Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro
September 18th, 2018
Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.
Metoda ta może pomóc w rozpoczęciu genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty i badaniu mechanizmu raka prostaty poprzez analizę in vivo i in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na pełną analizę mysiego modelu raka prostaty, od sekcji tkanek po izolację komórek i hodowlę. Po odsłonięciu układu moczowo-płciowego lub PMG mocno chwyć pęcherz moczowy średnimi kleszczami i unieś cały układ z brzucha myszy.
Wsuń nożyczki pod pęcherz moczowy i prostatę aż do kręgosłupa, aby wykonać nacięcie w rdzeniu kręgowym i przeciąć wszelkie pozostałe połączenia z jamą brzuszną, aby umożliwić usunięcie całego PMG. Przenieś PMG na sześciocentymetrową szalkę Petriego zawierającą od dwóch do sześciu mililitrów PBS pod mikroskopem preparacyjnym. I użyj pary cienkich kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, aby ostrożnie usunąć cały tłuszcz zarówno z grzbietowej, jak i brzusznej strony układu tkankowego, nie przecinając żadnej tkanki prostaty.
Kiedy cały tłuszcz zostanie usunięty, pociągnij pęcherz kleszczami i wytnij pęcherz u podstawy. Umieść pozostałą tkankę brzuszną stroną do góry i trzymając jeden koniec przewodu kleszczami, podążaj nożyczkami za naczyniem do jego podstawy i wytnij naczynie u podstawy. Usuń to samo naczynie po drugiej stronie i włóż kleszcze między pęcherzyki nasienne a prostatę, aby umożliwić przecięcie przylegającej tkanki łącznej, jeśli to konieczne.
Następnie prześledź pęcherzyki nasienne do ich podstawy w cewce moczowej i usuń naczynia bez ich nakłuwania. Po usunięciu obu pęcherzyków umieść tkankę grzbietową stroną do góry, tak aby widoczne były płaty grzbietowe, które przypominają skrzydła motyla. Trzymając każdy płat grzbietowy kleszczami, przetnij tkankę u jej podstawy nożyczkami, aby zebrać płaty grzbietowe i obrócić tkankę na stronę brzuszną.
Zbierz płaty boczne, które są małe i zwykle owijają cewkę moczową z boku i są zaklinowane między płatami przednimi, brzusznymi i grzbietowymi w ten sam sposób. Zbierz płaty brzuszne, które są większe niż płaty boczne i leżą brzusznie na cewce moczowej. Następnie odetnij i wyrzuć cewkę moczową, aby zebrać przednie płaty.
Aby przetworzyć tkankę prostaty do hodowli 3D, przenieś płaty do 10-centymetrowej naczynia zawierającej od dwóch do trzech mililitrów DMEM i użyj skalpela, aby zmielić kanaliki prostaty tak drobno i równomiernie, jak to możliwe. Przenieś fragmenty tkanek do sterylnego kaptura do hodowli tkanek i dodaj roztwór tkankowy do nowej 15-mililitrowej probówki. Zwiększ objętość w probówce do dziewięciu mililitrów świeżą pożywką i dodaj jeden mililitr roztworu podstawowego kolagenazy TenX do mieszaniny tkanek.
Po wirowaniu inkubuj probówkę, wstrząsając przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdegradować macierz zewnątrzkomórkową. Pod koniec inkubacji zebrać tkankę przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach ciepłych 05% pasków w EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić rozszczepienie zrostów komórka-komórka i komórka-macierz, użyj głowicy rurowej P1000 z szeroką końcówką deski, aby rozcierać tkankę od ośmiu do 10 razy, aby rozbić wszelkie grudki.
Powtórz dysocjację z końcówką głowicy rury P200. Następnie zneutralizuj trypsynę trzema mililitrami kompletnego podłoża. Wymieszaj 500 jednostek DNASE1 z zawiesiną tkanki i przepuść roztwór od pięciu do 10 razy przez pięciomililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18, a następnie pięć razy przez igłę o rozmiarze 20.
Gdy nie widać już dużych kawałków tkanki, przefiltruj zawiesinę przez filtr 40 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. W celu posiewu i hodowli komórek ponownie zawiesić osad w 0,5 mililitra kompletnej pożywki do wzrostu komórek nabłonka prostaty i przywołać komórki do stężenia pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr pożywki do wzrostu komórek nabłonka prostaty. Wymieszać komórki z macierzą zewnątrzkomórkową błony podstawnej w proporcji dwóch do trzech objętości roztworu i umieścić zawiesinę komórkową w odpowiednim pojemniku do eksperymentalnej hodowli komórkowej.
Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut. Gdy macierz zewnątrzkomórkowa zestali się, przykryj kulturę wstępnie podgrzaną kompletną pożywką do wzrostu komórek nabłonka prostaty, uważając, aby nie naruszyć czopu macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na pięć do 10 dni, odświeżając połowę pożywki co dwa do trzech dni.
Aby zebrać kulki, ostrożnie zassaj pożywkę, nie naruszając żelowej zatyczki żelowej macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej i dodaj jeden mililitr roztworu Disbase na 100 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać wzdłuż dna płytki, aby podnieść żele zewnątrzkomórkowe błony podstawnej z dna płytki do supernatantu i przelać cały roztwór jeden raz, aby rozbić czop na mniejsze kawałki. Inkubować fragmenty macierzy zewnątrzkomórkowej w inkubatorze do hodowli komórkowych przez jedną do dwóch godzin, aż macierz zewnątrzkomórkowa błony podstawnej całkowicie się rozpuści.
Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. I zebrać komórki przez odwirowanie w celu dalszej manipulacji. Prostata myszy składa się z czterech par płatów położonych grzbietowo i brzusznie do pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej.
Płaty prostaty składają się z wielu profili gruczołów, z których każdy składa się ze światła, otoczonego wydzielniczymi komórkami nabłonka. Kształty płatów, organizacja komórek i charakter wydzieliny różnią się w zależności od płata. Wyizolowane komórki prostaty zaczynają przekształcać się w organoidy już po czterech dniach od hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej.
W ciągu następnego jednego do sześciu dni większość komórek wyrasta w stałe kule, przy czym część kulek wykazuje częściowe lub pełne światło. Sferoidy wykazują również silne barwienie beta-kateniną w połączeniach komórka-komórka, które kolokalizują się z barwieniem F-aktyną. Próbując wykonać tę procedurę, bardzo ważne jest, aby skrupulatnie przestrzegać kroków mikrodysekcji.
Na przykład wyizoluj płaty prostaty, gdy są one nadal przyczepione do cewki moczowej, aby wiedzieć, który płat jest który, na podstawie tego, gdzie się znajdują w stosunku do cewki moczowej. Po procedurze preparacji, izolowane płaty można wykorzystać do dalszej analizy, takiej jak sekwencjonowanie RMA, Western blotting lub barwienie immunologiczne. Podstawowa technika hodowli 3D pozwala uzyskać dalszy wgląd w mechanizm raka prostaty, ponieważ można monitorować życie ze sferoidami pod kątem zmian morfologii i zachowania oraz identyfikować wszelkie zmiany nowotworowe w tym samym.
Podsumowując, te metody sekcji prostaty i hodowli mogą być włączone do różnych dalszych zastosowań, aby dostarczyć cennych informacji do badania mechanizmu raka prostaty przy użyciu genetycznie modyfikowanych modeli mysich.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do rozdzielania płatów prostaty od genetycznie zmodyfikowanych myszy, które służą jako modele do badań nad rakiem prostaty. Metoda obejmuje izolację i hodowlę pierwotnych komórek prostaty jako sfroidów do dalszej analizy.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Onkologia
Tło
- Genetycznie zmodyfikowane myszy są wartościowe w badaniu mechanizmów raka prostaty.
- Rozumienie raka prostaty wymaga zarówno analiz in vivo jak i in vitro.
- Techniki hodowli komórek są niezbędne do analiz dalszego etapu.
- Histologiczne zróżnicowanie płatów prostaty pomaga w dokładności badań.
Cel badania
- Zapewnić szczegółowy protokół do rozdzielania płatów prostaty.
- Ułatwić izolację i hodowlę pierwotnych komórek prostaty.
- Zwiększyć zrozumienie mechanizmów raka prostaty.
Zastosowane metody
- Rozdzielanie układu moczowo-płciowego od genetycznie zmodyfikowanych myszy.
- Histologiczne zróżnicowanie płatów prostaty.
- Izolacja pierwotnych komórek prostaty.
- Hodowla komórek jako sfroidów do analizy.
Główne wyniki
- Udane rozdzielanie płatów prostaty z układu moczowo-płciowego.
- Skuteczna różnica płatów prostaty na podstawie histologii.
- Izolacja żywotnych pierwotnych komórek prostaty.
- Ustanowienie kultur sfroidów do dalszych eksperymentów.
Wnioski
- Protokół pozwala na kompleksową analizę modeli raka prostaty.
- Wspiera zarówno metodologie badań in vivo jak i in vitro.
- Przyszłe badania mogą się opierać na tej metodzie dla głębszych wglądów w rak prostaty.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to dissect and characterize mouse prostate lobes for downstream in vitro spheroid culture, supporting mechanistic studies of prostate cancer using genetically engineered models. By preserving physiological cell characteristics in 3D culture, the method enhances predictive confidence in target validation and drug response assessments. It bridges in vivo model systems with in vitro analytics to improve translational continuity in oncology discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through lobe-specific histological characterization and isolation of primary prostate cells.
- Operational Value: Provides a standardized dissection workflow to reduce variability in tissue procurement for downstream analysis.
- Predictive Value: Supports functional target validation by maintaining physiological cell states in 3D spheroid culture for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible 3D spheroid models suitable for compound screening and pathway modulation studies.
- Operational Value: Establishes a scalable cell isolation and culture protocol compatible with multi-well plate formats for assay standardization.
- Assay Readiness: Produces quantifiable outputs such as spheroid morphology, beta-catenin localization, and lumen formation for phenotypic screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant cellular phenotypes from murine models to in vitro systems, supporting biomarker alignment and pathway analysis.
- Preclinical Model Utility: Facilitates investigation of altered protein localization and drug response in near-physiological conditions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of neoplastic changes in spheroids to inform go/no-go decisions in lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from tissue dissection in genetically engineered models to primary cell isolation and 3D spheroid culture, enabling mechanistic studies and compound testing in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through lobe-specific dissection and histological profiling of mouse prostate tissue.
- Screening: Delivers standardized, reproducible spheroid cultures for reliable compound evaluation and phenotypic readouts.
- Analytics: Enables quantitative measurements of cell morphology, protein localization (e.g., beta-catenin/F-actin co-localization), and structural organization for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vivo GEMM findings to in vitro mechanistic validation through preservation of physiological cell characteristics in spheroid culture.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for prostate tissue processing across multiple projects in oncology discovery and preclinical development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation and mechanistic de-risking by preserving physiological cell states in 3D culture.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of prostate lobe dissociation and spheroid formation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing late-stage biological risk in oncology pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanistic insights from lobe-specific spheroid models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine anatomy, microdissection techniques, and histological identification of prostate lobes.
- Dependent on dissection microscopy, precision instruments (fine forceps, microdissection scissors), and tissue culture infrastructure for enzymatic dissociation and 3D embedding.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and culture protocols to ensure reproducibility across laboratories and study sites.
- Requires adaptation of enzymatic dissociation and matrix embedding parameters when applying the model to different genetic backgrounds or disease states.
- Limited by the tendency of primary prostate cells to dedifferentiate in traditional 2D culture, mitigated by the 3D spheroid approach described.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
TItle
0:35
Urogenital System (UGS) Dissection
2:04
Prostate Gross Anatomy and Individual Lobe Microdissection
2:51
Tissue Processing for 3D Culture
4:41
Cell Plating and Culture and Sphere Harvest
6:38
Results: Representative Mouse Prostate Lobe Analyses
7:41
Conclusion
