Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie mechanizmów, za pomocą których bakterie zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych infekują ludzkie naczynia krwionośne in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw przeszczepienie ludzkiej skóry myszy z niedoborem odporności, wprowadzając w ten sposób ludzkie naczynia krwionośne skóry. W drugim etapie humanizowane myszy są zarażane bakteriami.

Infekcja może następnie postępować przez określony czas. Na ostatnim etapie pobiera się próbki krwi i tkanek w celu oceny wyniku infekcji. Ostatecznie połączenie histologii, immunofluorescencji oraz analizy krwi i tkanek służy do badania postępu infekcji w naczyniach ludzkich.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak modele hodowli komórkowych lub modele zwierzęce, jest to, że po raz pierwszy możemy zaobserwować typową patologię kliniczną, która ma miejsce podczas tych infekcji. Jak najszybciej po pobraniu oczyść powierzchnię ludzkiej skóry 70% etanolem, a następnie połóż ją płasko na dobrze czystej powierzchni, najlepiej pod kapturem przepływowym. Następnie użyj dermatomu o ustalonej grubości, aby wyciąć plastry o grubości od 200 do 400 mikrometrów od górnej części skóry.

Sprawdź plastry pod kątem integralności, a następnie przytnij je dalej do kwadratów o wymiarach dwa na dwa centymetry. Umieść kwadraty w PBS, a następnie oczyść ogolony obszar chirurgicznie przygotowanego znieczulenia, sześcio- do ośmiotygodniowego, ciężkiego złożonego beżowego myszy z niedoborem odporności z 70% etanolem. Po nałożeniu znieczulenia miejscowego na miejsce przeszczepu użyj zakrzywionych nożyczek, aby ostrożnie usunąć powierzchowną warstwę skóry myszy w obszarze nieco mniejszym niż kawałki przeszczepu, uważając, aby nie naruszyć leżącego poniżej układu naczyniowego.

Poruszając się szybko, aby uniknąć wysuszenia przeszczepu, umieść jeden z plastrów ludzkiej skóry na łożu przeszczepu, upewniając się, że strona naskórka jest skierowana do góry. Wyrównaj krawędź tkanki i przymocuj ją za pomocą kleju do tkanek. Następnie ostrożnie dopasuj resztę ludzkiej skóry do łoża przeszczepu, umieszczając niewielkie ilości kleju tkankowego wokół każdej krawędzi.

Zawsze przycinaj ludzką skórę do odpowiedniego rozmiaru, zamiast powiększać podłoże przeszczepu. Po upewnieniu się, że każdy róg jest zamocowany, oczyść obszar roztworem jodu i nałóż plaster mocno, ale nie ciasno stroną z poduszką na przeszczep, uważając, aby nie wpłynęło to na oddychanie zwierzęcia, a następnie przymocuj plaster taśmą opatrunkową i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej powierzchni. Po przebudzeniu zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce, aż do wstrzyknięcia bakteryjnego, ponownie zaszczepi nocną kulturę płytkową w płynnej kulturze.

Rano w dniu infekcji, gdy bakterie osiągną pożądane stężenie, rozcieńczyć komórki do jednego razy 10 do siódmej kolonii, tworząc jednostki na mililitr. Następnie po znieczuleniu potwierdź sedację przeszczepionych myszy za pomocą palca. Uszczypnij i umieść zwierzęta na poduszce grzewczej.

Umieść maść do oczu na oczach zwierzęcia, a następnie ip. Wstrzyknąć każdej myszy osiem miligramów ludzkiego transferu w roztworze soli fizjologicznej. Następnie dla każdego zwierzęcia odetnij czubek ogona i rozprowadź małą kroplę krwi z ogona na płytce agarowej, aby potwierdzić, że krew jest sterylna przed infekcją.

Następnie wstrzyknąć dożylnie 100 mikrolitrów kultury bakteryjnej za pomocą wstrzyknięcia zaoczodołowego. Po kilku minutach ponownie odetnij koniec ogona i rozprowadź tę próbkę krwi również na świeżych płytkach agarowych. Aby ustalić jednostki tworzące kolonie krwi bezpośrednio po zakażeniu, należy uszczelnić ogon klejem tkankowym, a następnie rozcieńczyć inokulum bakteryjne i rozprowadzić je na płytkach agarowych za pomocą odpowiednich antybiotyków.

Aby ustalić jednostki tworzące kolonię inokulum po sześciu godzinach od zakażenia, należy pobrać kolejną niewielką ilość krwi z każdego z mysich ogonów, a następnie rozcieńczyć i pokryć krople krwi, jak właśnie pokazano, aby ustalić jednostki tworzące kolonię po sześciu godzinach. Następnie inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez noc, aby rozpocząć tworzenie kolonii narządów. Liczba jednostek zakażonych zwierząt.

Zacznij od wykonania nacięcia linii środkowej u każdej myszy poddanej eutanazji. Następnie dla każdego zwierzęcia przetnij żebro i wykonaj nacięcie w sercu. Użyj sterylnej strzykawki, aby pobrać jak najwięcej krwi z serca i klatki piersiowej, a następnie dozuj ją do oddzielnych sterylnych probówek dla każdej próbki.

Następnie należy usunąć interesujące nas narządy, a następnie przenieść przeszczepy skóry i towarzyszące im fragmenty skóry myszy na jedną sterylną płytkę na zwierzę. Pozwól zebranej krwi skrzepnąć przez 15 minut, a następnie odkręć ją. Następnie usuń osocze z krwi i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy.

Następnie zważyć probówki homogenizujące zawierające po 500 mikrolitrów PBS każda. A następnie użyj sterylnego stempla do biopsji, aby pobrać cztery milimetrowe próbki biopsji z każdej wypreparowanej tkanki. Umieścić biopsje pojedynczo w probówkach homogenizujących z jednym dwumilimetrowym koralikiem w każdej probówce zawierającej próbkę skóry.

Przechowuj pozostałe tkanki w 4% para formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do mikroskopii i zważ probówki homogenizujące, aby ustalić wagę biopsji. Następnie homogenizować próbki z prędkością 6 000 obr./min przez 30 sekund, powtarzając homogenizację skóry, aż homogenat stanie się smuczynką. Na koniec rozprowadź zawiesiny komórek z każdej probówki na świeżych płytkach agarowych i hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Aby ustalić jednostkę tworzącą kolonię narządów, liczy się w tych reprezentatywnych wynikach. Szczep zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych N z dodatnim wynikiem GFP. Zastosowano serogrupę C.

Morfologia krwi wykazała, że pięć minut po wstrzyknięciu dożylnym jednego razy 10 do sześciu jednostek tworzących kolonię bakterii, we krwi krążyło średnio 1,5 razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Po sześciu godzinach liczenie wynosi średnio 4,8 razy 10 do czwartej kolonii tworzącej jednostki na mililitr przez 24 godziny. Średnie liczby wynosiły 2,4 razy 10 do czwartej jednostki tworzącej kolonię na mililitr.

Ale w tej grupie 10 myszy pięć nie miało wykrywalnych krążących bakterii, podczas gdy pozostałe pięć miało stosunkowo wysoką liczbę. Te słupki na tych wykresach pokazują mediany wartości dla każdej grupy liczb CFU pobranych ze skóry. Próbki pokazują, że większość myszy ma znaczne liczby w ludzkiej skórze, średnio 2,1 razy 10 do czwartego CFU na miligram tkanki po sześciu godzinach i 4,4 razy 10 do drugiego CFU na miligram tkanki po 24 godzinach.

Próbki skóry myszy po przeciwnej stronie nie wykazywały liczby bakterii po 24 godzinach, a tylko bardzo niską liczbę po sześciu godzinach, co wskazuje na silną preferencję dla końcowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w stosunku do ludzkich naczyń w przeszczepionej tkance. Ogólnie rzecz biorąc, liczba bakterii była bardzo niska lub niewykrywalna w drugim pobranym narządzie, chociaż dwa zwierzęta wykazały liczby, które mogą być skorelowane z wysoką liczbą krążących bakterii. Model ten może być również wykorzystany do określenia roli czynników wirulencji in vivo.

Na przykład w tym eksperymencie użyto szczepów bakteryjnych pozbawionych funkcjonalnej pigułki typu czwartego I, myszy zakażone tymi zmutowanymi szczepami nie wykazywały adhezji bakteryjnej w przeszczepach ludzkiej skóry, co potwierdza kluczową rolę, jaką pigułka typu czwartego I odgrywa w adhezji in vivo. Na tych konfokalnych obrazach przeszczepu skóry, dwie godziny po zakażeniu, można zaobserwować ludzkie naczynia zabarwione lektyną UEA sprzężoną z rominem. Naskórkowa granica skóry jest wyraźnie rozpoznawalna, a zakażenie GFP dodatnie i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych można wyraźnie zaobserwować w całych naczyniach.

Ten przeszczep ludzkiej skóry zabarwiony h i e wykazuje stan zapalny i przecieki naczyniowe, a także zakrzepicę skoncentrowaną na naczyniach w pobliżu granicy skóry naskórka. 24 godziny po zakażeniu w około 30% infekcji zrosty bakteryjne w skórze doprowadziły do rozwoju makroskopowo wykrywalnej plamicy. Tak więc rozwój tej techniki toruje drogę naukowcom zajmującym się badaniami i interakcjami patogenów gospodarza do badania mechanizmów choroby w kontekście ludzkich naczyń.