Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy infekcyjnego zapalenia wsierdzia i patobiogramów w takich dziedzinach, jak wzajemne oddziaływanie między bakteriami, komórkami krwi i komórkami śródbłonka wyściełającymi mięśnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że przeszczepy tkanek mogą być bezpośrednio narażone na wzajemne interakcje z różnymi celami, takimi jak bakterie, płytki krwi i białka w standardowych warunkach przepływu. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię infekcyjnego zapalenia wsierdzia, ponieważ może ona rozwikłać ważne interakcje molekularne i czynniki powodujące wysoką zakaźność niektórych tkanek.

Metoda ta dostarcza informacji na temat patogenezy powstawania roślinności. Może być również stosowany w badaniach badających przepuszczalność naczyń krwionośnych, ruchliwość komórek i ekspresję genów komórek. Aby rozpocząć protokół, umieść wcześniej przygotowaną biopsję tkankową o średnicy 10 milimetrów i tej samej grubości między szkiełkiem mikroskopowym a ośmiomilimetrową okrągłą perforacją i gumową uszczelką z wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry, aby zetknąć się z zawiesiną bakteryjną.

Skoncentruj się na orientacji przeszczepu tkanki po umieszczeniu w uchwycie. Upewnij się, że wewnętrzna powierzchnia tkanki jest już wystawiona na działanie krwiobiegu skierowaną do góry, aby skontaktować się z pożywką eksperymentalną. Następnie włóż uchwyt z chusteczką do arkusza uszczelki, który jest osadzony w dolnej metalowej ramie komory.

Przymocuj górną metalową ramę z odpowiednim arkuszem uszczelki na dnie komory za pomocą wcześniej włożonego uchwytu na chusteczki. Następnie zamontuj całą komorę za pomocą ośmiu i nakrętek. Upewnij się, że wysokość komory jest zawsze taka sama we wszystkich przeszczepach za pomocą suwmiarki lub linijki.

Następnie połącz komorę przepływową z pompą perystaltyczną. Następnie połącz 400-mililitrowy zbiornik płynu z rurkami. Perfuzjować tkanki za pomocą 100-mililitrowych zawiesin od dziesięciu do siedmiu znakowanych fluorescencyjnie jednostek tworzących kolonie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z czystym stresem trzech mililitrów na centymetr kwadratowy i odpowiadającym mu natężeniem przepływu czterech mililitrów na minutę przez jedną godzinę za pomocą pompy perystaltycznej i zbiornika bakteryjnego.

Recyrkulować w sposób ciągły 100-mililitrową zawiesinę bakteryjną przy użyciu tego samego zbiornika zbiorczego. Po perfuzji zdemontuj komorę, aby uwolnić przeszczep. Umyj kawałek tkanki dwa razy czterema mililitrami PBS na 12-dołkowej płytce za pomocą wytrząsarki orbitalnej przez trzy minuty.

Następnie należy przeciąć wewnętrzną część przeszczepu za pomocą stempla do biopsji skóry o mniejszej średnicy. Umieść każdą biopsję tkanki w oddzielnej 14-mililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr sterylnego 0,9% chlorku sodu. Odłącz bakterie od tkanki za pomocą kąpieli sonicyjnej przez 10 minut.

Przygotuj pojedynczą 14-mililitrową probówkę z 10 mililitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu, aby wykonać seryjne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej otrzymanej po sonikacji. Oznacz rurkę numer dwa. Przygotuj trzy 14-mililitrowe probówki z 10 mililitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu do seryjnych rozcieńczeń początkowej zawiesiny bakteryjnej pobranej do eksperymentu z obfitością.

Oznacz rurki numerem trzy, numer cztery i numer pięć. Następnie zabezpiecz trzy płytki agarowe, jedną do perfuzji bakteryjnej, jedną do kontrolnej perfuzji PBS, a trzecią do początkowej zawiesiny bakteryjnej używanej do perfuzji. Oznacz trzy sektory na płytkę do eksperymentu tkankowego w następujący sposób: 10-1, 10-3 i 10-4.

Aby policzyć liczbę jednostek tworzących kolonie w perfuzji bakteryjnej, oznacz płytkę w następujący sposób: 10-1, 10-3, 10-5 i 10-7. Wirować probówki zawierające biopsję tkanki przez 15 sekund każda, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia. Aby przygotować seryjne rozcieńczenia, przenieś 100 mikrolitrów probówki numer jeden do probówki numer dwa i przekręć probówkę, aby dokładnie wymieszać roztwór.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawartości probówki numer jeden i numer dwa na odpowiednich sektorach, 10-1 i 10-3 płytki agarowej. Następnie rozprowadź 10 mikrolitrów rurki numer dwa na sektorze 10 czwartym. Powtórz ten krok cztery razy, aby uzyskać cztery oddzielne narośla z każdej objętości 10 mikrolitrów.

Aby przygotować seryjne rozcieńczenia początkowej hodowli, najpierw wirować rozcieńczenie przez 15 sekund i przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do probówki numer trzy i energicznie wymieszać przez wirowanie. Dodaj 100 mikrolitrów probówki numer trzy do probówki numer cztery i ponownie wymieszaj. Powtórz procedurę dla rurki numer pięć od rurki numer cztery.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawartości probówek numer trzy, numer cztery, numer pięć i oznaczoną kulturę początkową odpowiednio na sektorach 10-3, 10-5, 10-7 i 10-1 płytki agaru z krwią. Pozostaw płytki z agarem do krwi pod okapem laminarnym, aby wysuszyć rozprzestrzenianie się bakterii, zwykle przez 10 minut. Następnie umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza do inkubacji przez noc.

Po całonocnej inkubacji policz kolonie bakterii, aby uzyskać liczbę CFU. W warunkach zwykłego stresu podobne przyczepienie się bakterii w różnych tkankach przeszczepu zaobserwowano zarówno w przypadku zakażenia Staphylococcus aureus, jak i Staphylococcus epidermidis. Po zabiegach Streptococcus sanguinis wykazywał znaczne zmniejszenie przylegania do ściany żyły szyjnej bydła w porównaniu z plastrem osierdzia bydlęcego.

Porównując te trzy gatunki bakterii, Streptococcus sanguinis wykazuje znacznie mniejszą przyczepność do ściany żyły szyjnej bydła w porównaniu z Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis. Przystępując do tego zabiegu, należy pamiętać o przygotowaniu odpowiednich tkanek tej samej głowy. Zapewni to podobne warunki we wszystkich próbkach eksperymentalnych i zminimalizuje zmienność danych między różnymi seriami eksperymentów.

Po jej opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom na stopniowe badanie złożonych systemów zaburzeń, wzbogacając swoje podejścia do modeli in vitro o różne elementy, aby zbudować pełną złożoność zbliżoną do stanu medycznego.