Name: Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj modele urazów dorosłych Danio rerio do badania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej. Ta metoda łączy amputację płetwy z zanurzeniem w wodzie z lekiem, umożliwiając obserwację mineralizacji kości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie ("Danio pręgowany jako model do odkrycia mechanizmów utraty masy kostnej wywołanej glukokortykosteroidami") oraz dodatkowo przez grant Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projekt 387653785) dla FK. Jesteśmy bardzo wdzięczni Janowi Kaslinowi i Avinashowi Chekuru za ich wskazówki i pomoc w wykonywaniu trepanacji kalwarii i złamań w promieniach kostnych płetw. Eksperymenty zostały zaprojektowane, przeprowadzone i przeanalizowane przez KG i FK. FK napisał rękopis. Chcielibyśmy również podziękować Katrin Lambert, Nicole Cudak i innym członkom laboratoriów Knopf i Brand za pomoc techniczną i dyskusję. Podziękowania kierujemy również do Mariki Fischer i Jitki Michling za doskonałą opiekę nad rybami oraz do Henriette Knopf i Josha Currie za korektę rękopisu.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. 385, (2000).</li>
<li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li>
<li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853(2016).</li>
<li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li>
<li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11926-011-0173-y">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li>
<li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li>
<li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li>
<li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382350">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+skeleton%3A+morphology%2C+embryology%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2(2015).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li>
<li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li>
<li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua%2C+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li>
<li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li>
<li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787(2013).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li>
<li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li>
<li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7%3Aluciferase+zebrafish+scale+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany okazał się przydatny w badaniach szkieletowych pod wieloma względami. Wybrane mutanty naśladują aspekty chorób ludzkich, takie jak wrodzona łamliwość kości lub choroba zwyrodnieniowa stawów 23,24,25,26,27, a larwy i łuski są wykorzystywane do identyfikacji związków anabolicznych kości w badaniach przesiewowych małych cząsteczek<sup class="xref...

Danio pręgowany reprezentuje potężny model zwierzęcy do badania rozwoju i chorób kręgowców. Wynika to z faktu, że są to małe zwierzęta, które bardzo dobrze się rozmnażają, a ich genom jest w pełni zsekwencjonowany i podatny na manipulacje1. Inne zalety to możliwość wykonywania ciągłych badań obrazowych na żywo na różnych etapach, w tym obrazowania in vivo dorosłych ryb danio pręgowanego2, oraz możliwość wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na larwach danio pręgowanego3. Ponadto danio pręgowany posiada wysoką zdolność regeneracyjną w różnych narządach i tkankach, w tym kościach, a tym samym służy jako użyteczny system do badania chorób szkieletowych i naprawy4,5.
Osteoporoza wywołana glukokortykosteroidami (GIO) jest chorobą, która wynika z długotrwałego leczenia glikokortykosteroidami, na przykład w trakcie leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak astma czy reumatoidalne zapalenie stawów. GIO rozwija się u około 30% pacjentów leczonych glikokortykosteroidami i stanowi poważny problem zdrowotny6; Dlatego ważne jest, aby bardzo szczegółowo zbadać wpływ immunosupresji na tkankę kostną. W ostatnich latach opracowano szereg modeli danio pręgowanego zajmujących się patogenezą GIO. Na przykład u larw danio pręgowanego wywołano utratę masy kostnej za pośrednictwem glukokortykosteroidów, co doprowadziło do identyfikacji związków przeciwdziałających zwiększających masę kostną w badaniu przesiewowym leków7. Co więcej, efekty hamowania kości wywołane glikokortykosteroidami zostały naśladowane w łuskach danio pręgowanego zarówno in vitro, jak i in vivo8,9. Testy te są bardzo przekonującym podejściem, zwłaszcza jeśli chodzi o identyfikację nowych leków immunosupresyjnych i anabolicznych na kości. Jednak tylko częściowo uwzględniają one endoszkielet i nie zostały przeprowadzone w kontekście regeneracyjnym. W związku z tym nie pozwalają na badanie efektów za pośrednictwem glikokortykosteroidów podczas szybkich trybów tworzenia się dorosłej, regeneracyjnej kości.
Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający badaczom badanie wpływu glukokortykosteroidów na kości dorosłego danio pręgowanego poddawanego regeneracji. Modele urazów obejmują częściową amputację płetwy ogonowej danio pręgowanego, trepanację czaszki, a także tworzenie złamań promienia płetwy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-1C) i są połączone z ekspozycją na glikokortykosteroidy poprzez inkubację (<silna klasa = "xfig" > Figura 1E). Ostatnio wykorzystaliśmy fragment tego protokołu do opisania konsekwencji ekspozycji na prednizolon, jeden z powszechnie przepisywanych leków kortykosteroidowych, na dorosłe rybyki pręgowane regenerujące płetwy i kości czaszki10. U danio pręgowanego podawanie prednizolonu prowadzi do zmniejszonej proliferacji osteoblastów, niepełnego różnicowania osteoblastów i szybkiej indukcji apoptozy w linii monocytów/makrofagów10. W tym protokole opisujemy również, w jaki sposób złamania mogą być wprowadzane do pojedynczych segmentów promienia płetwy kostnej11, ponieważ takie podejście może być przydatne podczas badania wpływu glikokortykosteroidów na kość występującego podczas naprawy złamań. Przedstawione tu metody pomogą w dalszym badaniu mechanizmów leżących u podstaw działania glikokortykosteroidów w szybko regenerujących się kościach i mogą być również stosowane w innych sytuacjach ogólnoustrojowego podawania leków w kontekście regeneracji tkanek danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Prednizolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6004</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksydek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylu-3-aminobenzoesanu (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>Aesculap</td><td>BD027R</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Dumont</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna (0,3 mm x 13 mm)</td><td>BD Beckton Dickinson</td><td>30400</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowiertło</td><td>Cell Point</td><td>Scientific 67-1000</td><td>dystrybuowane np. firmy Harvard</td></tr><tr><td>Apparatus Frezy stalowe (0,5 &micro; średnica m)</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Artemia ssp.</td><td>Sanders</td><td>425GR</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura (plastikowa, pastetowa)</td><td>Alpha Labs</td><td>LW4111</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Alizaryn czerwony S w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Alcian niebieski 8 GX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td>z kamerą QIMAGING Aparat RETIGA-SRV</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>z aparatem Olympus DP71 lub DP80</td></tr></tbody></table>

modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Danio pręgowany jest w stanie zregenerować różne organy, w tym przydatki (płetwy) po amputacji. Wiąże się to z regeneracją kości, która odrasta w ciągu około dwóch tygodni po urazie. Co więcej, danio pręgowany jest w stanie szybko leczyć kości po trepanacji czaszki i naprawiać złamania, które można łatwo wprowadzić do promieni płetwy kostnej danio pręgowanego. Te testy urazów reprezentują wykonalne paradygmaty eksperymentalne do testowania wpływu podawanych leków na szybko tworzącą się kość. W tym miejscu opisujemy zastosowanie tych 3 modeli urazów i ich łączne stosowanie z ogólnoustrojowym leczeniem glikokortykosteroidami, które wywiera działanie hamujące i immunosupresyjne kości. Przedstawiamy przebieg pracy dotyczący przygotowania do leczenia immunosupresyjnego u dorosłych danio pręgowanego, ilustrujemy, jak wykonywać amputację płetwy, trepanację kości łybkowych i złamania płetw oraz opisujemy, w jaki sposób stosowanie glikokortykosteroidów wpływa zarówno na osteoblasty kościotwórcze, jak i komórki linii monocytów / makrofagów w ramach odporności wrodzonej w tkance kostnej.

Przedstawiony tutaj protokół był wielokrotnie stosowany do indukowania szybkiego tworzenia kości w procesie regeneracji płetwy i czaszki danio-ostrobramkowego10,11,16. W połączeniu z opisaną metodą podawania prednizolonu możliwe jest prowadzenie badań nad wpływem tego związku na regenerację kości. Przykładowo można przeprowadzić badania nad formowaniem i mineralizacją kości w regeneracie. Predniz...

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunosupresyjnej interwencji terapeutycznej w celu zbadania niekorzystnego wpływu leków na regenerację tkanek, w szczególności w kościach. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona wcześniejsze modele regeneracji kości danio pręgowanego z ogólnoustrojową ekspozycją na leki poprzez zanurzenie zranionego danio pręgowanego w wodzie dla ryb uzupełnionej lekiem. Przed rozpoczęciem procedury należy przelać w autoklawie jedną folię aluminiową pokrytą 600 mililitrową zlewką na danio pręgowanego i odpowiednią liczbę szklanych butelek z wodą dla ryb do eksperymentu i przygotować lek immunosupresyjny w eksperymentalnych roztworach kontrolnych będących przedmiotem zainteresowania.W przypadku amputacji użyj kleszczy, aby ostrożnie umieścić znieczulonego danio pręgowanego na bocznej stronie na odwróconej pokrywie 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj skalpela, aby wyciąć 50% płetwy. Następnie umieść rybę w autoklawowanej zlewce zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym i przykryj zlewkę folią, aby zapobiec ucieczce danio pręgowanego. Aby wywołać uraz spowodowany złamaniem płetwy, umieść znieczulonego danio pręgowanego na jego bocznej stronie na 100-milimetrowej szalce Petriego pokrytej agarozą pod mikroskopem preparacyjnym i lekko wepchnij igłę do wstrzykiwań w segment promienia płetwy kostnej, aż pojawi się pęknięcie.Ważne jest, aby nie wprowadzać zbyt wielu złamań do płetwy, ponieważ może to znacznie pogorszyć stabilność. Następnie przenieść rybę do autoklalawowanej zlewki zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym. Aby spowodować uraz czaszki w kształcie kości kalwarycznej, trzymaj znieczulonego danio pręgowanego w pozycji pionowej, aby kości kalwaryczne można było łatwo uwidocznić pod mikroskopem preparacyjnym.Umieść obracające się mikrowiertło wyposażone w wiertło o średnicy 500 mikrometrów nad środkiem kości czołowej i delikatnie dotknij kości, aby uzyskać otwór wielkości zadzioru mikrowiertła. Bardzo ważne jest, aby nie przesuwać wiertła na boki podczas powodowania urazu i natychmiast się zatrzymać, gdy opór tkanki spadnie. W przeciwnym razie mózg zostanie uszkodzony.Następnie umieścić rybę w autoklawowanej zlewce zawierającej 300 mililitrów wody dla ryb uzupełnionej odpowiednim środkiem doświadczalnym. Codziennie zmieniaj wodę w zlewkach, przenosząc danio pręgowanego i wodę rybną do odpowiedniego tymczasowego pojemnika i ponownie napełniając zlewkę świeżą wodą dla ryb uzupełnioną lekiem. Następnie użyj siatki rybackiej, aby przywrócić danio pręgowanego do zlewki.W przypadku zabiegów trwających łącznie do dwóch dni nie należy karmić danio pręgowanego. Podczas dłuższych eksperymentów karm danio pręgowanego od 0,5 do jednego mililitra wyklutego Artemia TPK co drugi dzień. W celu analizy uszkodzeń płetw zbierz drobną cząstkę i użyj cienkich kleszczy, aby chwycić płetwę na jednej krawędzi pnia.Użyj drugiej pary kleszczy, aby chwycić przeciwległą krawędź kikuta i lekko dociśnij chusteczkę do dna naczynia, które zawiera zimne 4% PFA przez 10 do 20 sekund. W razie potrzeby powtórz spłaszczanie żeber. Płetwa powinna teraz leżeć płasko bez zwijania się.W celu długotrwałego przechowywania próbki po utrwaleniu, należy przemyć tkankę trzema 20-minutowymi płukaniami PBS i serią metanolu rosnącego. Próbki można następnie przechowywać w 100% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W przypadku barwienia czerwienią alizarynową, ponownie uwodnić próbki przechowywane metanolem w malejącej serii metanolu, a następnie dwa 20-minutowe płukanie w PBS i jedno pięciominutowe płukanie w wodzie dejonizowanej.Po ostatnim przemyciu dodać roztwór czerwieni alizarynowej do tkanki próbki i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez odpowiedni okres barwienia. Aby usunąć próbki, potraktuj tkankę zmniejszającą się 1% serią glicerolu wodorotlenku potasu. Następnie przechowuj próbki w roztworze 1 do jednego 0,1% wodorotlenku potasu do 80% glicerolu i połącz tkanki z 80% glicerolem dla wyobrażenia.W przypadku barwienia kalceiny inkubuj do trzech danio pręgowanego jednocześnie w 100 milimetrach roztworu kalceiny przez 20 minut w szklanej zlewce pokrytej folią aluminiową. Pod koniec inkubacji przenieś danio pręgowanego do pojemnika z wodą dla ryb i pozwól rybie krótko pływać przed przeniesieniem jej do nowego pojemnika z wodą dla ryb. Po 20 minutach w drugiej zlewce, aby uzyskać obrazy na żywo regenerujących się płetw, umieść znieczulonego danio pręgowanego na pokrytej agarozą szalce Petriego i zobrazuj płetwę za pomocą mikroskopii stereoskopowej.Aby uzyskać obrazy regenerujących się kości czaszki, umieść danio pręgowanego pionowo w gąbce i zobrazuj czaszkę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Leczenie prednizolonem, podobnie jak inne glikokortykosteroidy, prowadzi do ogólnego zahamowania regeneracji płetw, w tym tworzenia kości, co wykryto za pomocą barwienia czerwienią alizaryny utrwalonej tkanki płetwy ogonowej. Podobnie, lek ma działanie opóźniające zamknięcie urazu czaszki calwariowej.Ze względu na immunosupresję, obniżoną liczbę makrofagów można również wykryć za pomocą immunohistochemii na zamrożonych skrawkach tkanki, o czym świadczy użycie barwienia przeciwciałami anty-mCherry i anty-GFP oraz transgenicznego MPEG-1 mCherry skrzyżowanego z danio pręgowanym Osterix NGFP na próbkach tkanki czaszki danio pręgowanego od zwierząt leczonych prednizolonem. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zminimalizować zmienność szybkości regeneracji kości poprzez przeprowadzanie esejów urazowych w wysoce powtarzalny sposób. Bardzo ważne jest również, aby danio pręgowany był trzymany pojedynczo w autoklawowanych zlewkach zawierających autoklawowaną wodę dla ryb, aby uniknąć infekcji mikrobiologicznej.Protokół ten pomoże w dalszym badaniu mechanizmów leżących u podstaw działania glikokortykosteroidów. Na przykład w kontekście osteoporozy wywołanej glikokortykosteroidami i może być również przystosowany do stosowania innych leków i innych kości danio pręgowanego.

adult-zebrafish-injury-models-to-study-effects-prednisolone

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Ten protokół opisuje model kriouszkodzeń w celu wywołania głębokiego uszkodzenia kilku miomerów ogonowych u dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia nowe podejście do badania regeneracji mięśni szkieletowych po ciężkiej utracie tkanki u kręgowców innych niż ssaki.

Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Poznaj modele urazów dorosłych Danio rerio do badania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej. Ta metoda łączy amputację płetwy z zanurzeniem w wodzie z lekiem, umożliwiając obserwację mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Przeglądaj więcej filmów