zakresie (od 100 Pa do 20 kPa). Wykorzystując te parametry, biotusze hydrożelowe wykorzystano do biodruku pierwotnych sferoidów wątroby w biotuszu specyficznym dla wątroby w celu stworzenia in vitro konstruktów wątroby o wysokiej żywotności komórek i mierzalnej funkcjonalnej produkcji albuminy i mocznika. Metodologia ta zapewnia ogólne ramy, które można dostosować do przyszłego dostosowywania hydrożeli do biofabrykacji szerokiej gamy typów konstruktów tkankowych.

Przy prawidłowym stosowaniu opisanych powyżej procedur hydrożele powinny charakteryzować się profilem biochemicznym specyficznym dla docelowego typu tkanki,20 zapewniać wysoki stopień kontroli nad biodrukiem oraz końcowym modułem sprężystości,34 a także wspierać przeżywalność funkcjonalnych komórek w konstruktach tkankowych.
Dostosowanie hydrożelu 
Aby jak najlepiej naśladować naturalną ...

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie wszechstronnego podejścia do projektowania bioatramentów hydrożelowych, które mogą być ekstrudowane za pomocą urządzeń do biodruku. Bioatramenty te mogą być następnie wykorzystane do wytwarzania trójwymiarowych konstruktów tkankowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biodruku, takie jak sposób kontrolowania właściwości mechanicznych niezbędnych do uzyskania materiału, który można ekstrudować przy użyciu biodrukarki.Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie dostępnych komercyjnie komponentów połączonych w sposób modułowy w celu stworzenia prostego i skutecznego bioatramentu z hydrożelu nadającego się do biodruku. Zastosowania tych technologii obejmują tworzenie trójwymiarowych organoidów tkankowych, które mogą być wykorzystywane do dokładnego modelowania wpływu leków, toksyn i chorób. Chociaż metoda ta może stanowić podstawę do biodruku 3D konstruktów wątroby, może ona być zastosowana również do innych typów tkanek, takich jak mięśnie, płuca i jelito grube.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności ze względu na liczbę różnych odczynników stosowanych do tworzenia bioatramentu hydrożelowego, jednak w rzeczywistości procedura ta jest dość prosta. Przebieg procedury zaprezentuje Young-Joon Seol, postdoc w naszym zespole. Na początek należy przygotować trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla danej tkanki, która zostanie wykorzystana w formulacji hydrożelu, zgodnie z opisem zawartym w innym źródle.Następnie rozpuścić fotoinicjator w wodzie, zachowując stosunek masy do objętości na poziomie 0,1%. Aby przygotować bioatramenty do hydrożelu, najpierw rozpuścić podstawowe komponenty materiałowe z zestawów do hydrożelu z kwasu hialuronowego w oddzielnych alikwotach wodnego roztworu fotoinicjatora. Następnie połączyć roztwór ECM, 2% tiolowanego kwasu hialuronowego, 2% tiolowanej żelatyny, sieciujące oraz pożywkę do hodowli hepatocytów w proporcjach przedstawionych tutaj. Aby poprawić właściwości ekstruzyjne bioatramentu, dodać do mieszaniny 1,5 mg/mL niemodyfikowanego kwasu hialuronowego oraz 30 mg/mL żelatyny.Następnie wymieszaj powstałą mieszaninę za pomocą wortexa na wysokich obrotach przez dziesięć sekund przed użyciem. Przed przetestowaniem bioatramentu w urządzeniu do biodruku należy najpierw sprawdzić właściwości ekstruzji na stole laboratoryjnym. Używając standardowej strzykawki, nanieś próbkę bioatramentu, a następnie przymocuj do strzykawki igłę o rozmiarze od 20 do 30 G.Pozostaw biotusz do czasu sieciowania, a następnie przetłocz go przez igłę, aby uzyskać gładkie filamenty hydrożelu. Jeśli formulacja pozwala na utworzenie filamentu z niewielką liczbą grudek lub bez nich, jest ona gotowa do biodruku. Aby załadować przygotowane biotusze do biodrukarki, pipetuj je do sterylnych wkładów drukarki.Pozostaw je na 30 minut przed ekstruzją, ponieważ bioink przejdzie spontaniczną pierwszą fazę sieciowania wewnątrz wkładu. Następnie umieść wkład w urządzeniu do drukowania i podłącz do niego pneumatyczne źródło ciśnienia. Przygotuj prosty wzór, taki jak ta siatka linii równoległych o wymiarach siedem na siedem milimetrów, aby wydrukować go w celu oceny kompatybilności ekstruzyjnej.Podczas gdy głowica drukująca porusza się w płaszczyźnie XY z prędkością około 300 millimeters per minute, należy przyłożyć ciśnienie 20 kilopascals do wkładu, aby wycisnąć bioatrament. Jeśli wyciśnięte materiały są grudkowate lub nieregularne, należy zmniejszyć ilość dodanego sieciującego w celu zmiękczenia materiału sieciowanego w pierwszym etapie. Prawidłowo przygotowany bioatrament powinien być wyciskany płynnie, co pozwala na precyzyjne nanoszenie i tworzenie struktur.Przygotuj trójwymiarowe sferoidy z pierwotnych komórek wątroby na płytce 96-dołkowej, stosując metodę wiszących kropel zgodnie z opisem w załączonym protokole tekstowym. Po trzech dniach hodowli zbierz sferoidy wątrobowe z płytki do wiszących kropel za pomocą pipety i przenieś je do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Pozostaw sferoidy na jedną lub dwie minuty, aby osiąły dno probówki stożkowej.Następnie ostrożnie odessaj medium za pomocą pipety. Przenieś od 110 do 125 procent pożądanej objętości drukowanego konstruktu 3D z nowo przygotowanego roztworu bioatramentu hydrożelowego do probówki stożkowej zawierającej sferoidy. Następnie ostrożnie pipetuj sferoidy w górę i w dół, aby zawiesić je ponownie w roztworze bioatramentu hydrożelowego.Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny, przenieś roztwór sferoidów do wkładu biodrukarki za pomocą pipety i pozostaw roztwór na 30 minut w celu przeprowadzenia pierwszego etapu sieciowania. Po zakończeniu tego etapu sieciowania, użyj urządzenia do biodruku, aby stworzyć pożądane struktury hydrożelowe zawierające pierwotne sferoidy wątroby. Po nałożeniu każdej warstwy poddaj wydrukowany bioatrament działaniu światła UV przez dwie do czterech sekund, aby zainicjować wtórny mechanizm sieciowania.Działanie to ustabilizuje konstrukty i zwiększy ich sztywność do pożądanego poziomu. Stężenie alkinu PEG w roztworze kontroluje całkowitą gęstość sieciowania, a tym samym w głównej mierze warunkuje sztywność końcowego konstruktu. Po biodruku, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, zaobserwowano wysoką żywotność komórek w konstruktach wątrobowych.W optymalnych warunkach środowiskowych żywotność powinna przekraczać 85%. Ponadto, po zabarwieniu konstruktów na markery charakterystyczne dla tkanki wątroby, zaobserwowano pozytywną ekspresję CYP3A4 (izoformy cytochromu P450), wewnątrzkomórkowej albuminy, E-kadheryny (białka adhezji międzykomórkowej nabłonka) oraz DPP4 (białka wykazującego wysoką ekspresję w wątrobie). Po zbadaniu poziomu mocznika i albuminy w pożywce hodowlanej stwierdzono, że konstrukt wydzielał zarówno mocznik, jak i albuminę na stałym poziomie w ciągu 14 dni. Sugeruje to ponadto, że bioatramenty hydrożelowe specyficzne dla danej tkanki pomagają w utrzymaniu funkcji komórek wątroby.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces może zająć około dwóch godzin. Zależy to jednak często od rodzaju zastosowanego urządzenia do biodruku. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zaprezentowane kroki często wymagają dostosowania, aby były kompatybilne z innymi typami tkanek lub urządzeniami do biodruku.Postępując zgodnie z tą procedurą, można stworzyć inne formulacje biotuszu hydrożelowego w celu wsparcia biodruku innych typów tkanek. Rozwój tych technologii pomógł utorować drogę do tworzenia wieloorganoidalnych platform typu body-on-a-chip do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zacząć projektować materiały, które mogą być wykorzystane do biodruku trójwymiarowych konstruktów tkankowych z zastosowaniem wieloetapowego sieciowania.Należy pamiętać, że praca z promieniowaniem ultrafioletowym może być niezwykle niebezpieczna dla wzroku, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak używanie gogli ochronnych z filtrem UV.

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Tutaj opracowaliśmy nową, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla płynnych biotuszy (żelatyna metakryloyl o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych komórek.

Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Poznaj metodę bioprintingu komórkowych konstruktów 3D przy użyciu hydrożelowego biotuszu naśladującego tkankę. Technika umożliwia tworzenie funkcjonalnych organoidów do badań in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Przeglądaj więcej filmów