Name: Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj model komory przepływowej in vitro do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu. Ta metoda pozwala badać patogenezę zakaźnego zapalenia wsierdzia i interakcje molekularne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było sponsorowane przez grant Funduszu Badawczego KU Leuven (OT/14/097) przyznany RH. TRV był adiunktem w Fundacji Badawczej FWO - Flandria (Belgia; Numer grantu - 12K0916N) i RH jest wspierany przez Fundusz Badań Klinicznych UZ Leuven.

1. Przygotowanie tkanek do badań in vitro
Uwaga: Użyto trzech rodzajów tkanek: plastra osierdzia bydlęcego (BP), kriokonserwowany homograft (CH) i przeszczepy żyły szyjnej bydlęcej (BJV). W przypadku przewodu BJV i CH (tkanka przetworzona przez Europejski Bank Homoprzeszczepów (EHB) i przechowywana przed użyciem w ciekłym azocie) wykorzystano zarówno płatki ścienne, jak i zastawkowe. Łata BP i przewód BJV zostały zakupione od producentów. Przed użyciem rozmrozić CH zgodnie z instrukcjami EHB12.
<ol>
	<li>Przed użyciem spłucz wszystkie chusteczki 0,9% NaCl.</li>
	<li>Przygotuj biopsje tkanek za pomocą jednorazowego dziurkacza do biopsji skóry, aby wyciąć okrągłe kawałki tkanki (o średnicy 10 mm).</li>
	<li>Przytnij wszystkie plastry tkanek na tę samą wysokość za pomocą jednorazowych sterylnych skalpeli.</li>
	<li>W przypadku tkanek utrwalonych aldehydem glutarowym (na przykład przewód BJV) należy inkubować fragmenty przeszczepu przez noc w temperaturze 4 °C z 200 g/l albuminy ludzkiej w celu zneutralizowania utrwalacza.</li>
	<li>Wypłukać pozostałości aldehydu glutarowego z 0,9% NaCl na płytce do mikromiareczkowania. Powtórz 3 razy przez 1 minutę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii do eksperymentów perfuzyjnych
Uwaga: Użyto trzech izolatów bakteryjnych: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 i S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus i S. epidermidis hodowano w temperaturze 37 °C w bulionie sojowym tryptycznym (TSB), a S. sanguinis w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w bulionie do infuzji serca (BHI).
<ol>
	<li>Przygotuj nocną hodowlę bakterii na stałej płytce z agarem z krwią.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pętli zeskrobać zamrożone bakterie i zaszczepić na płytce z agarem z krwią Muellera-Hintona w celu przeprowadzenia nocnej hodowli w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sterylnej pętli inokulacyjnej, aby pobrać pojedynczą kolonię z nocnej kultury agaru z krwią i zaszczepić w 10 ml TSB lub BHI w probówce o pojemności 14 ml i hodować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować nocne kultury (3000 x g, 4 °C, 10 min) i ponownie zawiesić granulki w 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Umieść probówki o pojemności 14 ml na lodzie.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotność 3,7 mg/ml roztworu estru N-hydroksy-sukcynimidylu (CF) karboksy-fluoresceiny (CF) w etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dalej rozcieńczyć zapas CF do 150 μg/ml przy użyciu "ultraczystej" wody. 
	Uwaga: Probówki należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować bakterie (3000 x g, 4 °C, 10 min) i ponownie zawiesić granulki w 800 μl PBS i dodać 200 μl roztworu CF o stężeniu 150 μg/ml (końcowe stężenie 30 μg/ml używane do eksperymentów perfuzyjnych). Chronić probówki przed światłem folią aluminiową i inkubować przez 30 minut za pomocą wytrząsarki orbitalnej.</li>
	<li>Po znakowaniu zablokować 2% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i odwirować (3000 x g, 4 °C, 10 min). Następnie należy przeprowadzić etap płukania przy użyciu 10 ml PBS i bakterii granulowanych przez odwirowanie (3000 x g, 4 °C, 10 min).</li>
	<li>Rozcieńczyć bakterie PBS, aby uzyskać 107 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml (zweryfikowane przez CFU liczące na płytkach z agarem z krwią Muellera-Hintona), co odpowiada OD600 (gęstość optyczna) 0,65. Trzymaj probówki w ciemności na lodzie przed eksperymentami perfuzyjnymi. 
	Nuta. Należy pamiętać, że pomiary OD600 odzwierciedlają przybliżoną liczbę bakterii. W celu obliczenia skutecznej dawki inokulacji, metoda seryjnego rozcieńczania jest dodatkowym niezbędnym krokiem w celu sprawdzenia liczb opartych na OD, jak opisano w sekcji 3.8.</li>
</ol>
3. Eksperymenty perfuzyjne in vitro z wykorzystaniem komory przepływowej z równoległą płytką
<ol>
	<li>Zamontuj biopsje tkanek o średnicy 10 mm i tej samej grubości (przygotowane w krokach 1.1 - 1.5) w systemie komór przepływowych z wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry, aby uzyskać kontakt z zawiesiną bakteryjną. 
	Uwaga: Ta sama grubość tkanki w różnych przeszczepach zapewnia osiągnięcie tej samej wysokości tkanki w kanale, umożliwiając przepływ laminarny w każdych warunkach. Wszystkie elementy komory przepływowej są przedstawione i opisane w Rysunek 1.
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć protokół, umieść okrągły kawałek tkanki między szkiełkiem mikroskopowym z okrągłą perforacją 8 mm a gumową uszczelką. 
		Uwaga: Szkiełko mikroskopowe posiada ultracienką dolną folię, która umożliwia wygenerowanie otworu o średnicy 8 mm. Wraz z arkuszem gumy mocuje tkankę, aby umożliwić bezpośredni kontakt między próbką a przepływającym podłożem, a także zapobiega przemieszczeniu biopsji podczas eksperymentu. Powierzchnia badanej tkanki, która jest wystawiona na działanie przepływu (mniejsza średnica), nie może być manipulowana przez kleszcze.</li>
		<li>Włóż uchwyt z chusteczką do arkusza uszczelki, który jest osadzony w dolnej metalowej ramie komory. </li>
		<li>Przymocuj górną metalową ramę z odpowiednim arkuszem uszczelki do dolnej części komory za pomocą wcześniej włożonego uchwytu na chusteczki. Następnie zamontuj całą komorę za pomocą ośmiu i nakrętek. Upewnij się, że wysokość komory jest zawsze taka sama we wszystkich przeszczepach. 
		Uwaga: Wysokość komory należy ustalać zawsze po dokręceniu. Użyj suwmiarki lub linijki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć komorę przepływową z pompą perystaltyczną i zbiornik płynu z rurkami.</li>
	<li>Perfuzja tkanek za pomocą zawiesin 10 7 CFU/ml (zweryfikowanych przez zliczanie CFU i odnoszących się do pomiarów OD600) fluorescencyjnie znakowanych bakterii w PBS z naprężeniem ścinającym 3 dyn/cm2 (dyn na centymetr kwadratowy jednostki ciśnienia) za pomocą pompy perystaltycznej (natężenie przepływu 4 ml/min) przez 1 godzinę przy użyciu zbiornika bakteryjnego o pojemności 400 ml (projekt własny, <silna klasa="xfig">Rysunek 1) kondycjonowane w temperaturze 37 °C za pomocą termostatu płytowego (tabela materiałów).</li>
	<li>Zawiesinę bakteryjną o pojemności 100 ml należy prowadzić w sposób ciągły w celu jej recyrkulacji, korzystając z tego samego zbiornika zbiorczego.</li>
	<li>Po perfuzji zdemontuj komorę, aby uwolnić przeszczep i umyj kawałek tkanki dwa razy 4 ml PBS na 12-dołkowej płytce za pomocą laboratoryjnej wytrząsarki orbitalnej przez 3 minuty każda. Następnie należy przeciąć wewnętrzną część przeszczepu za pomocą stempla do biopsji skóry o mniejszej średnicy.</li>
	<li>Umieść każdą biopsję tkanki w oddzielnej probówce o pojemności 14 ml zawierającej 1 ml sterylnego 0,9% NaCl. Oznacz tubę jako #1.</li>
	<li>Odłączyć bakterie od tkanki za pomocą kąpieli sonizacyjnej przez 10 minut (amplituda = 100% i częstotliwość = 45 kHz). 
	Uwaga: Całkowite oderwanie bakterii od przeszczepów tkankowych należy ocenić po inkubacji plastrów przez noc w temperaturze 37 °C w płynnym podłożu TSB, a następnie pomiarach OD600 w porównaniu z plastrami kontrolnymi traktowanymi roztworem wolnym od bakterii.</li>
	<li>Użyj metody seryjnego rozcieńczania na płytkach agarowych krwi Muellera-Hintona, aby policzyć jtk.
	<ol>
		<li>Przygotować pojedynczą probówkę o pojemności 14 ml z 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby wykonać seryjne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej otrzymanej po sonikacji. Oznacz tę tubę jako #2. 
		Uwaga: Do każdego eksperymentu tkankowego niezbędna jest jedna probówka z 10 ml 0,9% NaCl.</li>
		<li>Przygotować trzy probówki o pojemności 14 ml z 10 ml sterylnego 0,9% NaCl do seryjnych rozcieńczeń początkowej zawiesiny bakteryjnej z kroku 2.7. Oznacz probówki w następujący sposób #3, #4, #5. 
		Uwaga: Ten krok jest niezbędny, aby poznać rzeczywistą liczbę CFU w zawiesinie bakteryjnej użytej w eksperymencie perfuzjowym.</li>
		<li>Mieszaj każdą probówkę przez 15 sekund. Mieszaj probówki z biopsją tkanki, a także początkową zawiesiną bakteryjną, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia.</li>
		<li>Przygotować trzy płytki agarowe, dwie do eksperymentu tkankowego (perfuzja bakterii i kontrolna perfuzja PBS), a trzecia do początkowej zawiesiny bakteryjnej używanej do perfuzji.</li>
		<li>Oznaczyć trzy sektory na każdą płytkę do eksperymentu tkankowego w następujący sposób: 10-1, 10-3 i 10-4. Aby policzyć liczbę CFU w perfuzatach bakteryjnych, oznacz płytkę w następujący sposób: 10-1, 10-3, 10-5 i 10-7, 
		Uwaga: Wszystkie oznaczenia na płytkach agarowych, takie jak 10-1, 10-3 i tak dalej, odnoszą się do ostatecznej liczby jtk/ml obliczonej następnego dnia. Płyta sterownicza nie wymaga żadnych sektorów. Przed użyciem płytki agarowe z krwią należy umieścić pod kapturem laminarnym i otworzyć w celu usunięcia nadmiaru wilgoci.</li>
		<li>Aby kontynuować przygotowywanie seryjnych rozcieńczeń, przenieś 100 μl probówki #1 do probówki #2 i energicznie wymieszaj z wirem.</li>
		<li>Rozprowadzić 100 μl zawartości probówki #1 i #2 na odpowiednich sektorach 10-1 i 10-3 płytki agarowej. Podobnie, rozprowadź 10 μl probówki #2 na sektorze 10-4, powtórz ten krok 4 razy, aby uzyskać 4 oddzielne narośla z każdej objętości 10 μL. 
		Uwaga: Ze względu na małą objętość używaną do powlekania w sektorze 10-4, zaleca się posiadanie wielokrotnej liczby kropel, aby uzyskać średnią liczbę wyhodowanych CFU.</li>
		<li>Aby przygotować seryjne rozcieńczenia początkowej hodowli, przenieś 100 μl zawiesiny bakteryjnej z kroku 2.7 do probówki #3 i energicznie wymieszaj z wirem. Dodaj 100 μl probówki #3 do probówki #4 i dobrze wymieszaj, powtórz procedurę dla kolejnej probówki #5.</li>
		<li>Rozprowadzić 100 μl zawartości probówek #3, #4, #5 i dostosowanej zawiesiny bakteryjnej (krok 2.7) odpowiednio na sektorach 10-3, 10-5, 10-7 i 10-1 płytki z agarem do krwi.</li>
		<li>Pozostaw płytki z agarem do krwi w okapie laminarnym, aby wyschły na powietrzu, rozprzestrzeniając się bakterie, zwykle przez 10 minut. Następnie umieścić płytki w temperaturze 37 °C do inkubacji przez noc.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji należy policzyć kolonie bakteryjne, aby uzyskać liczbę CFU wynikającą z adhezji do biopsji tkanek, a także CFU/ml w wyjściowej zawiesinie bakteryjnej używanej do perfuzji. Wyrażać wyniki w jtk/cm2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna przylegających bakterii do przeszczepiania tkanek po perfuzji
<ol>
	<li>Po perfuzji umyj kawałki tkanki PBS (patrz krok 3.5) i odetnij wewnętrzną część przeszczepu za pomocą stempla o mniejszej średnicy.</li>
	<li>Przygotować płytkę 6-dołkową i umieścić kropelki podłoża montażowego (Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść każdy kawałek tkanki perfundowaną powierzchnią w dół na pojedynczej kropli podłoża montażowego.</li>
	<li>Odczytaj płytkę za pomocą skanera fluorescencyjnego (tabela materiałów). Ustaw parametry długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z fluoroforem używanym do znakowania bakteryjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Ostatnie obserwacje kliniczne wskazują na to, że IE jest szczególnym powikłaniem u pacjentów, którzy przeszli wymianę zastawki RVOT 6,13. Dysfunkcja wszczepionej zastawki w IE jest wynikiem interakcji bakteryjnej z przeszczepem wewnątrznaczyniowym, prowadzącej do rozległych reakcji zapalnych i prokoagulacyjnych 1,14. Zaprezentowany nowy model in vitro pozwolił na zbadanie, czy różnice w budowie t...

Staphylococcus aureus (S. aureus) wykorzystuje różnorodne strategie wirulencji, aby obejść system obrony immunologicznej gospodarza, kolonizując biologiczne lub niebiologiczne powierzchnie wszczepione do ludzkiego krążenia, co prowadzi do poważnych infekcji wewnątrznaczyniowych, takich jak sepsa i IE1,2,3,4,5. IE pozostaje ważnym powikłaniem związanym z leczeniem u pacjentów po implantacji protez zastawek serca, podczas gdy poszczególne czynniki przyczyniające się do wystąpienia IE nie są jeszcze w pełni poznane6,7. W warunkach przepływu bakterie napotykają siły ścinające, które muszą pokonać, aby przylgnąć do ściany naczynia8. Interesujące są modele, które pozwalają badać wzajemne oddziaływanie między bakteriami a protezą tkanki zastawki lub śródbłonka pod przepływem, ponieważ lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo.
Kilka specyficznych mechanizmów ułatwia bakteryjne przyleganie do komórek śródbłonka (ECs) i do odsłoniętej macierzy podśródbłonkowej (ECM), prowadząc do kolonizacji tkanek i dojrzewania roślin, co jest niezbędnym wczesnym krokiem w IE9. Różne gronkowcowe białka powierzchniowe lub MSCRAMM (mikrobiologiczne składniki powierzchniowe rozpoznające cząsteczki macierzy adhezyjnej) zostały opisane jako mediatory adhezji do komórek gospodarza i białek ECM poprzez interakcję z cząsteczkami takimi jak fibronektyna, fibrynogen, kolagen i czynnik von Willebranda (VWF)8,10,11. Jednak ze względu na wewnątrzcząsteczkowe fałdowanie niektórych czynników wirulencji, badane głównie w warunkach statycznych, wiele z tych interakcji może mieć różne znaczenie w infekcjach wewnątrznaczyniowych we krwi krążącej.
Dlatego prezentujemy zaprojektowany przez nas model komory przepływu równoległego na płytce in vitro, który pozwala na ocenę przylegania bakterii do różnych składników ECM i EC w kontekście przeszczepów tkanek wszczepionych w pozycji RVOT. Ogólnym celem metody opisanej w niniejszej pracy jest zbadanie mechanizmów interakcji między bakteriami a leżącymi u ich podstaw tkankami wewnątrznaczyniowymi w warunkach przepływu, które są ściśle związane ze środowiskiem in vivo patogenów krwi, takich jak S. aureus. To nowatorskie podejście koncentruje się na podatności powierzchni przeszczepionych tkanek na przyleganie bakterii w celu zidentyfikowania potencjalnych czynników ryzyka rozwoju IE.

<table><tbody><tr><td>Plaster na osierdzie bydlęce (BP), giętkie osierdzie osierdzia</td><td>Synovis Innowacje chirurgiczne, USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Przewody żyły szyjnej bydła (BJV)</td><td>Przewód Contegra; Medtronic Inc, Stany Zjednoczone</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>homograft kriokonserwowany CH</td><td>Europejski Bank Homograftów (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, USA</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr> <tr><td>Albumina ludzka</td><td>Flexbumina; Baxter, Belgia</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Bulion sojowy tryptyczny (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Niemcy</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Rosół z naparu sercowego (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Karboksyfluoresceina N-hydroksysukcynimid ester (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (MODEL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Niemcy</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel sonikująca</td><td>Myjka ultradźwiękowa VWR; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Antiblade Mountant Invitrogen firmy ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (skaner fluorescencyjny)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - woda ultraczysta - H2O</td><td>MilliQ Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe - Komory do hodowli tkankowych (1-dołkowe)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1-studzienkowy na Lumox odłączany</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Stal nierdzewna - ostrza chirurgiczne</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Rurka silikonowa, 1/8 "ID x 1/4" OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Zakres temperatur: &ndash; od 80 do 200&deg; C Sterylizacja: Za pomocą tlenku etylenu, promieniowania gamma lub autoklawu przez 30 minut, ciśnienie 15 psi</td></tr><tr><td>Rurki PharMed BPT</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoklawowalne 30 min w temperaturze 121& C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Rurki</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15312022 Termostat</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Różne przewody z zaworami i zastawki montowane na stentach są używane do wymiany zastawki prawej komory drogi odpływu (RVOT) u pacjentów z wrodzonymi wadami serca. Jednak w przypadku stosowania materiałów protetycznych przeszczepy te są podatne na infekcje bakteryjne i różne reakcje gospodarza.
Identyfikacja czynników bakteryjnych i gospodarzy, które odgrywają istotną rolę w wewnątrznaczyniowym przyleganiu mikroorganizmów, jest niezbędna do lepszego zrozumienia patofizjologii początku infekcji, takich jak infekcyjne zapalenie wsierdzia (IE) i opracowania strategii prewencyjnych. W związku z tym konieczne jest opracowanie kompetentnych modeli do badania adhezji bakterii w fizjologicznych warunkach ścinania. W tym miejscu opisujemy zastosowanie nowo zaprojektowanej komory perfuzyjnej in vitro opartej na równoległych płytkach, która umożliwia badanie przylegania bakterii do różnych składników przeszczepionych tkanek, takich jak odsłonięta macierz zewnątrzkomórkowa, komórki śródbłonka i obszary obojętne. Ta metoda w połączeniu ze zliczaniem jednostek tworzących kolonie (CFU) jest wystarczająca do oceny skłonności materiałów do przeszczepów w kierunku adhezji bakteryjnej pod przepływem. W dalszej kolejności system komór przepływowych może być wykorzystany do zbadania roli składników krwi w adhezji bakterii w warunkach ścinania. Wykazaliśmy, że źródło tkanki, morfologia jej powierzchni i specyficzność gatunkowa bakterii nie są głównymi czynnikami decydującymi o przyleganiu bakterii do przeszczepionych tkanek, korzystając z naszego własnego modelu perfuzji in vitro.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw rozwoju IE, model ten umożliwia ocenę czynników bakteryjnych oraz związanych z tkankami obecnych w in vivo sytuacja wystąpienia zakażenia.
Szczegółowo, nowatorskie podejście in vitro pozwala na ilościowe określenie adhezji bakteryjnej w warunkach przepływu do różnych tkanek przeszczepu poprzez perfuzję bakterii znakowanych fluorescencyjnie nad tkankami, ...

Opisujemy zaprojektowany przez nas model komory przepływowej in vitro, który pozwala na badanie przylegania bakterii do przeszczepionych tkanek.

Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy infekcyjnego zapalenia wsierdzia i patobiogramów w takich dziedzinach, jak wzajemne oddziaływanie między bakteriami, komórkami krwi i komórkami śródbłonka wyściełającymi mięśnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że przeszczepy tkanek mogą być bezpośrednio narażone na wzajemne interakcje z różnymi celami, takimi jak bakterie, płytki krwi i białka w standardowych warunkach przepływu. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię infekcyjnego zapalenia wsierdzia, ponieważ może ona rozwikłać ważne interakcje molekularne i czynniki powodujące wysoką zakaźność niektórych tkanek.Metoda ta dostarcza informacji na temat patogenezy powstawania roślinności. Może być również stosowany w badaniach badających przepuszczalność naczyń krwionośnych, ruchliwość komórek i ekspresję genów komórek. Aby rozpocząć protokół, umieść wcześniej przygotowaną biopsję tkankową o średnicy 10 milimetrów i tej samej grubości między szkiełkiem mikroskopowym a ośmiomilimetrową okrągłą perforacją i gumową uszczelką z wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry, aby zetknąć się z zawiesiną bakteryjną.Skoncentruj się na orientacji przeszczepu tkanki po umieszczeniu w uchwycie. Upewnij się, że wewnętrzna powierzchnia tkanki jest już wystawiona na działanie krwiobiegu skierowaną do góry, aby skontaktować się z pożywką eksperymentalną. Następnie włóż uchwyt z chusteczką do arkusza uszczelki, który jest osadzony w dolnej metalowej ramie komory.Przymocuj górną metalową ramę z odpowiednim arkuszem uszczelki na dnie komory za pomocą wcześniej włożonego uchwytu na chusteczki. Następnie zamontuj całą komorę za pomocą ośmiu i nakrętek. Upewnij się, że wysokość komory jest zawsze taka sama we wszystkich przeszczepach za pomocą suwmiarki lub linijki.Następnie połącz komorę przepływową z pompą perystaltyczną. Następnie połącz 400-mililitrowy zbiornik płynu z rurkami. Perfuzjować tkanki za pomocą 100-mililitrowych zawiesin od dziesięciu do siedmiu znakowanych fluorescencyjnie jednostek tworzących kolonie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z czystym stresem trzech mililitrów na centymetr kwadratowy i odpowiadającym mu natężeniem przepływu czterech mililitrów na minutę przez jedną godzinę za pomocą pompy perystaltycznej i zbiornika bakteryjnego.Recyrkulować w sposób ciągły 100-mililitrową zawiesinę bakteryjną przy użyciu tego samego zbiornika zbiorczego. Po perfuzji zdemontuj komorę, aby uwolnić przeszczep. Umyj kawałek tkanki dwa razy czterema mililitrami PBS na 12-dołkowej płytce za pomocą wytrząsarki orbitalnej przez trzy minuty.Następnie należy przeciąć wewnętrzną część przeszczepu za pomocą stempla do biopsji skóry o mniejszej średnicy. Umieść każdą biopsję tkanki w oddzielnej 14-mililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr sterylnego 0,9% chlorku sodu. Odłącz bakterie od tkanki za pomocą kąpieli sonicyjnej przez 10 minut.Przygotuj pojedynczą 14-mililitrową probówkę z 10 mililitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu, aby wykonać seryjne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej otrzymanej po sonikacji. Oznacz rurkę numer dwa. Przygotuj trzy 14-mililitrowe probówki z 10 mililitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu do seryjnych rozcieńczeń początkowej zawiesiny bakteryjnej pobranej do eksperymentu z obfitością.Oznacz rurki numerem trzy, numer cztery i numer pięć. Następnie zabezpiecz trzy płytki agarowe, jedną do perfuzji bakteryjnej, jedną do kontrolnej perfuzji PBS, a trzecią do początkowej zawiesiny bakteryjnej używanej do perfuzji. Oznacz trzy sektory na płytkę do eksperymentu tkankowego w następujący sposób: 10-1, 10-3 i 10-4.Aby policzyć liczbę jednostek tworzących kolonie w perfuzji bakteryjnej, oznacz płytkę w następujący sposób: 10-1, 10-3, 10-5 i 10-7. Wirować probówki zawierające biopsję tkanki przez 15 sekund każda, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia. Aby przygotować seryjne rozcieńczenia, przenieś 100 mikrolitrów probówki numer jeden do probówki numer dwa i przekręć probówkę, aby dokładnie wymieszać roztwór.Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawartości probówki numer jeden i numer dwa na odpowiednich sektorach, 10-1 i 10-3 płytki agarowej. Następnie rozprowadź 10 mikrolitrów rurki numer dwa na sektorze 10 czwartym. Powtórz ten krok cztery razy, aby uzyskać cztery oddzielne narośla z każdej objętości 10 mikrolitrów.Aby przygotować seryjne rozcieńczenia początkowej hodowli, najpierw wirować rozcieńczenie przez 15 sekund i przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do probówki numer trzy i energicznie wymieszać przez wirowanie. Dodaj 100 mikrolitrów probówki numer trzy do probówki numer cztery i ponownie wymieszaj. Powtórz procedurę dla rurki numer pięć od rurki numer cztery.Rozprowadzić 100 mikrolitrów zawartości probówek numer trzy, numer cztery, numer pięć i oznaczoną kulturę początkową odpowiednio na sektorach 10-3, 10-5, 10-7 i 10-1 płytki agaru z krwią. Pozostaw płytki z agarem do krwi pod okapem laminarnym, aby wysuszyć rozprzestrzenianie się bakterii, zwykle przez 10 minut. Następnie umieść płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza do inkubacji przez noc.Po całonocnej inkubacji policz kolonie bakterii, aby uzyskać liczbę CFU. W warunkach zwykłego stresu podobne przyczepienie się bakterii w różnych tkankach przeszczepu zaobserwowano zarówno w przypadku zakażenia Staphylococcus aureus, jak i Staphylococcus epidermidis. Po zabiegach Streptococcus sanguinis wykazywał znaczne zmniejszenie przylegania do ściany żyły szyjnej bydła w porównaniu z plastrem osierdzia bydlęcego.Porównując te trzy gatunki bakterii, Streptococcus sanguinis wykazuje znacznie mniejszą przyczepność do ściany żyły szyjnej bydła w porównaniu z Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis. Przystępując do tego zabiegu, należy pamiętać o przygotowaniu odpowiednich tkanek tej samej głowy. Zapewni to podobne warunki we wszystkich próbkach eksperymentalnych i zminimalizuje zmienność danych między różnymi seriami eksperymentów.Po jej opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom na stopniowe badanie złożonych systemów zaburzeń, wzbogacając swoje podejścia do modeli in vitro o różne elementy, aby zbudować pełną złożoność zbliżoną do stanu medycznego.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Źródło: Ditkowski, B. i in. Model in vitro systemu perfuzji z równoległymi płytkami do badania przyczepności bakterii do tkanek przeszczepów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje metodę wykorzystania komory przepływu z równoległymi płytami do perfuzji bakterii znakowanych fluorescencją na tkankach przeszczepów naczyń, umożliwiając kontrolowaną analizę adhezji bakteryjnej i wczesnej patogenezy w warunkach przepływu ścinającego.

Model przepływu równoległego z płytkami in vitro do badania przyczepności bakteryjnej na biopsji tkanki

Źródło: Calatayud Arroyo, M., i inni. Ocena opłacalności syntetycznego konsorcjum bakteryjnego na interfejsie in vitro jelito-mikroorganizm. J. Vis. Exp. (2018).Ten film prezentuje model in vitro żywioł–mikrob do badania żywotności bakterii. Współhodowla komórek Caco-2 i HT29-MTX jest inkubowana z bakteriami wstępnie poddanymi zabiegom w symulowanych warunkach trawiennych. Integralność bariery nabłonkowej ocenia się za pomocą oporu elektrycznego nabłonka, a frakcje z ośrodka, rozpuszczonego...

Model jelit in vitro do oceny zrastów i internalizacji bakteryjnej

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis to specyficzny dla człowieka patogen, który infekuje naczynia krwionośne. W tym protokole ludzkie mikronaczynia są wprowadzane do myszy poprzez przeszczepienie ludzkiej skóry myszom z obniżoną odpornością. Bakterie w dużym stopniu przylegają do ludzkich naczyń, prowadząc do uszkodzenia naczyń krwionośnych i rozwoju wysypki plamistej zwykle obserwowanej u ludzi.

Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Poznaj model komory przepływowej in vitro do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu. Ta metoda pozwala badać patogenezę zakaźnego zapalenia wsierdzia i interakcje molekularne.

Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Przeglądaj więcej filmów