Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie mechanizmów, za pomocą których bakterie *Neisseria meningitidis* zakażają ludzkie naczynia krwionośne in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przeszczepienie ludzkiej skóry myszy z niedoborem odporności, co wprowadza ludzkie naczynia krwionośne skóry właściwej. W drugim kroku humanizowane myszy są zakażane bakteriami.

Następnie pozwala się na przebieg infekcji przez określony przedział czasu. W ostatnim kroku pobiera się próbki krwi i tkanek w celu oceny wyniku infekcji. Ostatecznie, do badania postępu infekcji w naczyniach ludzkich wykorzystuje się kombinację histologii, immunofluorescencji oraz analizy krwi i tkanek.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modele hodowli komórkowych czy modele zwierzęce, jest możliwość po raz pierwszy zaobserwowania typowej patologii klinicznej występującej podczas tych infekcji. Jak najszybciej po pobraniu oczyszczono powierzchnię skóry ludzkiej 70% etanolem, a następnie rozłożono ją płasko na dobrze czystej powierzchni, najlepiej pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, używając dermatomu z zaprogramowaną grubością, wycięto plastry o grubości od 200 do 400 mikrometrów z górnej warstwy skóry.

Sprawdź integralność plastrów, a następnie przytnij je do kwadratów o wymiarach dwa na dwa centymetry. Umieść kwadraty w PBS, a następnie oczyść 70% ethanolem obszar wygolony u chirurgicznie przygotowanej, znieczulonej myszy beige z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Po zastosowaniu znieczulenia miejscowego w miejscu przeszczepu, użyj zakrzywionych nożyczek, aby ostrożnie usunąć powierzchowną warstwę skóry myszy z obszaru nieco mniejszego niż fragmenty przeszczepu, dbając o to, by nie uszkodzić naczyni krwionośnych tkanki podskórnej.

Działając szybko, aby zapobiec wysychaniu przeszczepu, należy położyć jeden z plastrów ludzkiej skóry na łożysku przeszczepu, upewniając się, że strona naskórkowa jest skierowana do góry. Wyrównaj krawędź tkanki i utrwal ją za pomocą kleju tkankowego. Następnie ostrożnie dopasuj pozostałą część ludzkiej skóry do łożyska przeszczepu, nakładając niewielkie ilości kleju tkankowego wokół każdej krawędzi.

Zawsze przycinaj skórę ludzką do odpowiedniego rozmiaru, zamiast powiększać łoże przeszczepu. Po potwierdzeniu, że każdy narożnik jest przymocowany, oczyść obszar roztworem jodu i nałóż plaster mocno, ale nie zbyt ściśle, stroną amortyzującą na przeszczep, dbając o to, aby nie utrudniać oddychania zwierzęciu, następnie przymocuj plaster taśmą opatrunkową i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej powierzchni. Po przebudzeniu przenieś zwierzę z powrotem do klatki, aż do momentu, gdy w ramach iniekcji bakteryjnej zostanie przeniesiona nocna kultura na płytce do kultury płynnej.

W poranek dnia infekcji, gdy bakterie osiągną pożądaną koncentrację, rozcieńcz komórki do stężenia 1×10⁷ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie po podaniu znieczulenia, potwierdź sedację przeszczepionych myszy za pomocą odruchu szczypania palca i umieść zwierzęta na podgrzewaczu.

Nanieś maść do oczu na oczy zwierzęcia, a następnie wstrzyknij każdemu myszy dojszyznowo (ip) osiem miligramów ludzkiej transferyny w soli fizjologicznej. Następnie u każdego zwierzęcia odetnij koncówkę ogona i nanieś małą kroplę krwi z ogona na płytkę z agarem, aby potwierdzić sterylność krwi przed zakażeniem.

Następnie wstrzyknij dożylnie 100 µL kultury bakteryjnej poprzez iniekcję zaoczodołową. Po kilku minutach ponownie utnij koniec ogona i przenieś tę próbkę krwi na świeże płytki agarowe. Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie we krwi bezpośrednio po infekcji, zabezpiecz ogon klejem tkankowym, a następnie rozcieńcz inokulum bakteryjne i wysiej je na płytki agarowe z odpowiednimi antybiotykami.

Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie w szczepionce sześć godzin po zakażeniu, pobierz kolejną niewielką ilość krwi z ogona każdej myszy, a następnie rozcieńcz i wysiej krople krwi w sposób zaprezentowany przed chwilą, aby ustalić liczbę jednostek tworzących kolonie po sześciu godzinach. Następnie inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez noc, aby przeprowadzić obliczenie jednostek tworzących kolonie w narządach zakażonych zwierząt.

Rozpocznij od wykonania nacięcia w linii pośrodkowej u każdej uśpionej myszy. Następnie, w przypadku każdego zwierzęcia, przetnij żebro i wykonaj nacięcie w sercu. Za pomocą sterylnej strzykawki pobierz jak największą ilość krwi z serca i jam klatki piersiowej, a następnie przelej ją do oddzielnych sterylnych probówek dla każdej próbki.

Następnie należy usunąć interesujące nas organy, a potem przenieść przeszczepy skóry wraz z towarzyszącymi fragmentami skóry mysiej na jedną sterylną płytkę dla każdego zwierzęcia. Pozostawić pobraną krew do skrzepnięcia na 15 minut, a następnie odwirować. Następnie należy oddzielić osocze od krwi i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy.

Następnie zważ probówki do homogenizacji zawierające po 500 µL PBS. Potem, używając sterylnego wycinaka do biopsji, pobierz próbki biopsji o średnicy 4 mm z każdej wypreparowanej tkanki. Umieść biopsje pojedynczo w probówkach do homogenizacji, dodając jedną kuleczkę o średnicy 2 mm do każdej probówki zawierającej próbkę skóry.

Pozostałe tkanki należy przechowywać w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do badań mikroskopowych, a probówki do homogenizacji zważyć w celu ustalenia masy biopsjatu. Następnie homogenizować próbki przy 6 000 RPM przez 30 sekund, powtarzając homogenizację skóry aż do uzyskania mętnego homogenatu. Na koniec rozsiać zawiesiny komórkowe z każdej probówki na świeże płytki agarowe i inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Aby ustalić liczbę jednostek tworzących kolonie w organach w tych reprezentatywnych wynikach, wykorzystano szczep N. meningitis serogrupy C wykazujący ekspresję GFP.

Morfologia krwi wykazała, że pięć minut po dożylnym wstrzyknięciu 1 × 10⁶ jednostek tworzących kolonie bakterii, w krwi krążyło średnio 1,5 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Po sześciu godzinach średnia liczba wyniosła 4,8 × 10⁴ jednostek tworzących kolonie na mililitr, a po 24 godzinach średnie wartości wynosiły 2,4 × 10⁴ jednostek tworzących kolonie na mililitr.

Jednak w tej grupie 10 myszy u pięciu z nich nie wykryto krążących bakterii, podczas gdy u pozostałych pięciu odnotowano stosunkowo wysoką liczbę. Słupki na tych wykresach przedstawiają wartości mediany dla każdej grupy w odniesieniu do liczby CFU pobranych ze skóry. Próbki wskazują, że większość myszy posiadała znaczną liczbę bakterii w ludzkiej skórze, średnio 2,1 × 10⁴ CFU na mg tkanki po 6 godzinach i 4,4 × 10² CFU na mg tkanki po 24 godzinach.

Przeciwległe próbki skóry mysiej nie wykazały obecności bakterii po 24 godzinach, a po sześciu godzinach stwierdzono jedynie bardzo niską liczbę bakterii, co dowodzi silnego powinowactwa endomeningita do ludzkich naczyń w przeszczepionej tkance. Ogólnie rzecz biorąc, liczby bakterii w pozostałych pobranych organach były bardzo niskie lub niewykrywalne, choć u dwóch zwierząt odnotowano ich obecność, co może być skorelowane z wysoką liczbą krążących bakterii. Model ten może być również wykorzystany do określenia roli czynników wirulencji in vivo.

Na przykład w tym eksperymencie wykorzystano szczepy bakteryjne pozbawione funkcjonalnych pilli typu czwartego; myszy zakażone tymi szczepami mutantami nie wykazywały adhezji bakteryjnej w przeszczepach ludzkiej skóry, co potwierdza kluczową rolę, jaką pilli typu czwartego odgrywają w adhezji in vivo. Na tych obrazach konfokalnych przeszczepu skóry, wykonanych dwie godziny po zakażeniu, można zaobserwować ludzkie naczynia zabarwione lektyną UEA sprzężoną z rodamyną. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest wyraźnie widoczna, a zakażające, GFP-dodatnie meningokoki można wyraźnie zaobserwować w obrębie naczyń.

Ten fragment ludzkiej skóry barwiony H&E wykazuje stan zapalny i przecieki naczyniowe, a także zakrzepicę skoncentrowaną w naczyniach blisko granicy naskórkowo-skórnej. 24 godziny po infekcji, w około 30% przypadków zakażeń, adhezja bakterii w skórze doprowadziła do rozwoju makroskopowo wykrywalnej purpury. Zatem opracowanie tej techniki otwiera drogę badaczom zajmującym się interakcjami między patogenem a gospodarzem do badania mechanizmów choroby w kontekście ludzkich naczyń.