Name: Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Poznaj mechanizmy infekcji Neisseria meningitidis w ludzkich naczyniach krwionośnych za pomocą humanizowanego modelu myszy z przeszczepioną skórą. Ta metoda umożliwia obserwację patologii klinicznej zakażenia meningokokowego in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Dumenil, szczególnie Silke Silvie za krytyczną lekturę manuskryptu. Oddział chirurgii w Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), dr David Maladry, Michael Hivelin i dr Patrick Bruneval, Oddział Patologii HEGP. Zakład dla zwierząt w PARCC, kierowany przez Elizabeth Huc. Prace te były wspierane przez następujące agencje grantowe: stypendium Marie Curie IEF nr 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant z INSERM, grant na sprzęt CODDIM (region Ile de France), grant na sprzęt FRM (fondation pour la recherche médicale), konsorcjum doskonałości Laboratorium IBEID, grant ANR (Agence Nationale pour la Recherche) grant "Bugs-in-flow". Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Ryzyka i uprawnienia
<ol>
	<li>Lokalne komisje etyczne muszą zatwierdzić wszystkie protokoły dotyczące zwierząt. Protokół ten został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez francuskie i europejskie przepisy dotyczące opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 i 2001-131 oraz Dyrektywa Europejska 2010/63/UE) i zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną Comité d'Ethique en matière d'Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes, Paryż, Francja. Nr katalogowy: CEEA34. GD.002.11.</li>
	<li>W przypadku ludzkiej skóry uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjenta, a wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z francuskimi wytycznymi krajowymi i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną, Comité d'Evaluation Ethique de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paryż, Francja Opinia: 11-048.</li>
	<li>N. meningitidis jest potencjalnie szkodliwym patogenem dla ludzi i należy podjąć wszelkie niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z organizmem. Te środki ostrożności obejmują szczepienia i pracę w warunkach 2 poziomu bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
2. Przeszczep skóry
<ol>
	<li>Zbierz ludzką skórę jak najbliżej czasu przeszczepu. Większość skóry w tej pracy pochodzi z operacji chirurgii plastycznej obejmujących okolicę brzucha. Inne źródła, takie jak piersi, nogi, a nawet twarz, były z powodzeniem stosowane.</li>
	<li>Przygotuj próbkę ludzkiej skóry, czyszcząc powierzchnię skóry 70% EtOH i kładąc ją płasko na dobrze oczyszczonej powierzchni, najlepiej pod kapturem przepływowym.</li>
	<li>Pokrój plastry 200-400 μm od górnej części skóry za pomocą dermatomu o ustalonej grubości.</li>
	<li>Sprawdź plastry skóry pod kątem integralności i pokrój je w kwadraty o wymiarach 2 cm x 2 cm, a następnie umieść w PBS (bez kationów dwuwartościowych) w przypadku szczepienia natychmiast lub w temperaturze 4 °C w DMEM z 10% surowicą do krótkotrwałego przechowywania (3-12 godzin).</li>
	<li>Znieczulenie myszy w wieku 6-8 tygodni SCID.bg(około 20 g) w wieku 6-8 tygodni za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzykniętych i.p.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy sprawdź reakcję na ból, wykonując szczypanie palca u nogi, co jest standardową metodą ustalania odruchu bólowego. Nałóż żel na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i ogol lewą stronę zwierzęcia za ramieniem, gdzie zostanie umieszczony przeszczep. Utrzymuj mysz w cieple na poduszce grzewczej przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Po przygotowaniu myszy do zabiegu, oczyść ogolony obszar 70% EtOH.</li>
	<li>Zastosuj miejscowo znieczulenie miejscowe na miejsce przeszczepu (tronotan) i przygotuj miejsce przeszczepu, ostrożnie usuwając powierzchowną warstwę skóry myszy za pomocą zakrzywionych nożyczek. Uważaj, aby nie zakłócić leżącego poniżej układu naczyniowego.</li>
	<li>Usuń skórę z obszaru nieco mniejszego niż obszar wycinka ludzkiej skóry.</li>
	<li>Usuń plasterek skóry z PBS (lub DMEM) i umieść na łóżku przeszczepu, upewniając się, że strona naskórka jest skierowana do góry. Kroki 2.8-2.10 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, upewniając się, że złoże przeszczepu nie wysycha.</li>
	<li>Wyrównaj jeden róg lub krawędź i przymocuj za pomocą kleju tkankowego. Ostrożnie dopasuj resztę plastra skóry do podłoża przeszczepu, umieszczając niewielkie ilości kleju tkankowego wokół krawędzi. Zawsze przycinaj ludzką skórę do odpowiedniego rozmiaru, zamiast powiększać podłoże przeszczepu.</li>
	<li>Nie naciągaj skóry zbyt mocno na łoże przeszczepu, ponieważ skóra myszy jest bardzo elastyczna.</li>
	<li>Upewnij się, że przeszczep jest przymocowany za pomocą kleju tkankowego w każdym rogu.</li>
	<li>Oczyść obszar roztworem jodu.</li>
	<li>Nałóż plaster z obszarem poduszki na przeszczep. Upewnij się, że plaster jest mocny, ale nie ciasny i że nie ma to wpływu na oddychanie zwierzęcia.</li>
	<li>Przymocuj plaster za pomocą taśmy opatrunkowej.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej powierzchni.</li>
	<li>Po przebudzeniu włóż zwierzę z powrotem do klatki. Zwierzęta trzymane są po 2-3 osobniki w klatce.</li>
	<li>Podczas rekonwalescencji regularnie sprawdzaj myszy pod kątem oznak bólu lub niepokoju. 10-14 dni po szczepieniu usuń plaster, uważając, aby nie zakłócić przeszczepu. Z naszego doświadczenia wynika, że ból pooperacyjny jest minimalny. Niemniej jednak zwierzęta powinny być monitorowane codziennie, w szczególności w ciągu kilku dni po operacji. Kryteria bólu lub dystresu są następujące.
	<ul>
		<li>Utrata masy ciała powyżej 10%</li>
		<li>Wygląd fizyczny, futro, pozycja garbata, oczy</li>
		<li>Przyspieszony oddech lub tętno</li>
		<li>Zmniejszone lub nietypowe ruchy.</li>
		<li>Wzrost temperatury ciała</li>
		<li>W przypadku wykrycia objawów bólu paracetamol podaje się doustnie (300 mg/kg mc., co 4 godziny). Humanitarne punkty końcowe są ściśle przestrzegane, jeśli ból utrzymuje się.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Jeśli przeszczep wygląda na suchy, nakładaj olejek dla niemowląt co 2-3 dni, aby zachować elastyczność skóry.</li>
	<li>Przeszczep jest gotowy do eksperymentów 21 dni po przeszczepie.</li>
</ol>
3. Infekcja
<ol>
	<li>Dzień przed zakażeniem przygotuj szczep bakteryjny, rozpylając na płytkach agarowych GCB odpowiednie antybiotyki. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotowanie bakterii
	<ol>
		<li>Ponownie wprowadzić bakterie do 5 ml pożywki SFM ze śródbłonka ludzkiego z 10% surowicą do OD600 0,05.</li>
		<li>Inkubować, wytrząsając przez 2 godziny w inkubatorze (37 °C przy 5% CO2 ) pod luźną pokrywą, aż do uzyskania gęstości bakteryjnej około600 0,1.</li>
		<li>Odwirować bakterie przez 3 minuty 15 000 obr./min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w PBS, a następnie ponownie odwirować.</li>
		<li>Powtórzyć etap prania (2.2.4-2.2.5) dwukrotnie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad bakteryjny w PBS.</li>
		<li>Zmierz OD600.</li>
		<li>Wykonaj hodowlę OD600 0,1 (108 CFU/ml) lub OD600 1,0 (109 CFU/ml). Z tego znanego stężenia rozcieńczyć do 10-7 jtk/ml. Staraj się przygotować bakterie jak najbliżej czasu wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myszy
	<ol>
		<li>Zważ myszy.</li>
		<li>Znieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) wstrzykniętymi i.p.</li>
		<li>Po zaśnięciu sprawdź, czy reakcja bólowa jest nieobecna przez uszczypnięcie palca u nogi, utrzymuj myszy w cieple za pomocą poduszki rozgrzewającej i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
		<li>Każdej myszy należy podać 8 mg ludzkiej transferyny, zawieszonej w roztworze soli fizjologicznej lub PBS, we wstrzykniętym i.p.</li>
		<li>Weź niewielką kroplę krwi z ogona i rozprowadź na płytce agarowej, aby sprawdzić, czy krew jest sterylna przed infekcją.</li>
		<li>Wstrzyknąć dożylnie 100 μl 107 jtk/ml kultury bakteryjnej (łącznie 106 jtk) przez żyłę zaoczodołową lub ogonową. Pomiary CFU wykonane 5 minut po wstrzyknięciu są spójne niezależnie od miejsca wstrzyknięcia.</li>
		<li>Po kilku minutach odetnij koniec ogona i rozprowadź próbkę krwi na płytkach agarowych z odpowiednimi antybiotykami z jednym 10-krotnym rozcieńczeniem, aby ustalić CFU krwi natychmiast po zakażeniu.</li>
		<li>Uszczelnij ogon klejem tkankowym.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu rozcieńczyć inokulum bakteryjne i rozprowadzić na płytkach agarowych odpowiednimi antybiotykami w celu ustalenia CFU.</li>
		<li>Pozwól myszom dojść do siebie na poduszce grzewczej, aż będą gotowe do ruchu</li>
		<li>Po 6 godzinach od zakażenia należy pobrać niewielką ilość krwi z ogona, rozcieńczyć i ustalić płytkę w celu ustalenia CFU po 6 godzinach.</li>
		<li>Inkubować wszystkie płytki agarowe w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Poświęcenie
<ol>
	<li>W wybranym momencie zakażenia znieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) wstrzykniętymi i.p.</li>
	<li>Po zaśnięciu utrzymuj mysz w cieple za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	<li>Kiedy odruch bólowy minie (szczypanie palca), odetnij koniec ogona i pobraj krew.</li>
	<li>Rozprowadzić krew na płytkach agarowych z odpowiednimi antybiotykami; 5 μl bezpośrednio i 10 μl rozcieńczenia 1:10 w celu ustalenia CFU.</li>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Po złożeniu myszy w ofierze zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi i etycznymi, potwierdź śmierć z powodu braku bicia serca. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, przetnij klatkę piersiową i wykonaj nacięcie w sercu.</li>
	<li>Zbierz jak najwięcej krwi z jamy serca/klatki piersiowej i umieść w sterylnej probówce.</li>
	<li>Wyjąć narządy (np. wątrobę, śledzionę, mózg) na sterylną płytkę.</li>
	<li>Usunąć przeszczep skóry i fragment skóry myszy na sterylną płytkę.</li>
	<li>Wyrzuć korpus myszy.</li>
	<li>Po pozostawieniu pobranej krwi do krzepnięcia przez 15 minut, odwirować ją przez 15 minut z prędkością 3 000 obr./min.</li>
	<li>Usunąć osocze z krwi i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy, na przykład w celu wykrycia cytokin metodą ELISA lub FACS.</li>
</ol>
5. Liczba jednostek CFU narządów
<ol>
	<li>Zważyć probówki homogenizujące zawierające 500 μl PBS każda przed pobraniem próbek do biopsji.</li>
	<li>Pobrać próbki biopsji o średnicy 4 mm z każdej tkanki za pomocą sterylnego stempla do biopsji.</li>
	<li>Umieścić biopsje w wstępnie zważonych probówkach homogenizujących zawierających 500 μl PBS. Homogenizuj próbki skóry za pomocą kulek o średnicy 2 mm, używaj mniejszych kulek do innych narządów.</li>
	<li>Pozostałe tkanki umieścić w 4% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywać w temperaturze 4 °C do mikroskopii (patrz poniżej).</li>
	<li>Zważyć probówki homogenizujące zawierające biopsje w celu ustalenia masy biopsji (do późniejszego obliczenia tkanki CFU/mg).</li>
	<li>Homogenizować próbki.
	<ol>
		<li>Homogenizuj wątrobę, śledzionę i mózg z prędkością 6000 obr./min przez 30 sekund.</li>
		<li>Homogenizować próbki skóry z prędkością 6 000 obr./min przez 30 sekund i powtórzyć w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć z każdej probówki homogenizującej na płytkach agarowych i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w celu ustalenia liczby CFU w organach.</li>
</ol>
6. Histologia/Immunohistochemia
<ol>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Utrwalić tkanki w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Etap fiksacji może być dłuższy; w przypadku przechowywania przez dłuższy czas należy umieścić tkanki w 0,25% PFA.</li>
		<li>Opłucz tkanki w PBS, a następnie umieść je w 20% roztworze sacharozy i wróć do temperatury 4 °C na noc lub do momentu, gdy tkanki zanurzą się w roztworze.</li>
		<li>Umyj chusteczki w PBS, przytnij na wymiar i umieść w roztworze OCT (w formie do tkanek lub przyklejone do płyty bazowej).</li>
		<li>Szybko zamroź tkanki na szalce Petriego unoszącej się w ciekłym azocie.</li>
		<li>Po zamrożeniu chusteczki należy umieścić na suchym lodzie przed przeniesieniem do temperatury -80 °C w celu przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie
	<ol>
		<li>Usunąć tkanki z temperatury -80 °C i pozostawić do zrównoważenia do -20 °C w kriostacie.</li>
		<li>Pokrój tkanki o grubości około 10-15 μm i umieść na powlekanych szkiełkach mikroskopowych.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Pozwól, aby szkiełka osiągnęły temperaturę pokojową.</li>
		<li>Narysuj wokół plasterka na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka. Odczekaj 5-10 min.</li>
		<li>Uwodnij/umyj plasterek w PBS przez 5 minut, powtórz dwa razy.</li>
		<li>Przepuszczalny plaster w 0,1% Trytonie w PBS przez 10 min.</li>
		<li>Prać w PBS 2-3x przez 5 min.</li>
		<li>Zablokuj w PBS 0,1% Triton 1% BSA na 10-60 minut, w zależności od przeciwciała lub barwnika, który ma być użyty.</li>
		<li>Usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone zgodnie z wymaganiami w buforze blokowym. Inkubuj przez określony czas. (Często 1 godzina w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Prać w PBS 2-3x przez 5 min.</li>
		<li>Zastosować przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone odpowiednio w buforze koźlaków; DAPI jest zwykle uwzględniany w tym kroku. Inkubować przez określony czas, często 1-2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
		<li>Prać w PBS 2-3x przez 5 min.</li>
		<li>Zamontuj w bladzeniu zabezpieczające nośniki montażowe za pomocą szkła nakrywkowego i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
		<li>Szkiełka barwione obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej z filtrami/laserami odpowiednimi do zastosowanych fluoroforów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>histologia
	<ol>
		<li>Zezwolić na użycie szkiełek do badania histologicznego, aby osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
		<li>Szkiełka barwienia przy użyciu standardowego protokołu barwienia hematoksyliny / eozyny.
		<ol>
			<li>Umieść szkiełka w stojaku na slajdy.</li>
			<li>Stojak transferowy z prowadnicami między roztworami w następującej kolejności:</li>
			<li>2 sekundy pod bieżącą wodą z kranu.</li>
			<li>3 minuty w przefiltrowanym roztworze hematoksyliny.</li>
			<li>10 sekund pod bieżącą wodą.</li>
			<li>10 sekund w wodzie destylowanej.</li>
			<li>10 sekund do etanolu 100%.</li>
			<li>2 sekundy do przefiltrowanej eozyny.</li>
			<li>10 sekund pod bieżącą wodą.</li>
			<li>10 sekund do etanolu 100%</li>
			<li>2 min do ksylenu x 3 (kąpiel I, II, III).</li>
			<li>Przenieś natychmiast i dodaj kilka kropel kleju utrwalającego na każde szkiełka, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, usuń pęcherzyki powietrza, pozostaw do wyschnięcia na kilka godzin.</li>
			<li>Obraz jest przesuwany pod standardowym mikroskopem światła białego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li>
<li>Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMairey%2C+E+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia%3B+a+clinical+and+pathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li>
<li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li>
<li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li>
<li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li>
<li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li>
<li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li>
<li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin%2C+PilC%2C+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host%27s+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li>
<li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li>
<li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption%3A+resistance+to+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li>
<li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHo%2C+M+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 192, 1205-1211 (2000).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla badań nad patogenezą bakterii. Niemożliwe jest pełne naśladowanie środowiska in vivo w hodowli komórkowej i staje się oczywiste, że na interakcję gospodarz-patogen wpływa wiele czynników dynamicznych. Swoistość dla człowieka niektórych klinicznie ważnych patogenów, takich jak N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes i Salmonella typhi , ograniczyła stosowanie modeli in vivo w przypadku tych zakażeń. Jednak, gdy zaczynamy rozumieć, jakie zakaźne etapy są zaangażowane w specyfikę, opracowywane są humanizowane modele. Opisany tutaj protokół jest tego demonstracją z wprowadzeniem ludzkich mikronaczyń do myszy, co pozwala na rozległe zakażenie in vivo N. meningitidis, powodujące uszkodzenie naczyń krwionośnych, a czasami rozwój wysypki purpurowej.
Korzystając z tego modelu, byliśmy w stanie określić, że właściwości adhezyjne Tfp są zaangażowane w kolonizację naczyń krwionośnych in vivo przy użyciu mutantów bakteryjnych i że uszkodzenie naczyń jest zmniejszone przy braku adhezji18. Wcześniej krążące produkty bakteryjne były zaangażowane w to uszkodzenie, ale nasze wyniki sugerują decydującą rolę w lokalnej adhezji i kolonizacji naczyń. Otwiera to nowe możliwości w zakresie opracowywania nowych celów terapeutycznych. Gdyby udało się farmaceutycznie zablokować adhezję bakterii chorobotwórczych, mogłoby to zapobiec rozwojowi zmian skórnych i doprowadzić do lepszych wyników dla osób, które przeżyły meningokoki, w zakresie martwicy tkanek, oczyszczenia i amputacji. Prace wykazały również złożoność infekcji oraz udział kaskady odpowiedzi immunologicznej i krzepnięcia. Zidentyfikowaliśmy sygnalizację cytokin ludzkich w surowicy zakażonych myszy pomimo stosunkowo niewielkiej ilości ludzkiego śródbłonka18. Wskazywało to na znaczącą odpowiedź cytokinową, wraz z infiltracją populacji komórek odpornościowych myszy w tym obszarze.
Modele zwierzęce oczywiście nigdy nie są w stanie w pełni odtworzyć ludzkiej choroby i wszystkie uzyskane z nich wyniki muszą być brane pod uwagę w tym kontekście. Na przykład w tym modelu krew i krążące komórki są pochodzenia mysiego i nie możemy wykluczyć, że mogą zachowywać się inaczej niż komórki ludzkie. Zaletą tego jednak, jak wykazano w naszej niedawnej publikacji18, jest zdolność do różnicowania sygnalizacji pochodzącej z ludzkiego śródbłonka od sygnalizacji krążących komórek myszy. Tło z obniżoną odpornością myszy wykorzystanych w tym modelu pozwoliłoby również na allogeniczny transfer populacji ludzkich komórek odpornościowych, dodając kolejny aspekt "humanizacji". Tło myszy z obniżoną odpornością może jednak maskować rolę limfocytów NK, T lub B, których brakuje lub są wadliwe w tym modelu. Stosunkowo krótki przedział czasowy (24 godziny) stosowany w tym modelu dotyczy głównie odpowiedzi wrodzonej, ale w przypadku długotrwałych infekcji i rozwoju odporności może być konieczne zbadanie innych opcji.
Skóra jest ważnym miejscem zakażenia N. meningitidis, ale stosunkowo niewielka liczba ludzkich naczyń krwionośnych oznacza również, że ekstrapolacja danych na infekcję ogólnoustrojową obejmującą wiele narządów jest trudna. Chociaż model ten pozwala na badanie rozwoju zmian skórnych, nie uwzględniono w nim ważnych etapów infekcji meningokokowej, takich jak nabłonek i skrzyżowanie krwi z mózgiem. Konieczny jest dalszy rozwój tych humanizowanych modeli, aby zająć się tymi innymi aspektami infekcji. Niemniej jednak model ten oferuje ogromny potencjał dla wielu patogenów specyficznych dla człowieka, szczególnie tych atakujących naczynia krwionośne.

Sepsa meningokokowa jest często śmiertelną infekcją przenoszoną przez krew, wywoływaną przez patogen bakteryjny Neisseria meningitidis. U pacjentów z posocznicą meningokokową często występuje wybroczynowa lub purpurowa wysypka na skórze, która wcześniej była związana ze zniszczeniem naczyń krwionośnych spowodowanym przez krążące bakterie i produkty bakteryjne1. Biopsje skóry od pacjentów klinicznych wykazują bakterie związane z mikronaczyniami, często wypełniającymi naczynia2. Oprócz bakterii rozległa zakrzepica, krzepnięcie, przekrwienie i nieszczelność naczyniowa obserwuje się w obszarach purpurowych3-5. To uszkodzenie naczyń może prowadzić do rozległej martwicy skóry i otaczających tkanek, co prowadzi do oczyszczenia, a nawet amputacji u osób, które przeżyły meningokoki. Zrozumienie, w jaki sposób infekcja powoduje to uszkodzenie naczyń krwionośnych, jest ważne dla optymalizacji strategii zapobiegania i leczenia. Większość badań nad posocznicą meningokokową przeprowadzono in vitro na ludzkich liniach komórkowych ze względu na ludzką specyficzność N. meningitidis. Wiele aspektów infekcji badano in vitro, w tym adhezję bakteryjną, odpowiedź komórek gospodarza, a także odpowiedź cytokin6-9. Pilusy typu IV (Tfp) są uważane za główne organelle adhezyjne N. meningitidis zarówno na komórkach nabłonka, jak i śródbłonka10. Wykazano również, że przyleganie N. meningitidis do komórek gospodarza jest zależne od naprężeń ścinających i dlatego uważa się, że jest związane z szybkością przepływu krwi w mikrokrążeniu11. Sugeruje to, że dynamiczne stresy, z którymi bakterie spotykają się in vivo, mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Modelowanie mikrośrodowiska małych naczyń krwionośnych in vitro jest jednak bardzo trudne.
Receptor adhezyjny dla Neisseria Tfp jest nadal nieznany, dlatego w tej chwili nie można przewidzieć strategii domina w celu uzyskania adhezji bakteryjnej w modelu zwierzęcym. Sugerowano, że CD46 jest receptorem Tfp, a transgeniczne zwierzęta zostały wyprodukowane, aby działały jako modele mysie. Jednak zakażenie u tych zwierząt nie prowadzi do rozległego zakażenia ani do rozwoju wysypki12,13. Inne modele zwierzęce, które zostały opisane pod kątem aspektu bakteriemicznego zakażenia Neisseria, uwzględniają preferencję bakterii dla ludzkiej transferyny jako źródła żelaza14,15. Suplementacja ludzkiej transferyny lub ekspresja jej z transgenu powoduje zwiększenie obciążenia bakteryjnego w krwiobiegu przez dłuższy czas, ale model ten nie wykazuje adhezji bakteryjnej ani rozwoju wysypki16,17.
W tym protokole opisujemy humanizowany model myszy, w którym ludzka skóra, w tym mikrokrążenie skórne, jest przeszczepiana myszom z obniżoną odpornością18,19. W ten sposób powstają funkcjonalne naczynia ludzkie, ukrwione z krążeniem myszy. W połączeniu z suplementacją transferyny u ludzi, model ten uwzględnia co najmniej dwa specyficzne dla człowieka aspekty N. meningitidis, tj. ludzki śródbłonek i ludzką transferynę, w środowisku in vivo. N. meningitidis wprowadzony dożylnie do tego modelu przylega specyficznie do ludzkiego śródbłonka, powodując patologię podobną do tej, którą zgłasza się u pacjentów klinicznych, w tym uszkodzenie naczyń krwionośnych i rozwój wysypki plamistej18.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Virbac Francja</td><td></td><td>nr partii VAL4243</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&deg; FR/8146715 2/1980</td><td>nr partii KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medicament Autoris&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC baza agarowa</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Śródbłonek ludzki Pożywka</td><td>SFM Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lektyna - rodamina</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Trzeźwy dermatom rąk</td><td>Humeca BV, Holandia</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Pomieszczenia dla zwierząt</td><td>Innowacyjny</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Rurki M z matrycą lizującą Fast-Prep</td><td>MP Bio 116923050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>nośniki montażowe VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Klej tkankowy</td></tr><tr><td>OCT tka</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis powoduje ciężką, często śmiertelną sepsę, gdy dostaje się do ludzkiego krwiobiegu. Zakażenie prowadzi do rozległego uszkodzenia naczyń krwionośnych, co prowadzi do nieszczelności naczyniowej, rozwoju wysypki purpurowej i ostatecznie martwicy tkanek. Badanie patogenezy tej infekcji było wcześniej ograniczone przez ludzką specyfikę bakterii, co utrudniało modelowanie in vivo. W tym protokole opisujemy humanizowany model tej infekcji, w którym ludzka skóra, zawierająca mikronaczynia skórne, jest szczepiona myszom z obniżoną odpornością. Naczynia te łączą się z krążeniem myszy, zachowując przy tym swoje ludzkie cechy. Po wprowadzeniu do tego modelu N. meningitidis przylega wyłącznie do ludzkich naczyń, powodując rozległe uszkodzenia naczyń krwionośnych, stan zapalny, aw niektórych przypadkach rozwój wysypki plamistej. Protokół ten opisuje etapy szczepienia, infekcji i oceny tego modelu w kontekście zakażenia N. meningitidis. Technika ta może być stosowana do wielu specyficznych dla człowieka patogenów, które infekują krwioobieg.

Oznaczanie liczby CFU
Szczep N. meningitidis wykorzystany w tych reprezentatywnych wynikach to N. meningitidis 8013 klon 12, izolat kliniczny serogrupy C, wykazujący ekspresję piliny klasy I SB, Opa-, Opc-, PilC1+/PilC2+ 20. Szczep został zmodyfikowany genetycznie w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) poprzez insercję chromosomową18. Liczbę jednostek tworzących kolonie bakterii ustalono poprzez zliczenie liczby kolonii na płytkach z agarem i obliczenie wartości CFU/ml krwi lub CFU/mg tkanki z znanych objętości wysianych na płytki. Pomiary we krwi wykazały, że 5 min po wstrzyknięciu dożylnie 106 CFU bakterii, w krwiobiegu krążyło średnio 1,5 x 105 CFU/ml (Rycina 1A). Po 6 h średnia liczba wyniosła 4,8 x 104 CFU/ml. Po 24 h średnie wartości wyniosły 2,4 x 104 CFU/ml, jednak w tej grupie 10 myszy u 5 nie wykryto krążących bakterii, podczas gdy u pozostałych 5 odnotowano stosunkowo wysokie wartości (Rycina 1A). Liczba CFU pobrana z próbek skóry wykazała, że u większości myszy wystąpiły znaczne wartości w ludzkiej skórze, średnio 2,1 x 104 CFU/mg tkanki w 6 h i 4,4 x 102 CFU/mg tkanki w 24 h (Rycina 1B). Próbki skóry mysiej z przeciwległej strony nie wykazały obecności bakterii w 24 h i jedynie bardzo niską liczbę w 6 h, co demonstruje silną preferencję N. meningitidis do naczyń ludzkich w przeszczepionej skórze (Rycina 1B). Ogólnie liczba bakterii była bardzo niska lub niewykrywalna w innych pobranych organach, choć u 2 zwierząt odnotowano wartości, które można przypisać kontaminacji z krwi, ponieważ korelowały one z wysoką liczbą bakterii krążących (Rycina 1C). Model ten może być również wykorzystany do określenia roli czynników wirulencji in vivo, na przykład pili typu IV. Do modelu wprowadzono szczepy bakteryjne z określonymi mutacjami w genie pilD21, skutkującymi brakiem Tfp, a także w genie pilC18, skutkującymi brakiem proponowanej „adhezyny” Tfp. Mutacje te doprowadziły do braku adhezji bakteryjnej w ludzkim przeszczepie skóry, co potwierdza kluczową rolę, jaką Tfp odgrywa w adhezji in vivo (Rycina 1D).
Immunohistochemia/Histologia
W tych eksperymentach wykorzystano szczepy N. meningitidis wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), co umożliwiło detekcję fluorescencyjną bez konieczności stosowania barwienia wtórnego. Naczynia ludzkie barwiono przy użyciu markera śródbłonka ludzkiego, albo CD31 (PECAM-1), albo lektyny Ulex europaeus agglutinin (UEA)18,22. UEA była sprzężona z rodamyną, co pozwoliło na barwienie jednoetapowe (Rycina 2A-C). Jądra komórkowe można barwić DAPI, aby ułatwić identyfikację struktur tkankowych (Rycina 2A-B). Badanie histologiczne przeprowadzono przy użyciu standardowego barwienia hematoksyliną i eozyną. Granica naskórka i skóry właściwej była wyraźnie identyfikowalna. Stan zapalny, zakrzepica i przeciek naczyniowy koncentrowały się w naczyniach blisko tej granicy 24 h po infekcji (Rycina 2D). Zakrzepicę zaobserwowano w kilku małych naczyniach skóry właściwej, często towarzyszyły jej przekrwienie i stan zapalny. Widoczny był wyciek erytrocytów do tkanek, co wskazywało na znaczny stopień uszkodzenia naczyń. Histopatologia przeszczepionej skóry u myszy niezinfekowanych wyglądała prawidłowo, bez widocznego stanu zapalnego18. W około 30% infekcji adhezja bakteryjna w skórze prowadzi do rozwoju makroskopowo wykrywalnej purpury (Rycina 2E oraz 2F).
<img alt="Analiza wzrostu bakterii; liczba CFU; wykres porównawczy; badanie infekcji; modele ludzkie i mysie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Liczby CFU. (A) Liczba CFU bakterii na ml krwi w 5 min, 6 h i 24 h po infekcji. (B) Liczba CFU bakterii w próbkach skóry z porównaniem skóry ludzkiej (HS) i skóry mysiej (MS) w 6 h i 24 h po infekcji. (C) Liczba CFU bakterii w innych narządach pobranych 24 h po infekcji. (D) Porównanie liczby CFU bakterii w próbkach skóry ludzkiej i mysiej pobranych 24 h po infekcji od myszy zakażonych szczepem dzikim N. meningitidis 2C43 (WT), szczepem z mutacją w genie pilD (pilD) lub szczepem z mutacją w genie pilC1 (pilC1). Wszystkie wykresy przedstawiają surowe dane wraz z medianą. Rycina zmodyfikowana z Melicanet al.18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; rozkład komórkowy; biopsja tkankowa; analiza histologiczna; paski skali." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mikroskopia. (A) Projekcja stosu konfokalnego przedstawiająca ludzkie mikonnaczynie barwione lektyną UEA (czerwony) w pobliżu granicy skóry właściwej (d) i naskórka (e). Naczynie jest zainfekowane N. meningitidis (zielony) 2 hr po infekcji. (B) Przekrój optyczny i projekcja przekroju (C) pokazujące mikrokolonie N. meningitidis (zielony) infekujące ludzkie naczynie (UEA – czerwony) w przeszczepie skóry 2 hr po infekcji. (D) Barwienie hematoksyliną i eozyną ludzkiego przeszczepu skóry zainfekowanego N. meningitidis przez 24 hr. Granica naskórka (e) i skóry właściwej (d) jest wyraźnie widoczna, a w skórze właściwej obserwuje się rozległą zakrzepicę i przekrwienie mikonnaczyń (strzałki). Można również zidentyfikować stan zapalny i pewne przecieki naczyniowe (grot strzałki). (E) Ludzki przeszczep skóry przed infekcją. (F) Ten sam przeszczep skóry co w (E) 24 hr po infekcji N. meningitidis, wykazujący obszary purpurowe (strzałki). Ryciny 2B, 2D, 2E, oraz 2F zostały zmodyfikowane z pracy Melican et al.18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz</a>.

Neisseria meningitidis to specyficzny dla człowieka patogen, który infekuje naczynia krwionośne. W tym protokole ludzkie mikronaczynia są wprowadzane do myszy poprzez przeszczepienie ludzkiej skóry myszom z obniżoną odpornością. Bakterie w dużym stopniu przylegają do ludzkich naczyń, prowadząc do uszkodzenia naczyń krwionośnych i rozwoju wysypki plamistej zwykle obserwowanej u ludzi.

Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie mechanizmów, za pomocą których bakterie *Neisseria meningitidis* zakażają ludzkie naczynia krwionośne in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przeszczepienie ludzkiej skóry myszy z niedoborem odporności, co wprowadza ludzkie naczynia krwionośne skóry właściwej. W drugim kroku humanizowane myszy są zakażane bakteriami.Następnie pozwala się na przebieg infekcji przez określony przedział czasu. W ostatnim kroku pobiera się próbki krwi i tkanek w celu oceny wyniku infekcji. Ostatecznie, do badania postępu infekcji w naczyniach ludzkich wykorzystuje się kombinację histologii, immunofluorescencji oraz analizy krwi i tkanek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modele hodowli komórkowych czy modele zwierzęce, jest możliwość po raz pierwszy zaobserwowania typowej patologii klinicznej występującej podczas tych infekcji. Jak najszybciej po pobraniu oczyszczono powierzchnię skóry ludzkiej 70% etanolem, a następnie rozłożono ją płasko na dobrze czystej powierzchni, najlepiej pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, używając dermatomu z zaprogramowaną grubością, wycięto plastry o grubości od 200 do 400 mikrometrów z górnej warstwy skóry.Sprawdź integralność plastrów, a następnie przytnij je do kwadratów o wymiarach dwa na dwa centymetry. Umieść kwadraty w PBS, a następnie oczyść 70% ethanolem obszar wygolony u chirurgicznie przygotowanej, znieczulonej myszy beige z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Po zastosowaniu znieczulenia miejscowego w miejscu przeszczepu, użyj zakrzywionych nożyczek, aby ostrożnie usunąć powierzchowną warstwę skóry myszy z obszaru nieco mniejszego niż fragmenty przeszczepu, dbając o to, by nie uszkodzić naczyni krwionośnych tkanki podskórnej.Działając szybko, aby zapobiec wysychaniu przeszczepu, należy położyć jeden z plastrów ludzkiej skóry na łożysku przeszczepu, upewniając się, że strona naskórkowa jest skierowana do góry. Wyrównaj krawędź tkanki i utrwal ją za pomocą kleju tkankowego. Następnie ostrożnie dopasuj pozostałą część ludzkiej skóry do łożyska przeszczepu, nakładając niewielkie ilości kleju tkankowego wokół każdej krawędzi.Zawsze przycinaj skórę ludzką do odpowiedniego rozmiaru, zamiast powiększać łoże przeszczepu. Po potwierdzeniu, że każdy narożnik jest przymocowany, oczyść obszar roztworem jodu i nałóż plaster mocno, ale nie zbyt ściśle, stroną amortyzującą na przeszczep, dbając o to, aby nie utrudniać oddychania zwierzęciu, następnie przymocuj plaster taśmą opatrunkową i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej powierzchni. Po przebudzeniu przenieś zwierzę z powrotem do klatki, aż do momentu, gdy w ramach iniekcji bakteryjnej zostanie przeniesiona nocna kultura na płytce do kultury płynnej.W poranek dnia infekcji, gdy bakterie osiągną pożądaną koncentrację, rozcieńcz komórki do stężenia 1×10⁷ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie po podaniu znieczulenia, potwierdź sedację przeszczepionych myszy za pomocą odruchu szczypania palca i umieść zwierzęta na podgrzewaczu.Nanieś maść do oczu na oczy zwierzęcia, a następnie wstrzyknij każdemu myszy dojszyznowo (ip) osiem miligramów ludzkiej transferyny w soli fizjologicznej. Następnie u każdego zwierzęcia odetnij koncówkę ogona i nanieś małą kroplę krwi z ogona na płytkę z agarem, aby potwierdzić sterylność krwi przed zakażeniem.Następnie wstrzyknij dożylnie 100 µL kultury bakteryjnej poprzez iniekcję zaoczodołową. Po kilku minutach ponownie utnij koniec ogona i przenieś tę próbkę krwi na świeże płytki agarowe. Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie we krwi bezpośrednio po infekcji, zabezpiecz ogon klejem tkankowym, a następnie rozcieńcz inokulum bakteryjne i wysiej je na płytki agarowe z odpowiednimi antybiotykami.Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie w szczepionce sześć godzin po zakażeniu, pobierz kolejną niewielką ilość krwi z ogona każdej myszy, a następnie rozcieńcz i wysiej krople krwi w sposób zaprezentowany przed chwilą, aby ustalić liczbę jednostek tworzących kolonie po sześciu godzinach. Następnie inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez noc, aby przeprowadzić obliczenie jednostek tworzących kolonie w narządach zakażonych zwierząt.Rozpocznij od wykonania nacięcia w linii pośrodkowej u każdej uśpionej myszy. Następnie, w przypadku każdego zwierzęcia, przetnij żebro i wykonaj nacięcie w sercu. Za pomocą sterylnej strzykawki pobierz jak największą ilość krwi z serca i jam klatki piersiowej, a następnie przelej ją do oddzielnych sterylnych probówek dla każdej próbki.Następnie należy usunąć interesujące nas organy, a potem przenieść przeszczepy skóry wraz z towarzyszącymi fragmentami skóry mysiej na jedną sterylną płytkę dla każdego zwierzęcia. Pozostawić pobraną krew do skrzepnięcia na 15 minut, a następnie odwirować. Następnie należy oddzielić osocze od krwi i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy.Następnie zważ probówki do homogenizacji zawierające po 500 µL PBS. Potem, używając sterylnego wycinaka do biopsji, pobierz próbki biopsji o średnicy 4 mm z każdej wypreparowanej tkanki. Umieść biopsje pojedynczo w probówkach do homogenizacji, dodając jedną kuleczkę o średnicy 2 mm do każdej probówki zawierającej próbkę skóry.Pozostałe tkanki należy przechowywać w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do badań mikroskopowych, a probówki do homogenizacji zważyć w celu ustalenia masy biopsjatu. Następnie homogenizować próbki przy 6 000 RPM przez 30 sekund, powtarzając homogenizację skóry aż do uzyskania mętnego homogenatu. Na koniec rozsiać zawiesiny komórkowe z każdej probówki na świeże płytki agarowe i inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.Aby ustalić liczbę jednostek tworzących kolonie w organach w tych reprezentatywnych wynikach, wykorzystano szczep N. meningitis serogrupy C wykazujący ekspresję GFP.Morfologia krwi wykazała, że pięć minut po dożylnym wstrzyknięciu 1 × 10⁶ jednostek tworzących kolonie bakterii, w krwi krążyło średnio 1,5 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Po sześciu godzinach średnia liczba wyniosła 4,8 × 10⁴ jednostek tworzących kolonie na mililitr, a po 24 godzinach średnie wartości wynosiły 2,4 × 10⁴ jednostek tworzących kolonie na mililitr.Jednak w tej grupie 10 myszy u pięciu z nich nie wykryto krążących bakterii, podczas gdy u pozostałych pięciu odnotowano stosunkowo wysoką liczbę. Słupki na tych wykresach przedstawiają wartości mediany dla każdej grupy w odniesieniu do liczby CFU pobranych ze skóry. Próbki wskazują, że większość myszy posiadała znaczną liczbę bakterii w ludzkiej skórze, średnio 2,1 × 10⁴ CFU na mg tkanki po 6 godzinach i 4,4 × 10² CFU na mg tkanki po 24 godzinach.Przeciwległe próbki skóry mysiej nie wykazały obecności bakterii po 24 godzinach, a po sześciu godzinach stwierdzono jedynie bardzo niską liczbę bakterii, co dowodzi silnego powinowactwa endomeningita do ludzkich naczyń w przeszczepionej tkance. Ogólnie rzecz biorąc, liczby bakterii w pozostałych pobranych organach były bardzo niskie lub niewykrywalne, choć u dwóch zwierząt odnotowano ich obecność, co może być skorelowane z wysoką liczbą krążących bakterii. Model ten może być również wykorzystany do określenia roli czynników wirulencji in vivo.Na przykład w tym eksperymencie wykorzystano szczepy bakteryjne pozbawione funkcjonalnych pilli typu czwartego; myszy zakażone tymi szczepami mutantami nie wykazywały adhezji bakteryjnej w przeszczepach ludzkiej skóry, co potwierdza kluczową rolę, jaką pilli typu czwartego odgrywają w adhezji in vivo. Na tych obrazach konfokalnych przeszczepu skóry, wykonanych dwie godziny po zakażeniu, można zaobserwować ludzkie naczynia zabarwione lektyną UEA sprzężoną z rodamyną. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest wyraźnie widoczna, a zakażające, GFP-dodatnie meningokoki można wyraźnie zaobserwować w obrębie naczyń.Ten fragment ludzkiej skóry barwiony H&amp;E wykazuje stan zapalny i przecieki naczyniowe, a także zakrzepicę skoncentrowaną w naczyniach blisko granicy naskórkowo-skórnej. 24 godziny po infekcji, w około 30% przypadków zakażeń, adhezja bakterii w skórze doprowadziła do rozwoju makroskopowo wykrywalnej purpury. Zatem opracowanie tej techniki otwiera drogę badaczom zajmującym się interakcjami między patogenem a gospodarzem do badania mechanizmów choroby w kontekście ludzkich naczyń.

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model myszy do badań nad infekcjami bakteryjnymi ukierunkowanymi na mikrokrążenie

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Ten film demonstruje obrazowanie in vivo w celu zbadania dynamiki rekrutacji neutrofili w miejscu infekcji u transgenicznej myszy z obniżoną odpornością, z neutrofilami wykazującymi ekspresję GFP. Polega na wstrzyknięciu bakterii luminescencyjnych w celu wywołania infekcji. Prowadzi to do rekrutacji neutrofili do miejsca infekcji, których śledzenie odbywa się za pomocą obrazowania.

Monitorowanie dynamiki rekrutacji neutrofili i obciążenia bakteryjnego w miejscu zakażenia w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę generowania mysiego modelu infekcji ran skóry. Po zakażeniu myszy – zmodyfikowanych do ekspresji białka fluorescencyjnego w neutrofilach – genetycznie zmodyfikowanym bioluminescencyjnym Staphylococcus aureus – bakterią chorobotwórcze. Obciążenie bakteryjne w miejscu zakażenia i dynamikę rekrutacji neutrofili można badać za pomocą obrazowania całego zwierzęcia.

Model zakażenia rany skóry myszy do badania odpowiedzi immunologicznej na patogen bakteryjny

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Opisano podejście do wykrywania w czasie rzeczywistym wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia skórne i zakażenie Staphylococcus aureus u myszy. Porównując myszy LysM-EGFP (które posiadają fluorescencyjne neutrofile) z krzyżówką LysM-EGFP szczepu myszy z niedoborem odporności, pogłębiamy naszą wiedzę na temat infekcji i rozwijamy podejścia do zwalczania infekcji.

Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Poznaj mechanizmy infekcji Neisseria meningitidis w ludzkich naczyniach krwionośnych za pomocą humanizowanego modelu myszy z przeszczepioną skórą. Ta metoda umożliwia obserwację patologii klinicznej zakażenia meningokokowego in vivo.

Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Przeglądaj więcej filmów