Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii, takie jak rozmiar, kształt i zmiany konformacyjne biomolekuł i ich kompleksów. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksperymenty można przeprowadzać w fizjologicznie odpowiednich warunkach buforowych w środowisku, w którym biomolekuły są stabilne. SAXS jest techniką uzupełniającą wiele innych metod biofizycznych i biologii strukturalnej.

Połączenie SAXS z tymi metodami może nam pomóc w opracowaniu terapii opartej na strukturze. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kompleksy biomolekularne, może być również stosowana w innych systemach, takich jak badanie nanocząstek i versykulacji dostarczania leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wydaje się, że jest to przytłaczający i skomplikowany proces, polegający na przejściu od surowych danych rozpraszających do struktur o niskiej rozdzielczości.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ proces analizy danych w celu uzyskania modeli strukturalnych z surowych danych jest trudny do nauczenia, ponieważ wymaga użycia wielu różnych pakietów oprogramowania. Istnieje kilka pakietów oprogramowania, które są przydatne do analizy danych SAXS. Należą do nich SCATTER, BioXTAS RAW i pakiet ATSAS.

W tym filmie przedstawimy przegląd ogólnych kroków, które należy wykonać podczas analizowania surowych danych SAXS przy użyciu pakietu programów ATSAS. Aby rozpocząć, zainstaluj i załaduj pakiet programów ATSAS. Otwórz program PRIMUS/Qt i przejdź do opcji Otwórz menu.

Tutaj wybierz do 13 interesujących Cię plików danych. Pliki danych muszą być w formacie ASCII, w którym pierwsza kolumna to oś wektora s, a druga kolumna to intensywność. Powtórz ten krok dla danych tylko bufora, wstawiając te dane do drugiego menu Narzędzia.

Następnie przejdź do okna Przetwarzanie danych i wybierz opcję Odejmij. Spowoduje to wygenerowanie odjętej krzywej rozpraszania, reprezentującej tylko rozpraszanie od interesującej makrocząsteczki. Aby przeprowadzić analizę Guiniera, zacznij od krzywej rozproszenia odjętej od bufora załadowanej do PRIMUS/Qt.

Następnie kliknij na Radius of Gyration, co otworzy się Primus Guinier Wizard. W tym momencie zostanie wyświetlony wykres przedstawiający logarytm naturalny kątów intensywności w funkcji rozproszenia do kwadratu. Aby uzyskać wstępny promień bezwładności, znajdź okno wiersza polecenia i użyj funkcji Autorg.

Po naciśnięciu przycisku Autorg kliknij górny limit w górę, a następnie w dół, aby wymusić aktualizację pomiarów statystycznych. Możesz też wprowadzić wiele plików jednocześnie, klikając ten sam monit o otwarcie i wybierając nazwy wielu plików danych, podświetlając je w taki sam sposób, jak opisano wcześniej. Aby rozpocząć analizę Kratky, kliknij, aby wybrać nazwę pliku danych.

Spowoduje to wykreślenie danych w oknie. A następnie wybierz opcję Działka. Następnie, poniżej przycisku Działka, kliknij Kratky Plot.

W rezultacie, białka kuliste wykazują pik GALC-ean, podczas gdy niesfałdowane białka będą wykazywać plateau zamiast piku i będą przypominać wykres hiperboliczny, taki jak ten pokazany tutaj. Ponownie załaduj dane odjęte przez bufor dla każdego stężenia w PRIMUS/Qt. Na karcie Przetwarzanie kliknij opcję Skala i sprawdź każdą krzywą oraz liczbę i-scale, która odpowiada rozcieńczeniom wykonanym z oryginalnej próbki.

Po sprawdzeniu scal dane, klikając przycisk Scal w oknie Przetwarzanie. Aby wygenerować wykres rozkładu odległości, załaduj scalone krzywe danych do PRIMUS/Qt, a następnie kliknij przycisk Rozkład odległości na karcie Analiza. Dostosuj zakres scalonych danych, aby uniknąć znacznego szumu na końcu nieprzetworzonych danych.

Pomiń również punkty danych w pobliżu przystanku wiązki w obszarze low-q, wybierając dolną wartość zakresu i zwiększając liczbę. Aby wyznaczyć wartość Dmax, należy rozpocząć od zakresu pięciokrotności promienia bezwładności uzyskanego z analizy Guiniera. Następnie stopniowo zmniejszaj tę wartość, aż wykres rozkładu odległości nie spadnie nagle do zera na osi y i nie będzie miał długiego ogona przed zbliżeniem się do zera.

Sprawdzić, czy eksperymentalny promień bezwładności w funkcji intensywności, który jest uzyskany na podstawie przybliżenia Guiniera, oraz promień rozkładu odległości liczb bezwładności w funkcji intensywności są podobne. Tutaj intensywność rozproszonego światła jest pokazana na wykresie w stosunku do kąta rozpraszania, co sugeruje zarówno jakość biomolekuł nidogen-1, lamininy gamma-1 i ich kompleksu, jak i ich kształt. Rozkład odległości par elektronów określony na podstawie danych rozpraszania sugeruje, że biomolekuły mają wydłużony kształt, a wykres Kratky'ego sugeruje, że białka są w stanie pofałdowanym, ponieważ dane mają tendencję do plateau, a nawet wzrostu w większym zakresie q i nie mają kształtu krzywej dzwonowej.

Ponadto wykresy Guiniera, które wykorzystują dane przy niskim kącie rozpraszania, wskazują obszar liniowy do wyznaczenia promienia bezwładności, który jest pokazany tutaj dla nidogenu-1, lamininy gamma-1 i ich kompleksu. Do badania kompleksów białko-białko wykorzystano projekt MONSA w celu uzyskania struktury o niskiej rozdzielczości całego kompleksu gamma-1 lamininy-1, co sugeruje, że tylko region C-końcowy obu białek uczestniczy w interakcjach pośredniczących, podczas gdy reszta domen jest od siebie oddalona. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem synchrotronowym może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności i bezpieczeństwo określone przez każdą inną linię badawczą powinny być zawsze podejmowane podczas wstępnego zbierania danych.