Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunosupresyjnej interwencji terapeutycznej w celu zbadania niekorzystnego wpływu leków na regenerację tkanek, w szczególności w kościach. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona wcześniejsze modele regeneracji kości danio pręgowanego z ogólnoustrojową ekspozycją na leki poprzez zanurzenie zranionego danio pręgowanego w wodzie dla ryb uzupełnionej lekiem. Przed rozpoczęciem procedury należy przelać w autoklawie jedną folię aluminiową pokrytą 600 mililitrową zlewką na danio pręgowanego i odpowiednią liczbę szklanych butelek z wodą dla ryb do eksperymentu i przygotować lek immunosupresyjny w eksperymentalnych roztworach kontrolnych będących przedmiotem zainteresowania.

W przypadku amputacji użyj kleszczy, aby ostrożnie umieścić znieczulonego danio pręgowanego na bocznej stronie na odwróconej pokrywie 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj skalpela, aby wyciąć 50% płetwy. Następnie umieść rybę w autoklawowanej zlewce zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym i przykryj zlewkę folią, aby zapobiec ucieczce danio pręgowanego. Aby wywołać uraz spowodowany złamaniem płetwy, umieść znieczulonego danio pręgowanego na jego bocznej stronie na 100-milimetrowej szalce Petriego pokrytej agarozą pod mikroskopem preparacyjnym i lekko wepchnij igłę do wstrzykiwań w segment promienia płetwy kostnej, aż pojawi się pęknięcie.

Ważne jest, aby nie wprowadzać zbyt wielu złamań do płetwy, ponieważ może to znacznie pogorszyć stabilność. Następnie przenieść rybę do autoklalawowanej zlewki zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym. Aby spowodować uraz czaszki w kształcie kości kalwarycznej, trzymaj znieczulonego danio pręgowanego w pozycji pionowej, aby kości kalwaryczne można było łatwo uwidocznić pod mikroskopem preparacyjnym.

Umieść obracające się mikrowiertło wyposażone w wiertło o średnicy 500 mikrometrów nad środkiem kości czołowej i delikatnie dotknij kości, aby uzyskać otwór wielkości zadzioru mikrowiertła. Bardzo ważne jest, aby nie przesuwać wiertła na boki podczas powodowania urazu i natychmiast się zatrzymać, gdy opór tkanki spadnie. W przeciwnym razie mózg zostanie uszkodzony.

Następnie umieścić rybę w autoklawowanej zlewce zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym. Codziennie zmieniaj wodę w zlewkach, przenosząc danio pręgowanego i wodę rybną do odpowiedniego tymczasowego pojemnika i ponownie napełniając zlewkę świeżą wodą dla ryb uzupełnioną lekiem. Następnie użyj siatki rybackiej, aby przywrócić danio pręgowanego do zlewki.

W przypadku zabiegów trwających łącznie do dwóch dni nie należy karmić danio pręgowanego. Podczas dłuższych eksperymentów karm danio pręgowanego od 0,5 do jednego mililitra wyklutego Artemia TPK co drugi dzień. W celu analizy uszkodzeń płetw zbierz drobną cząstkę i użyj cienkich kleszczy, aby chwycić płetwę na jednej krawędzi pnia.

Użyj drugiej pary kleszczy, aby chwycić przeciwległą krawędź kikuta i lekko dociśnij chusteczkę do dna naczynia, które zawiera zimne 4% PFA przez 10 do 20 sekund. W razie potrzeby powtórz spłaszczanie żeber. Płetwa powinna teraz leżeć płasko bez zwijania się.

W celu długotrwałego przechowywania próbki po utrwaleniu, należy przemyć tkankę trzema 20-minutowymi płukaniami PBS i serią metanolu rosnącego. Próbki można następnie przechowywać w 100% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W przypadku barwienia czerwienią alizarynową, ponownie uwodnić próbki przechowywane metanolem w malejącej serii metanolu, a następnie dwa 20-minutowe płukanie w PBS i jedno pięciominutowe płukanie w wodzie dejonizowanej.

Po ostatnim przemyciu dodać roztwór czerwieni alizarynowej do tkanki próbki i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez odpowiedni okres barwienia. Aby usunąć próbki, potraktuj tkankę zmniejszającą się 1% serią glicerolu wodorotlenku potasu. Następnie przechowuj próbki w roztworze 1 do jednego 0,1% wodorotlenku potasu do 80% glicerolu i połącz tkanki z 80% glicerolem dla wyobrażenia.

W przypadku barwienia kalceiny inkubuj do trzech danio pręgowanego jednocześnie w 100 milimetrach roztworu kalceiny przez 20 minut w szklanej zlewce pokrytej folią aluminiową. Pod koniec inkubacji przenieś danio pręgowanego do pojemnika z wodą dla ryb i pozwól rybie krótko pływać przed przeniesieniem jej do nowego pojemnika z wodą dla ryb. Po 20 minutach w drugiej zlewce, aby uzyskać obrazy na żywo regenerujących się płetw, umieść znieczulonego danio pręgowanego na pokrytej agarozą szalce Petriego i zobrazuj płetwę za pomocą mikroskopii stereoskopowej.

Aby uzyskać obrazy regenerujących się kości czaszki, umieść danio pręgowanego pionowo w gąbce i zobrazuj czaszkę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Leczenie prednizolonem, podobnie jak inne glikokortykosteroidy, prowadzi do ogólnego zahamowania regeneracji płetw, w tym tworzenia kości, co wykryto za pomocą barwienia czerwienią alizaryny utrwalonej tkanki płetwy ogonowej. Podobnie, lek ma działanie opóźniające zamknięcie urazu czaszki calwariowej.

Ze względu na immunosupresję, obniżoną liczbę makrofagów można również wykryć za pomocą immunohistochemii na zamrożonych skrawkach tkanki, o czym świadczy użycie barwienia przeciwciałami anty-mCherry i anty-GFP oraz transgenicznego MPEG-1 mCherry skrzyżowanego z danio pręgowanym Osterix NGFP na próbkach tkanki czaszki danio pręgowanego od zwierząt leczonych prednizolonem. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zminimalizować zmienność szybkości regeneracji kości poprzez przeprowadzanie esejów urazowych w wysoce powtarzalny sposób. Bardzo ważne jest również, aby danio pręgowany był trzymany pojedynczo w autoklawowanych zlewkach zawierających autoklawowaną wodę dla ryb, aby uniknąć infekcji mikrobiologicznej.

Protokół ten pomoże w dalszym badaniu mechanizmów leżących u podstaw działania glikokortykosteroidów. Na przykład w kontekście osteoporozy wywołanej glikokortykosteroidami i może być również przystosowany do stosowania innych leków i innych kości danio pręgowanego.