Name: Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę SAXS do badania struktur makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem pakietu ATSAS. Technika ta pozwala analizować kształt i konformację białek w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został wsparty przez NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) oraz Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) granty przyznane M.O. TRP jest kanadyjskim kierownikiem badań w dziedzinie biofizyki RNA i białek (201704) i potwierdza grant NSERC Discovery (RGPIN-2017-04003). TM jest finansowany z grantu NSERC Discovery dla TRP.

1. Przygotowanie próbki SAXS i akwizycja danych
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki:
	<ol>
		<li>Eksperymenty SAXS wymagają jednorodnych, stabilnych i nieagregujących próbek białek; przed zebraniem danych należy obserwować stabilność i stan oligomeryczny za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (S), DLS i/lub AUC.</li>
		<li>Próbki poddane analizie (w tym przypadku nidogen-1 i laminina γ-1) analizie DLS i tricine SDS-PAGE w celu wizualizacji czystości próbki10. 
		UWAGA: Próbki mogą obejmować zakres stężeń (1-4 mg / ml) w zależności od ich wielkości, zachowania roztworu, takiego jak samoasocjacja i agregacja wraz ze stabilnością; tutaj przygotowano pięć stężeń nidogenu-1 (139 kDa), trzy laminy γ-1 (109 kDa) i cztery oczyszczonego z S kompleksu równomolowego, jak opisano wcześniej10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych:
	<ol>
		<li>Zbieraj dane SAXS za pomocą własnego systemu lub synchrotronu, zgodnie z wytycznymi producenta lub zakładu. 
		UWAGA: Dane wykorzystane w tej pracy zostały zebrane za pomocą wewnętrznego systemu (patrz Tabela materiałów), który zawiera 3-otworkową kamerę wyposażoną w uszczelnioną tubę mikrofokusową + 002 (promieniowanie Cu Kα przy 1,54 A) i optykę konfokalną Max-Flux (CMF) działającą z mocą 40 W. System wyposażony jest również w wieloprzewodowy detektor 2D o długości fali 200 nm do zbierania danych. Jednak dzięki dostępności nowoczesnych synchrotronów we Francji, Niemczech, Wielkiej Brytanii, USA i innych krajach, które zapewniają dostęp do zestawu S-SAXS ułatwiającego oddzielenie monorozproszonego preparatu od możliwej agregacji/degradacji, obecnie rutynowo zbieramy dane w obiektach synchrotronowych. Niedawno opublikowany artykuł na temat DNA G-quadruplex11 jest przykładem strategii zbierania danych S-SAXS. W tym przypadku dane SAXS zebrano w zakresie 0,08 ≤ q ≤ 0,26 A przez 3 godziny dla nidogenu-1 (2,0, 2,5, 3,0, 3,5 i 4,0 mg/ml); laminina γ-1 (1,5, 2,0 i 2,5 mg/ml) i ich kompleks (0,8, 1,0, 1,25 i 1,5 mg/ml).</li>
		<li>Zmniejsz ilość danych dla bufora i próbek za pomocą oprogramowania do przetwarzania specyficznego dla systemu. Odejmij wkład bufora od danych białkowych za pomocą programu takiego jak PRIMUS/qt12 (Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza danych
UWAGA: Obecnie istnieje kilka pakietów oprogramowania, które są przydatne do analizy danych SAXS: ScÅtter43 (do pobrania dostępny na www.bioisis.net), bioXtas RAW44, oraz ATSAS suite13. W tej sekcji omówiono ogólne czynności, które należy wykonać podczas analizowania surowych danych SAXS przy użyciu pakietu programów ATSAS, a konkretne kroki wykonano z pliku ATSAS 2.8.1 do pobrania. Można korzystać z innych programów, które zostaną pokrótce omówione później.
<ol>
	<li>Odejmowanie bufora 
	UWAGA: Te kroki dotyczą tylko statycznych próbek SAXS.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję menu "OTWÓRZ" w PRIMUS/qt i wybierz interesujące Cię pliki danych. Należy pamiętać, że pliki danych muszą być w formacie ASCII, w którym pierwsza kolumna to oś wektora s, a druga kolumna to intensywność. Powtórz ten krok dla danych zebranych dla samego bufora, wstawiając te dane do tego samego menu.</li>
		<li>Wybierz "ODEJMIJ" w oknie Przetwarzanie danych, co spowoduje wygenerowanie odjętej krzywej rozpraszania reprezentującej tylko rozpraszanie od interesującej makrocząsteczki. Powtórz ten krok dla każdego stężenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Guiniera
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić analizę Guiniera, załaduj krzywą rozproszenia odjętą przez bufor do PRIMUS/qt, jak opisano wcześniej w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Kliknij "Promień bezwładności", aby przejść do otwarcia kreatora Primus Guinier; zostanie wyświetlony wykres ln(I) vs q2.</li>
		<li>Aby uzyskać wstępny Rg użyj funkcji "AUTORG", która jest zewnętrznym modułem wbudowanym w PRIMUS/qt. Znajdź przycisk "Autorg" i kliknij go.</li>
		<li>Wprowadź wiele plików jednocześnie, podświetlając je wszystkie i wstawiając je do menu po prawej stronie, bardzo podobnie jak w 2.1.1.</li>
		<li>Użyj utworzonego wcześniej wykresu Guiniera, aby ocenić jakość danych; zielona linia pod wykresem Guiniera pokazuje wykres reszt reprezentujący liniowość dopasowania. Należy pamiętać, że nieliniowość w analizie Guiniera może być oznaką agregacji próbki i w tym przypadku nie należy przeprowadzać dalszej analizy. 
		UWAGA: Liniowe dopasowanie Guiniera daje Rg z małym błędem (<5%) i sugeruje próbkę wysokiej jakości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Kratky
	<ol>
		<li>Załaduj dane do wizualizacji w podobny sposób, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Kliknij "ZAZNACZ POLE" obok nazwy pliku danych. Spowoduje to wykreślenie danych w osobnym oknie.</li>
		<li>Kliknij przycisk "DZIAŁKA", a następnie wybierz "Kartky Działka" w menu rozwijanym.</li>
		<li>Spowoduje to wykreślenie danych jako "q2 x L(q) vs q". Należy pamiętać, że białka kuliste wykazują pik Gaussa, podczas gdy białka niesfałdowane będą wyświetlać plateau zamiast piku i przypominać wykres hiperboliczny17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scalanie danych
	<ol>
		<li>Załaduj ponownie odjęte dane buforowe dla każdego stężenia w PRIMUS/qt, jak w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Aby scalić dane, wystarczy kliknąć przycisk "SCAL" w oknie przetwarzania.</li>
		<li>Sprawdź każdą krzywą i liczbę w skali I, która odpowiada rozcieńczeniom wykonanym z oryginalnej próbki. 
		UWAGA: Próbki o wyższym stężeniu wykazują mniej szumów w obszarze ogona krzywych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dystrybucja P(r)
	<ol>
		<li>Aby wygenerować wykres P(r), załaduj scalone krzywe danych do PRIMUS/qt, jak opisano wcześniej.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Rozkład odległości", aby otworzyć nowe okno prezentujące połączone dane dotyczące natężenia światła rozproszonego w funkcji q i wykresu funkcji rozkładu para-odległość po prawej stronie. 
		UWAGA: Informacje po prawej stronie przedstawiają ogólną jakość obliczeń funkcji rozkładu par i odległości.</li>
		<li>Dostosuj zakres scalonych danych, aby uniknąć znacznego szumu na końcu nieprzetworzonych danych.</li>
		<li>Pomiń punkty danych w pobliżu przystanku wiązki w obszarze niskiego q.</li>
		<li>Aby określić Dmax, zacznij od zakresu ~5-krotności Rg uzyskanego z analizy Guiniera. Stopniowo zmniejszaj tę wartość, aż wykres P(r) nie spadnie nagle do zera na osi Y i nie będzie miał długiego ogona przed zbliżeniem się do zera.</li>
		<li>Sprawdź, czy eksperymentalne liczby Rg/I0 (pochodzące z przybliżenia Guiniera) i P(r) Rg/I0 są podobne. 
		UWAGA: W niektórych przypadkach wymagana jest również dalsza manipulacja zakresem danych, punktami danych i ALPHA (parametr regularyzacji, który informuje program o stosunku uwagi poświęconej gładkości rozkładu w porównaniu z dopasowaniem danych eksperymentalnych) 21 w celu uzyskania dobrej jakości wykresu P(r).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Modelowanie i uśrednianie ściegówinicjacyjnych A b
<ol>
	<li>Po połączeniu danych zebranych w wielu stężeniach lub zminimalizowaniu danych zebranych za pomocą S-SAXS oraz zweryfikowaniu wykresu Kratky'ego, wykresu P(r) i analizy Guiniera należy obliczyć niskorozdzielcze struktury makrocząsteczek i ich kompleksów. Ten potok może być używany do badania struktur roztworów i interakcji kwasów nukleinowych, białek i kompleksów kwasów nukleinowych-białko lub białko-białko10,11,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Jednym z najpopularniejszych programów jest DAMMIN, opracowany przez Svergun35 i będący częścią pakietu ATSAS13, który wykorzystuje symulowane protokoły wyżarzania ze wstępnymi informacjami wejściowymi na temat Rg i Dmax. Podejścia i zasady modelowania ab initio są szczegółowo opisane w innym miejscu18,36.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Krytyczne etapy analizy danych SAXS opisane w sekcji protokołu tego artykułu obejmują odejmowanie bufora, analizę Guiniera, analizę Kratky'ego, scalanie danych i dystrybucję P(r). Modelowanie ab initio ściegu jest zbyt obszerne, aby można je było tutaj szczegółowo omówić, dlatego jest omówione tylko pokrótce.
W synchrotronach (np. DESY w Niemczech, DIAMOND w Wielkiej Brytanii i ESRF we Francji) możliwe jest zbieranie danych SAXS dla bardzo małego ułamka (~kilka μL) każdej próbki, ponieważ frakcje są eluowane z kolumny s, która jest podłączona w linii (patrz rysunek 1). Elastycznie rozproszone dane SAXS są uśredniane radialnie przy użyciu pakietów dostarczonych przez producenta przyrządu lub przez synchrotron, zanim będzie można odjąć bufor. Otrzymane dane 1D reprezentują ilość rozproszonego światła (In I(q)) na osi Y i kącie rozpraszania (q=4πsinθ/λ, gdzie λ jest długością fali padającego promieniowania rentgenowskiego) i są przedstawione na rysunku 1. Program PRIMUS/qt12 służy do bezpośredniego odejmowania tła ze względu na bufor i jest opisany w rozdziale 1.1. Inne programy, takie jak; ScÅtter43 (do pobrania dostępny pod adresem www.bioisis.net) z samouczkiem dostępnym pod adresem https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, oraz bioXtas RAW44 (dostępny pod adresem https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) mogą być wykorzystywane jako alternatywa dla pakietu ATSAS.
Analiza Guiniera dostarcza informacji na temat agregacji i jednorodności próbki, a także dostarcza promienia bezwładności (Rg) dla makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w oparciu o dane SAXS z obszaru niskiego s 14. Wykres jest konstruowany za pomocą PRIMUS/qt dla danych SAXS uzyskanych z każdego stężenia, a następnie dopasowuje się krzywą z maksymalnym zakresem do 1,30 dla q x Rg. Monorozproszone przygotowanie próbki powinno dać liniowy wykres Guiniera w tym obszarze (rysunek 2D), podczas gdy agregacja daje nieliniowy wykres Guiniera15,16. Jeśli analiza Guiniera jest liniowa, stopień "rozwinięcia" interesującej makrocząsteczki można zaobserwować za pomocą wykresu Kratky'ego, który jest przydatny przy podejmowaniu decyzji, czy wykonać modelowanie ciała sztywnego, czy skonstruować zespoły modeli o niskiej rozdzielczości. Białko kuliste pojawi się na wykresie Kratky'ego jako mające krzywą w kształcie dzwonu, podczas gdy rozszerzone cząsteczki lub niesfałdowane peptydy będą wydawać się stabilizować lub nawet zwiększać w większym zakresie q i nie będą miały kształtu dzwonu (ryc. 2C).
Uzyskanie Rg z analizy Guiniera uwzględnia tylko punkty danych z obszaru niskiego q wykresu punktowego 1D (rysunek 2D), jednak możliwe jest użycie prawie całego zestawu danych do wykonania pośredniej transformacji Fouriera w celu przekształcenia informacji o przestrzeni odwrotnej ln(I(q)) w porównaniu z (q) na funkcję rozkładu odległości w przestrzeni rzeczywistej (P(r)), która dostarcza informacji o D max i Rg (Rysunek 2B) Kształt wykresu P(r) przedstawia konformację całkowitą roztworu makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania18,19. Konwersja danych z przestrzeni wzajemnej na dane w przestrzeni rzeczywistej jest krytycznym krokiem, ale szczegółowy opis nie wchodzi w zakres tego artykułu. Dlatego zapoznaj się z artykułem Svergun20, aby zrozumieć każdy parametr.
Po przetworzeniu danych odjętych przez bufor w poszczególnych stężeniach za pomocą analizy Guiniera ze stałą wartością Rg, a następnie zbadaniu ich wzorca fałdowania za pomocą analizy Kratky'ego, dane te można połączyć. Połączone dane dla nidogenu-1, lamininy γ-1 i ich kompleksu zostały przetworzone w sposób opisany powyżej, a wynikowe wykresy P(r) przedstawiono na rysunku 2B. Idealnie byłoby, gdyby należało również obliczyć funkcję rozkładu par odległości P(r) dla każdego stężenia, aby określić, czy dane SAXS zebrane dla każdego stężenia zapewniają podobne wartości Rg i Dmax . Jeśli Rg i Dmax pozostają podobne w szerokim zakresie stężeń, użytkownik powinien kontynuować. Należy zauważyć, że w zależności od sygnału, dane mogą zostać obcięte przed scaleniem danych. Dzieje się tak często, gdy stężenia i/lub masa cząsteczkowa badanych makrocząsteczek są niskie.
Analiza kształtu w niskiej rozdzielczości za pomocą DAMMIN może być wykonywana w różnych trybach (np. Szybki, Wolny, Ekspert itp.). Tryb szybki jest idealnym pierwszym krokiem do oceny, czy wykres P(r) zapewnia modele dobrej jakości. Zazwyczaj należy uzyskać co najmniej 10 modeli dla każdego wykresu P(r), aby sprawdzić, czy uzyskuje się powtarzalne wyniki pod względem struktury o niskiej rozdzielczości, z parametrem niskiej dobroci dopasowania zwanym χ (wartość 0,5-1,0 jest uważana za dobrą na podstawie naszych obszernych prac), wartością opisującą zgodność między eksperymentalnie zebranymi danymi SAXS a danymi pochodzącymi z modelu. Na potrzeby publikacji zazwyczaj używamy trybu Slow lub Expert i obliczamy co najmniej 15 modeli. Oprócz DAMMINA alternatywą jest również jego szybsza wersja, DAMMIF37, a także GASBOR38. Ponadto do badania kompleksów białko-białko lub białko-kwas nukleinowy możliwe jest wykorzystanie programu MONSA35, który umożliwia jednoczesne dopasowanie poszczególnych danych SAXS zarówno dla makrocząsteczek, jak i ich kompleksu. Aby uzyskać więcej informacji na temat obliczeń modelu o wysokiej rozdzielczości, a także w badaniach interakcji RNA-białko, zapoznaj się z niedawnym artykułem Patela i wsp.3.
SAXS jest teoretycznie prostą, ale niewątpliwie wysoce komplementarną metodą w stosunku do innych narzędzi biologii strukturalnej i daje w rezultacie dane strukturalne o niskiej rozdzielczości, które mogą być wykorzystywane samodzielnie lub w połączeniu z technikami o wysokiej rozdzielczości do wyjaśnienia informacji o strukturze i dynamice makromolekularnej. Tak długo, jak można uzyskać monodyspersyjny preparat makrocząsteczek i ich kompleksów, SAXS może być wykorzystywany do badania struktury w roztworze i interakcji dowolnego typu makrocząsteczek biologicznych. W przypadku omawianego tutaj kompleksu godne uwagi jest to, że mniej niż 10% całkowitej dostępnej powierzchni azotu-1 i lamininy γ-1 jest zakopane w tym kompleksie, podczas gdy reszta domen obu białek jest swobodnie dostępna do interakcji z innymi białkami w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby zachować jej sztywność strukturalną (ryc. 3). Uzyskanie takich informacji dla kompleksu o wartości ~240 kDa byłoby bardzo trudne przy użyciu innych technik biologii strukturalnej, takich jak krystalografia rentgenowska, NMR i mikroskopia kriogeniczna.
Odkrywanie struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub NMR jest z natury czasochłonnym procesem. To wąskie gardło w określaniu struktury jest jednym z obszarów, w którym SAXS pokazuje swoją siłę jako technika konstrukcyjna; Akwizycja danych dla pojedynczego eksperymentu SAXS może zająć mniej niż godzinę, a dzięki usprawnionemu oprogramowaniu analitycznemu analiza może być przeprowadzona szybko i wydajnie. SAXS ma potencjał, aby znacznie zwiększyć wydajność badań strukturalnych jako samodzielna technika, ponieważ oferuje model struktury makromolekularnej o niskiej rozdzielczości, zanim dostępne będą dane o wysokiej rozdzielczości. Barierą dla innych technik strukturalnych jest wymóg wysoce czystej, skoncentrowanej próbki do pozyskiwania danych, co wymaga wysokiego poziomu ekspresji białek i stabilności w długim okresie czasu. Podczas gdy próbki SAXS również muszą być czyste i skoncentrowane, objętość próbki wynosi około 100 μl, co sprawia, że SAXS jest stosunkowo niedrogą metodą analizy w porównaniu z innymi technikami strukturalnymi. Co więcej, SAXS w połączeniu z chromatografią wykluczającą wielkość staje się coraz bardziej powszechny, co zapewnia dodatkowy etap kontroli jakości. W ostatnim czasie poczyniono znaczne postępy w łączeniu danych NMR i SAXS przy użyciu metody optymalizacji zespołowej (EOM)45,46 w celu wyjaśnienia elastycznych systemów. W niedawnym artykule Mertensa i Sverguna47 autorzy opisują wiele niedawnych przykładów EOM SAXS w połączeniu z NMR, wraz z wieloma innymi przykładami danych SAXS używanych w połączeniu z NMR. Nieustannie dokonuje się postęp w dziedzinie SAXS i opracowywane są nowe techniki SAXS, które mogą być stosowane w połączeniu z innymi technikami konstrukcyjnymi, a nie tylko jako ich uzupełnienie. W związku z tym uważamy, że zapotrzebowanie na SAXS będzie rosło z czasem, zwłaszcza w połączeniu z NMR w celu scharakteryzowania systemów dynamicznych, w których funkcje są definiowane przez elastyczność.

Komórki zawierają skomplikowane sieci białek, które działają jak molekularne maszyny do wykonywania funkcji komórkowych, takich jak kaskady sygnalizacji i utrzymywanie integralności strukturalnej. Sposób, w jaki te różne składniki poruszają się i oddziałują w przestrzeni trójwymiarowej, daje początek specyficznym funkcjom makrocząsteczek. Znaczenie struktury, dynamiki i interakcji białek w określaniu funkcji spowodowało potrzebę stale rozwijających się, złożonych technik pomiaru tych właściwości. Spośród nich magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), krystalografia rentgenowska (XRC), a ostatnio mikroskopia krioelektronowa (CEM) dostarczają informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości. Jednak XRC i CEM dają struktury jednego z wielu stanów biomolekularnych i brakuje im informacji o dynamice struktury białka, podczas gdy określanie struktury 3D za pomocą NMR jest zwykle ograniczone do mniejszych białek globularnych. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tych ograniczeń jest wykorzystanie rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do generowania otoczek molekularnych dużych, wielodomenowych lub skompleksowanych układów oraz łączenia sztywnych struktur makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości w celu wyjaśnienia globalnej architektury i dynamicznych cech.
SAXS tworzy niskorozdzielcze obwiedni kompleksów makromolekularnych o rozdzielczości około 10-20 A 1, dając wgląd nie tylko w strukturę, ale także w dynamiczne cechy, które wykazuje kompleks. Chociaż SAXS wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie do odkrywania struktury molekularnej, różni się od XRC tym, że losowa orientacja izotropowa cząstek w roztworze nie prowadzi do dyfrakcji, ale raczej do rozpraszania, które nie może dać rozdzielczości atomowej. Zamiast tego generowana jest "otoczka" elektronowa makrocząsteczki, która reprezentuje średnią konformacji, które wykazuje makrocząsteczka. Informacje te mogą być wykorzystane do bezpośredniego dopasowania wcześniej rozwiązanych atomowych struktur rozdzielczych do wnioskowania o regionach elastyczności w organizacji pojedynczego białka lub podjednostki lub dynamiki w większym, wielobiałkowym kompleksie. Dane SAXS są zbierane w synchrotronach przy użyciu wysokoenergetycznych monochromatycznych promieni rentgenowskich lub z własnych źródeł, które oferują słabsze źródło promieniowania rentgenowskiego, wymagające raczej godzin niż sekund czasu ekspozycji próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dane SAXS są często zbierane z kilku próbek za pomocą jednej konfiguracji eksperymentalnej i bufora, co wymaga dłuższego czasu na zebranie rundy użytecznych danych w systemie. Próbki powinny być zatem stabilne i nieagregujące przez co najmniej kilka godzin w oparciu o weryfikowalne metody kontroli jakości, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i/lub analityczna analiza ultrawirówkowa (AUC) w celu uzyskania wysokiej jakości danych SAXS2,3. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny opis SAXS, zasady jego stosowania, korzyści, ograniczenia i przygotowanie próbek, a także skupiamy się głównie na gromadzeniu i analizie danych, a także pokrótce dotykamy modelowania ab initio przy użyciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej nidogenu-1 i lamininy γ-1 jako przykładu eksperymentalnego.
Zasady, korzyści i ograniczenia SAXS:
Zasada przewodnia stojąca za SAXS jest stosunkowo prosta: roztwór monorozproszonego preparatu makromolekuł(ów) będącego przedmiotem zainteresowania umieszcza się w kapilarze i wystawia na działanie monochromatycznej wiązki promieniowania rentgenowskiego o wysokiej energii. Fotony powodują, że elektrony powłoki atomowej zaczynają oscylować, w wyniku czego emitowana jest fala sferyczna o tej samej energii i długości fali. Ponieważ każdy elektron będzie oscylował, zostanie osiągnięte stałe tło, a wynikowa gęstość elektronowa makrocząsteczki zostanie skontrastowana z tłem. Wynikowa intensywność rozpraszania jest zbierana w funkcji kąta rozpraszania, 2Θ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Podczas gdy inne techniki, takie jak XRC, NMR i CEM, dostarczają informacji strukturalnych na poziomie atomowym, istnieje wiele korzyści dla SAXS, których inne techniki nie są w stanie zapewnić. SAXS może być wykonywany w prawie każdym buforze i nie wymaga specjalnego przygotowania próbki. Jest to szczególnie ważne w badaniu zachowania i struktury makrocząsteczek w różnych warunkach, takich jak obecność lub brak kationów jedno- lub dwuwartościowych lub zmiany pH4,5. SAXS ma możliwość dostarczania informacji o elastycznych regionach makrocząsteczki6, z czym inne wymienione techniki mogą mieć problemy. W związku z tym SAXS może być stosowany jako silna technika uzupełniająca, w której stabilne części makrocząsteczki są badane za pomocą XRC, NRM lub CEM, a cała makrocząsteczka lub kompleks jest analizowana w niskiej rozdzielczości za pomocą SAXS i łączona przy użyciu różnych narzędzi analitycznych, takich jak FoXSDock7 lub CRYSOL8. Ponieważ SAXS jest techniką rozwiązania, jest często używana do potwierdzenia, czy struktury statyczne, takie jak te uzyskane z XRC, są spójne w solution6. SAXS ma również tę zaletę, że jest techniką, która wymaga stosunkowo niewielkiej inwestycji w próbkę (zwykle 50-100 μl) i stosunkowo niewielkiej ilości czasu eksperymentu (30 min-1 h).
Największym ograniczeniem SAXS jest podatność na agregację i/lub degradację próbek, co może prowadzić do błędnych prognoz strukturalnych. Agregacja, nawet tak niska jak 5%, może rozpraszać światło w bardzo dużych ilościach, prowadząc do przeszacowania maksymalnego wymiaru cząstek (Dmax) i promienia bezwładności (Rg). Z drugiej strony, degradacja próbki może prowadzić do niedoszacowania właściwości molekularnych. Podatność ta wynika z faktu, że SAXS jest techniką uśredniania, co oznacza, że jednorodność próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Każda próbka, która ma być analizowana przez SAXS, powinna zatem zostać poddana wielu metodom oczyszczania i kontroli jednorodności, takim jak denaturacja i natywna elektroforeza żelowa, chromatografia wykluczania wielkości, dynamiczne rozpraszanie światła i ultrawirowanie analityczne. Często linie badawcze SAXS przeprowadzają próbki przez wysokosprawną chromatografię cieczową jako końcowy etap kontroli jakości przed SAXS (S-SAXS)3,9. Dane SAXS powinny być gromadzone przy wielu stężeniach, a Rg każdego zestawu danych powinno być porównywane, zapewniając ścisłe podobieństwo w celu uniknięcia interakcji międzycząsteczkowych i agregacji, co skutkuje przeszacowaniem wymiarów cząstek, co prowadzi do niedokładnej analizy i modelowania danych. Ponieważ rozpraszanie zależy zarówno od stężenia, jak i wielkości, mniejsze makrocząsteczki mogą wymagać bardziej szczegółowej optymalizacji zakresu stężeń. Wynika to z twierdzenia o wzajemności, w którym duże rozmiary rozpraszają się w kierunku małych kątów, a małe rozmiary w kierunku dużych kątów. Przejawia się to w zbieraniu danych, gdzie IO jest proporcjonalne do R6, gdzie R jest promieniem cząstki. Ostatnim ograniczeniem SAXS jest możliwość uszkodzenia próbki przez promieniowanie podczas ekspozycji, co może prowadzić do zniekształcenia danych. Dobrą praktyką jest porównywanie jakości próbki przed i po ekspozycji na próbkę SAXS, aby upewnić się, że tak się nie dzieje.

<table><tbody><tr><td>HEK 293 Linia komórkowa EBNA</td><td>Dostępność w laboratorium</td> <td>-</td> <td>Linia komórkowa używana do nadekspresji białek</td></tr> <tr><td>Ni Sepharose Wysokowydajna żywica do oczyszczania białek znakowana histydyną</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>Żywica do oczyszczania białek Affinity</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Kolumna SEC</td></tr> <tr><td>i Auml; KTA Pure FPLC</td><td>GE</td> <td>Healthcare-FPLC</td> <td>System</td></tr><tr><td>Nanodrop</td> <td>Nanodrop-Spectrophotometer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Podstawowe odczynniki (NaCl, Tris-HCl itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S-MAX3000</td><td>Rigaku-SAXS</td><td></td> <td>System kamer otworkowych</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano-S</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-Dynamiczny</td> <td>instrument rozpraszania światła</td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m Filtr</td><td>Millipore</td><td>JVWP04700</td><td>Używany do zagęszczania próbki przed DLS</td></tr><tr><td>Zestaw do cięcia trombiny</td><td>abcam</td><td>ab207000</td><td>Rozszczepienie trombiny w celu usunięcia jego znacznika</td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose Column</td><td>IBA</td><td>2-1201-010</td><td>Strep-Tag Oczyszczanie powinowactwa</td></tr><tr><td>D-desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533-48-2</td><td>Elucja białka Strep Tag</td></tr> <tr><td><silny> Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAXGUI</td><td></td><td></td> <td>Rigaku-Gromadzenie danych dla SAXS i redukcji danych</td></tr><tr><td>ATSAS Suit</td><td>Franke et al., 2017-SAXS</td><td></td> <td>Data Analysis Software Software pakiet programów</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al., 2003-Buffer</td><td></td> <td>Subtraction</td></tr><tr><td>GNOM</td><td>Svergun, 1992-Rg</td><td></td><td>, Dmax</subObliczenia > i p(r)</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>Franke i Svergun, 2009</td><td>-</td><td>Ab initio obliczenia modelu</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>Volkov i Svergun, 2003-Uśrednione</td><td></td> <td>obliczenia konformacji rozwiązania</td></tr><tr><td>MONSA</td><td>Svergun, 1999-Jednoczesne</td><td></td> <td>dopasowanie modelu dla złożonego</td></tr><tr><td>GASBOR</td><td>Svergun et al., 2001</td><td>-</td><td>Alternatywne obliczenia modelu ab initio</td></tr><tr><td>Oprogramowanie DTS V6.20</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-DLS</td> <td>dostarczyło oprogramowanie przyrządu</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schrödinger, LLC.</td><td>-</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td></tr><tr><td>The Protein Data Bank</td><td>Berman et al., 2000-PDB</td><td></td> <td>ID: 1NPE</td></tr></tbody></table>

badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Interakcje białko-białko z udziałem białek z wieloma domenami globularnymi stanowią wyzwanie techniczne dla określenia, jak powstają takie kompleksy i jak są zorientowane/pozycjonowane domeny. W tym miejscu opisano protokół, który może wyjaśnić, które konkretne domeny pośredniczą w interakcjach w systemie wieloskładnikowym poprzez modelowanie ab initio. Podano metodę obliczania struktur roztworów makrocząsteczek i ich zespołów, która polega na integracji danych z rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS), chromatografii i struktur rozdzielczości atomowej w podejściu hybrydowym. Konkretnym przykładem jest kompleks pełnowymiarowego nidogenu-1, który składa białka macierzy zewnątrzkomórkowej i tworzy wydłużoną, zakrzywioną nanostrukturę. Jedna z jego domen kulistych przyłącza się do lamininy γ-1, która strukturyzuje błonę podstawną. Stanowi to podstawę do określenia dokładnych struktur elastycznych wielodomenowych kompleksów białkowych i jest możliwe dzięki źródłom synchrotronowym sprzężonym z automatyką, robotyką i systemami chromatografii wykluczającej rozmiary. Ta kombinacja pozwala na szybką analizę, w której wiele stanów oligomerycznych jest rozdzielanych tuż przed zebraniem danych SAXS. Analiza dostarcza informacji na temat promienia bezwładności, wymiaru cząstek, kształtu molekularnego i parowania międzydomenowego. Podano również protokół generowania modeli 3D kompleksów poprzez dopasowanie struktur białek składowych o wysokiej rozdzielczości.

Opisane powyżej podejście do analizy danych wykorzystano do obliczenia Rg i Dmax dla nidogenu-1, lamininy γ-1 oraz ich kompleksu, stosując funkcję P(r). Uzyskano wartości Rg odpowiednio 7,20 (±0,10) nm, 8,10 (±0,20) nm i 10,9 (±0,4) nm dla nidogenu-1, lamininy γ-1 oraz ich kompleksu (Rysunek 2A-B). Dodatkowo otrzymano wartości Dmax wynoszące odpowiednio 24 nm, 26 nm i 35 nm dla nidogenu-1, lamininy γ-1 oraz ich kompleksu (Rysunek 2)10. Program DAMMIF został wykorzystany do uzyskania struktur o niskiej rozdzielczości nidogenu-1 i lamininy γ-1, co sugerowało, że oba białka przyjmują w roztworze kształt wydłużony. Wartości X i NSD dla nidogenu-1 (~1 i 0,8) oraz lamininy γ-1 (odpowiednio ~0,9 i 0,8) znajdowały się również w akceptowalnym zakresie. Nałożenie struktur o wysokiej rozdzielczości (dwóch domen nidogenu-1 i dwóch domen lamininy γ-1) na ich struktury o niskiej rozdzielczości uzyskane za pomocą SAXS pozwoliło na identyfikację ich regionów N- i C-końcowych10.
Zidentyfikowano nidogen-1 jako partnera oddziałującego z lamininą γ-139,40, a miejsce oddziaływania zostało zmapowane za pomocą krystalografii rentgenowskiej na domeny C-końcowe41. Jednakże struktury o wysokiej rozdzielczości obejmowały jedynie oddziałujące domeny, a nie pełną długość nidogenu-1 czy całe ramię lamininy γ-1. Dlatego oczyszczono kompleks zawierający nidogen-1 (pełnej długości) oraz ramię lamininy γ-1, aby zidentyfikować regiony oddziałujące, a także zbadać względną orientację domen N-końcowych obu białek. Dane SAXS dla kompleksu wykazały Rg wynoszące 10,9 (±0,4) nm oraz Dmax wynoszące 35 nm. Wykorzystano program MONSA do uzyskania struktury całego kompleksu o niskiej rozdzielczości, która zasugerowała, że rzeczywiście tylko region C-końcowy obu białek bierze udział w mediowaniu oddziaływań, podczas gdy pozostałe domeny znajdują się daleko od siebie (Rycina 3, Wideo 1).
<img alt="Wykres rozpraszania rentgenowskiego do modelowania makromolekuł za pomocą ATSAS; absorpcja, modelowanie, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematy układu SAXS. Przygotowywana jest monodyspersyjna próbka biomolekuł lub ich kompleksów, która następnie jest naświetlana rentgenowskim promieniowaniem wysokiej energii. W zależności od źródła (np., wewnętrzny kontra synchrotron), energia promieniowania rentgenowskiego oraz odległość próbki od źródła mogą być zmienne. Wzorzec rozpraszania promieni rentgenowskich (zależny od rozmiaru i kształtu biomolekuł) jest rejestrowany i uśredniany radialnie w celu uzyskania jednowymiarowego wykresu (1D), który zawiera informacje o intensywności rozproszonego światła w zależności od kąta rozpraszania. Ponieważ cząsteczki buforu również rozpraszają światło, wkłady tych cząsteczek są odejmowane, aby uzyskać wzorzec rozpraszania badanych biomolekuł. W synchrotronie, przed rozpoczęciem gromadzenia danych SAXS, zazwyczaj wykonuje się dodatkowy etap oczyszczania z wykorzystaniem zintegrowanej chromatografii wykluczania cząsteczkowego/wysokosprawnej (widok z góry). Etap ten jest kluczowy dla usunięcia wszelkich zagregowanych i/lub zdegradowanych produktów, a także niezwiązanych biomolekuł z kompleksu. Jednowymiarowy wykres rozpraszania jest konwertowany na wykres rozkładu odległości par elektronów (P(Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.(wykres), który dostarcza informacji o promieniu bezwładności oraz maksymalnym wymiarze cząsteczkowym biomolekuł. Wykres ten służy jako plik wejściowy dla ab initio pakiety modelujące (tj. DAMMIN/DAMMIF) do uzyskiwania struktur biomolekuł o niskiej rozdzielczości lub inne pakiety (t. j. (SASREF/CORAL), jeżeli znana jest struktura o wysokiej rozdzielczości części biomolekuł lub poszczególnych biomolekuł kompleksu.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wyniki rozpraszania promieni rentgenowskich w małych kątach; analiza danych i wykresy dopasowania dla kompleksu, nidogenu-1 oraz lamininy γ1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. (A) Wykres natężenia światła rozproszonego kontra kąt rozproszony (q=4πsinθ/λ, nm-1) sugerujące jakość biomolekuł (obszar niski) oraz kształt biomolekuł (obszar wysoki). (B) Rozkład odległości między parami elektronów P(r) wyznaczone na podstawie danych z rozpraszania sugerują wydłużony kształt badanych biomolekuł (lamininy γ-1, nidogenu-1 oraz ich kompleksu). (C) Wykres Kratkygo sugerujący, że białka nidogen-1 i laminina γ-1 nie są rozfałdowane. (D) Wykres Guiniera dla nidogenu-1, lamininy γ-1 oraz ich kompleksu, wskazujący obszar liniowy służący do wyznaczenia promienia żyrowania przy użyciu danych dla niskich kątów rozpraszania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat zwijania białek, obrót struktur molekularnych o 180 stopni, badania edukacyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Struktura o niskiej rozdzielczości kompleksu nidogenu-1 i lamininy γ-1, uzyskana poprzez analizę połączonych zestawów danych przy użyciu programu MONSA. Schemat kolorystyczny jest taki sam jak Rysunek 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Modelowanie molekularne oddziaływań białko-ligand; analiza struktury 3D, badania biochemiczne." src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 1"> 
Wideo 1Struktura o niskiej rozdzielczości kompleksu nidogenu-1 i lamininy γ-1. Film ten został przygotowany przy użyciu programu PYMOL w celu wizualizacji różnych cech strukturalnych kompleksu. Struktura krystaliczna kompleksu lamininy z nidogenem (PDB ID: 1NPE) przedstawiona jest w formie schematu wstążkowego, z wyróżnieniem miejsc oddziaływania w tym kompleksie. Schemat kolorystyczny jest taki sam jak Rysunek 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii, takie jak rozmiar, kształt i zmiany konformacyjne biomolekuł i ich kompleksów. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksperymenty można przeprowadzać w fizjologicznie odpowiednich warunkach buforowych w środowisku, w którym biomolekuły są stabilne. SAXS jest techniką uzupełniającą wiele innych metod biofizycznych i biologii strukturalnej.Połączenie SAXS z tymi metodami może nam pomóc w opracowaniu terapii opartej na strukturze. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kompleksy biomolekularne, może być również stosowana w innych systemach, takich jak badanie nanocząstek i versykulacji dostarczania leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wydaje się, że jest to przytłaczający i skomplikowany proces, polegający na przejściu od surowych danych rozpraszających do struktur o niskiej rozdzielczości.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ proces analizy danych w celu uzyskania modeli strukturalnych z surowych danych jest trudny do nauczenia, ponieważ wymaga użycia wielu różnych pakietów oprogramowania. Istnieje kilka pakietów oprogramowania, które są przydatne do analizy danych SAXS. Należą do nich SCATTER, BioXTAS RAW i pakiet ATSAS.W tym filmie przedstawimy przegląd ogólnych kroków, które należy wykonać podczas analizowania surowych danych SAXS przy użyciu pakietu programów ATSAS. Aby rozpocząć, zainstaluj i załaduj pakiet programów ATSAS. Otwórz program PRIMUS/Qt i przejdź do opcji Otwórz menu.Tutaj wybierz do 13 interesujących Cię plików danych. Pliki danych muszą być w formacie ASCII, w którym pierwsza kolumna to oś wektora s, a druga kolumna to intensywność. Powtórz ten krok dla danych tylko bufora, wstawiając te dane do drugiego menu Narzędzia.Następnie przejdź do okna Przetwarzanie danych i wybierz opcję Odejmij. Spowoduje to wygenerowanie odjętej krzywej rozpraszania, reprezentującej tylko rozpraszanie od interesującej makrocząsteczki. Aby przeprowadzić analizę Guiniera, zacznij od krzywej rozproszenia odjętej od bufora załadowanej do PRIMUS/Qt.Następnie kliknij na Radius of Gyration, co otworzy się Primus Guinier Wizard. W tym momencie zostanie wyświetlony wykres przedstawiający logarytm naturalny kątów intensywności w funkcji rozproszenia do kwadratu. Aby uzyskać wstępny promień bezwładności, znajdź okno wiersza polecenia i użyj funkcji Autorg.Po naciśnięciu przycisku Autorg kliknij górny limit w górę, a następnie w dół, aby wymusić aktualizację pomiarów statystycznych. Możesz też wprowadzić wiele plików jednocześnie, klikając ten sam monit o otwarcie i wybierając nazwy wielu plików danych, podświetlając je w taki sam sposób, jak opisano wcześniej. Aby rozpocząć analizę Kratky, kliknij, aby wybrać nazwę pliku danych.Spowoduje to wykreślenie danych w oknie. A następnie wybierz opcję Działka. Następnie, poniżej przycisku Działka, kliknij Kratky Plot.W rezultacie, białka kuliste wykazują pik GALC-ean, podczas gdy niesfałdowane białka będą wykazywać plateau zamiast piku i będą przypominać wykres hiperboliczny, taki jak ten pokazany tutaj. Ponownie załaduj dane odjęte przez bufor dla każdego stężenia w PRIMUS/Qt. Na karcie Przetwarzanie kliknij opcję Skala i sprawdź każdą krzywą oraz liczbę i-scale, która odpowiada rozcieńczeniom wykonanym z oryginalnej próbki.Po sprawdzeniu scal dane, klikając przycisk Scal w oknie Przetwarzanie. Aby wygenerować wykres rozkładu odległości, załaduj scalone krzywe danych do PRIMUS/Qt, a następnie kliknij przycisk Rozkład odległości na karcie Analiza. Dostosuj zakres scalonych danych, aby uniknąć znacznego szumu na końcu nieprzetworzonych danych.Pomiń również punkty danych w pobliżu przystanku wiązki w obszarze low-q, wybierając dolną wartość zakresu i zwiększając liczbę. Aby wyznaczyć wartość Dmax, należy rozpocząć od zakresu pięciokrotności promienia bezwładności uzyskanego z analizy Guiniera. Następnie stopniowo zmniejszaj tę wartość, aż wykres rozkładu odległości nie spadnie nagle do zera na osi y i nie będzie miał długiego ogona przed zbliżeniem się do zera.Sprawdzić, czy eksperymentalny promień bezwładności w funkcji intensywności, który jest uzyskany na podstawie przybliżenia Guiniera, oraz promień rozkładu odległości liczb bezwładności w funkcji intensywności są podobne. Tutaj intensywność rozproszonego światła jest pokazana na wykresie w stosunku do kąta rozpraszania, co sugeruje zarówno jakość biomolekuł nidogen-1, lamininy gamma-1 i ich kompleksu, jak i ich kształt. Rozkład odległości par elektronów określony na podstawie danych rozpraszania sugeruje, że biomolekuły mają wydłużony kształt, a wykres Kratky'ego sugeruje, że białka są w stanie pofałdowanym, ponieważ dane mają tendencję do plateau, a nawet wzrostu w większym zakresie q i nie mają kształtu krzywej dzwonowej.Ponadto wykresy Guiniera, które wykorzystują dane przy niskim kącie rozpraszania, wskazują obszar liniowy do wyznaczenia promienia bezwładności, który jest pokazany tutaj dla nidogenu-1, lamininy gamma-1 i ich kompleksu. Do badania kompleksów białko-białko wykorzystano projekt MONSA w celu uzyskania struktury o niskiej rozdzielczości całego kompleksu gamma-1 lamininy-1, co sugeruje, że tylko region C-końcowy obu białek uczestniczy w interakcjach pośredniczących, podczas gdy reszta domen jest od siebie oddalona. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem synchrotronowym może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności i bezpieczeństwo określone przez każdą inną linię badawczą powinny być zawsze podejmowane podczas wstępnego zbierania danych.

structural-studies-macromolecules-solution-using-small-angle-x-ray

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentacja procedury małokątnego i szerokokątnego rozpraszania rentgenowskiego (SWAXS) stała się kluczowa w badaniach nad biologicznymi makromolekułami. Dzięki zastosowaniu aparatury oraz procedur przygotowania i metod specyficznych kątów, dane eksperymentalne z SWAXS pozwalają na charakterystykę makromolekuł w skali atomowej i nanometrycznej.

Badania rozpraszania promieni rentgenowskich pod kątem małym i szerokim dla makrocząsteczek biologicznych w roztworze

Tutaj prezentujemy protokół do badania miękkiej materii i systemów biofizycznych w szerokiej mezoskopowej skali długości, od nm do μm, która obejmuje użycie dyfraktometru KWS-2 SANS o wysokiej intensywności i regulowanej rozdzielczości.

Badanie miękkiej materii i układów biologicznych w szerokiej skali długości od rozmiarów nanometrów i mikrometrów na małokątowym dyfraktometrze neutronowym KWS-2

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.

Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Ta publikacja pokazuje zastosowanie dyfrakcji rentgenowskiej i różnicowej kalorymetrii skaningowej jako złotych standardów do badania stanu stałego lipidowych substancji pomocniczych (LBE). Zrozumienie zmian w stanie stałym w LBE i ich wpływu na działanie produktów farmaceutycznych jest kluczowym czynnikiem w produkcji solidnych form dawkowania na bazie lipidów.

Pakiet uznanych narzędzi analitycznych do badania zmian w stanie stałym substancji pomocniczych na bazie lipidów

Poznaj metodę SAXS do badania struktur makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem pakietu ATSAS. Technika ta pozwala analizować kształt i konformację białek w warunkach fizjologicznych.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Przeglądaj więcej filmów