Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

System organoidów 3D jest uważany za bardziej istotny fizjologicznie niż testy 2D i może dostarczyć cennych informacji na temat biologii, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia. Jest to elastyczny system, w którym możemy testować manipulacje farmakologiczne i genetyczne w krótszym czasie i przy znacznie niższych kosztach niż przy użyciu podejścia in vivo. Próba matrycowa jest bardzo trudna w obsłudze, ponieważ krzepnie po osiągnięciu temperatury pokojowej.

Można go pobrać za pomocą pipety tylko wtedy, gdy jest płynny i musi być utrzymywany na lodzie. Integralność pierścienia jest ważna do utrzymania. Jeśli struktura zostanie zakłócona, może to negatywnie wpłynąć na wzrost organoidów i można łatwo stracić materiał podczas zmiany pożywki.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mysich komórek podstawnego i luminalnego nabłonka prostaty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umyj osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki organoidowej dla myszy, a następnie ponownie zawiesić osad przy gęstości komórek 1 000 komórek na mikrolitr. Aby przygotować mieszanki wzorcowe, wymieszaj komórki nabłonkowe zawieszone w mysich pożywkach organoidowych z żelem matrycowym, aby uzyskać ostateczną mieszaninę zawierającą 25% komórek w pożywce i 75% żelu matrycowego.

W zależności od dalszego zastosowania, komórki podstawowe są zwykle siane w stężeniu od 100 do 2 000 komórek na 80 mikrolitrów, podczas gdy komórki luminalne są siane w stężeniu od 2 000 do 10 000 komórek na 80 mikrolitrów. Do każdej mieszaniny komórek dodać 80 mikrolitrów żelu matrycowego na dołek 24-dołkowej płytki. Odpipetować kroplę na dolną połowę ściany studzienki, unikając bezpośredniego kontaktu z powłoką polihemową.

Po dodaniu żelu matrycowego zakręć płytką, aby mieszanina komórek żelu matrycowego utworzyła pierścień wokół krawędzi studzienki. Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% C02 prawą stroną do góry na 10 minut, aby żel matrycowy częściowo stwardniał. Po inkubacji przez 10 minut odwróć 24-dołkową płytkę do góry nogami i inkubuj przez dodatkowe 50 minut, aby żel matrycowy całkowicie stwardniał.

Następnie dodaj 350 mikrolitrów wstępnie podgrzanych pożywki z organoidów mysich kroplami do środka każdej studzienki. Po dodaniu pożywki należy umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Aby uzupełnić pożywkę organoidową myszy, przechyl 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni i delikatnie usuń istniejące podłoże ze środka każdej studzienki za pomocą pipety P1000, unikając pierścienia żelowego matrycy.

Dodaj 350 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki organoidowej dla myszy, tak jak poprzednio. Zaleca się dodawanie większej objętości pożywki do organoidów hodowanych dłużej niż pięć dni, aby zapobiec szybkiemu wyczerpaniu kluczowych składników odżywczych i czynników wzrostu. Wyjmij nośnik z każdej studzienki, tak jak poprzednio.

Aby zebrać organoidy, należy kilkakrotnie przedmuchać żel matrycowy, pipetując jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej dyspazę bezpośrednio na pierścień żelowy matrycy, aż cały pierścień zostanie usunięty. Przenieś usuniętą mieszaninę organoidów żelu matrycowego do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Po całkowitym roztrawieniu, jak opisano w protokole tekstowym, dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami do osadu organoidowego i ponownie zawiesij, delikatnie strzepując.

Osadzać organoidy przez odwirowanie w temperaturze 800 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą mikropipety. Ponownie zawiesić granulki organoidów w 100 mikrolitrach buforu do lizy białek na 10 mikrolitrów objętości upakowanych komórek. Przesuń, aby ponownie zawiesić.

Teraz należy poddać organoidy sonicy, zanurzając probówki w mokrym lodzie i delikatnie przykładając końcówkę dysmembratora sonicznego na zewnątrz probówki mikrowirówki. Wykonaj sonizację przez 40 sekund w częstotliwości 20 kiloherców, zanim przejdziesz do Western blot zgodnie z ustalonymi protokołami. Aby pobrać organoidy prostaty z płytek 24-dołkowych, usuń pożywkę z każdej studzienki, tak jak poprzednio.

Trawić żel matrycowy, inkubując z 500 mikrolitrami pożywki zawierającej dyspazę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Zebrać strawioną zawiesinę organoidów w probówce do mikrowirówki. Następnie otopić organoidy przez odwirowanie w temperaturze 800 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.

Aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne organoidów prostaty w całości, najpierw dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do PBS. Inkubować organoidy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Po umyciu osadu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać jeden mikrogram na mililitr barwnika DAPI w roztworze blokującym i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Chronić próbkę przed światłem podczas inkubacji od tego etapu. Po odwirowaniu organoidów, jak poprzednio, dodać przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Ponownie otocz organoidy i umyj je jednym militerem PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.

Powtórz tę procedurę prania dwa razy. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji osadzać organoidy i myć je dodatkowo dwa razy.

Dodaj jeden mililitr 30% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 do granulowanych organoidów. Następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Po ponownym granulowaniu organoidów dodaj jeden milimetr 45% sacharozy w PBS z 1%Triton X-100 i delikatnie wstrząsaj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie powtórz procedurę, z wyjątkiem dodania jednego mililitra 60% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100. Osadzać organoidy przez odwirowanie w temperaturze 800 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć 95% supernatantu. Obserwować osad w świetle UV, aby upewnić się, że nie został utracony podczas usuwania supernatantu.

Osad staje się luźniejszy wraz ze wzrostem stężenia sacharozy. Przenieść od 10 do 20 mikrolitrów pozostałej zawiesiny do szkiełka nakrywkowego z komorą i przystąpić do mikroskopii konfokalnej. Komórki podstawne i luminalne tworzą organoidy o odrębnej morfologii.

Podczas gdy większość organoidów pochodzących z bazy ma podobną wielkość po siedmiu dniach w hodowli, organoidy pochodzące z luminali wykazują znaczną niejednorodność. Ponadto większość organoidów pochodzących z bazy zawiera światła otoczone wielowarstwowym nabłonkiem, podczas gdy organoidy pochodzące z luminalu mają morfologię od pustej z jednowarstwowym nabłonkiem do stałej z wielowarstwowymi sznurami komórek, które nie ulegają kanalizacji. Analiza Western blot wykazała, że organoidy pochodzące z bazy i światła zachowują cechy związane z podstawnymi i luminalnymi komórkami pierwotnymi.

Organoidy pochodzące z bazy wyrażają wyższe poziomy markera podstawowego cytokeratyny 5, podczas gdy organoidy pochodzące ze światła wyrażają wyższe poziomy markera luminalnego cytokeratyny 8. Zarówno markery podstawowe, jak i luminalne wykryto w organoidach pochodzących z bazy i światła w populacji większościowej, co może sugerować różnicowanie. Organoidy pochodzące z bazy zawierają wielowarstwowy nabłonek, z zewnętrznymi warstwami wyrażającymi wysoki poziom podstawowego markera p63 i warstwami wewnętrznymi o niewykrywalnych poziomach.

Warstwy zewnętrzne również wyrażają umiarkowane poziomy markera świetlnego cytokeratyny 8, a warstwy wewnętrzne mają wysokie poziomy. Podczas gdy wszystkie komórki w jednowarstwowych organoidach pochodzących z luminalu barwią się dodatnio na obecność cytokeratyny 8, tylko wybrane komórki zawierały jądrowy p63. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z żelem macierzowym, aby upewnić się, że nie stwardnieje przed posianiem komórek w kulturze organoidów.

DAPI stosowany w mikroskopii może powodować podrażnienie skóry. Światło UV może być również szkodliwe. Niezbędne są odpowiednie środki ochrony osobistej.

Możemy pobrać RNA z organoidów, aby przeprowadzić sekwencjonowanie RNA, które powie nam o tym, jak zmieniają się profile ekspresji genów podczas tworzenia organoidów lub w odpowiedzi na manipulację. Model ten umożliwił branży prostaty uzyskanie powtarzalnego testu ex vivo w celu zbadania podstawowych aspektów biologii nabłonka i zidentyfikowania regulatorów rozwoju i różnicowania.