Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące integralnych białek błonowych, takich jak stan oligomeryczny, ich rozmiar, ogólny kształt i struktura o niskiej rozdzielczości w roztworze. Badania roztworów białek błonowych wymagają stabilizujących cząsteczek, takich jak detergenty. Technika ta ma tę zaletę, że sprawia, że detergenty stają się niewidoczne i podkreślają sygnał z białka błonowego.

Implikacje tej techniki rozciągają się na wiele biologicznych i medycznych pytań badawczych, ponieważ ponad 1/3 białek znajduje się w błonach, gdzie pełnią wiele ważnych funkcji komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy znakowania deuterem i rozpraszania neutronów są trudne do nauczenia, ponieważ bardzo niewiele instytucji oferuje szkolenia w zakresie tych technik. Na początek określ gęstości długości rozpraszania neutronów lub SLD za pomocą aplikacji internetowej MULCh, modułów do analizy danych dotyczących zmienności kontrastu.

Otwórz moduł kontrastu, klikając kontrast znajdujący się w lewym okienku nawigacji. Podaj tekst tytułu projektu i wprowadź poniżej szczegóły dotyczące dwóch komponentów jako podjednostki pierwszej i podjednostki drugiej. Wprowadź wzór cząsteczkowy dla każdego składnika w polu tekstowym formuły.

Następnie wprowadź objętość w angstremach sześciennych dla każdego składnika w polu poniżej objętości. Na koniec wprowadź szczegóły składników bufora. Kliknij przycisk Prześlij, aby wykonać obliczenia kontrastu neutronów.

Generowana jest strona wyników, która zawiera tabelę punktów dopasowania długości rozpraszania, gęstości i kontrastu, a także wzory do określania tych parametrów przy dowolnym procencie D2O w buforze. Przejrzyj parametry rozpraszania, zwracając szczególną uwagę na punkty dopasowania kontrastu komponentów. Hoduj komórki E. coli zawierające indukowalny wektor ekspresyjny dla docelowej sekwencji białka w pożywce LB do gęstości optycznej przy 600 nanometrach lub OD 600 około jednego.

Dostosuj komórki E. coli do pożywki znakowanej deuterem przed zwiększeniem skali w celu nadekspresji zdeuterowanego białka, rozcieńczając kulturę LB od jednego do 20 w trzech mililitrach minimalnej pożywki. Po osiągnięciu OD 600 około jednego, powtórz od jednego do 20 rozcieńczeń, używając minimalnej pożywki zawierającej 50, 75 i 100% D2O. Po adaptacji kontynuuj hodowlę w bioreaktorze, aby zwiększyć wydajność deuterowanej masy komórkowej.

Wraz ze wzrostem zawartości D2O tempo wzrostu będzie się zmniejszać. Przystąp do zbierania, lizy i oczyszczania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość z większą niż dwiema objętościami kolumny końcowego buforu wymiennego przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek.

Po wstrzyknięciu próbki uruchomić kolumnę we frakcjach izolujących odpowiadających białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Zarezerwuj podwielokrotność dopasowanego bufora dla rozpraszania neutronów pod małym kątem lub odejmowania tła SANS. Aby zebrać dane SANS, najpierw załaduj próbki i do ogniw kwarcowych.

Po upewnieniu się, że przesłona wiązki jest zamknięta, zbliż się do obszaru środowiska próbki i umieść ogniwa kwarcowe w podajniku próbek. Zapisać pozycję podajnika próbek dla każdej celi próbki. Sprawdź obszar i upewnij się, że ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód przed opuszczeniem obszaru środowiska próbki.

Następnie otwórz żaluzję wiązki. Wykonaj skanowanie tabeli w celu automatycznego zbierania danych. Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi instrumentu dostarczonymi przez naukowca zajmującego się rozpraszaniem neutronów.

Użyj oprogramowania Mantid Plot i skryptu Python do redukcji danych SANS z obrazu 2D do wykresu 1D. Aby to zrobić, zaloguj się do klastra zdalnej analizy i uruchom wykres Mantid z wiersza poleceń. Następnie otwórz dostarczony skrypt redukcyjny użytkownika i umieść odpowiednie numery skanowania lub identyfikację próbki w parach na odpowiedniej liście.

Uruchom skrypt, aby wygenerować zredukowane dane jako czterokolumnowy plik tekstowy w określonej lokalizacji. Kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednią przestrzeń roboczą i wykres modliszki, a następnie wybierz wykres z błędami, aby wstępnie zbadać profile rozpraszania. Pobierz pakiet oprogramowania ATSAS i korzystaj z PRIMUS do wykreślania danych, skalowania i odejmowania oraz analizy Guiniera.

Uruchom aplikację do analizy danych ATSAS, SAS i załaduj zredukowane pliki danych odpowiadające parze próbki i bufora. Aby odpowiednio przeskalować bufor, należy wybrać zakres danych w punkcie wysokiego Q, w którym oba profile są do siebie podobne na płasko i kliknąć przycisk skalowania znajdujący się pod zakładką operacji. Zwiększ zakres danych, aby wyświetlić wszystkie punkty, kliknij przycisk odejmij, aby wykonać tę operację.

Wykonaj analizę Guiniera danych próbki odjętych od buforu, korzystając z zakładki analiza w aplikacji do analizy danych SAS. Upewnij się, że na liście został wybrany właściwy plik i kliknij promień bezwładności. Automatyczna próba wykonania dopasowania Guiniera zostanie zapewniona po kliknięciu przycisku auto RG.

Rozszerz zakres danych używanych do uwzględnienia wszystkich danych o niskim Q i zacznij zawężać zakres danych, usuwając wysokie punkty Q, aż limit Q max razy RG spadnie poniżej 1,3. Użyj wykresu reszt, aby sprawdzić, czy dane są liniowe w zakresie dopasowania. Dokonaj niewielkich korekt w obszarze dopasowania i monitoruj wrażliwość tych wartości na zakres danych używanych w dopasowaniu.

Uzyskaj funkcję rozkładu prawdopodobieństwa P z R w gnom. Teraz uruchom kreatora rozkładu odległości w zakładce analiza. Uzyskanie dobrego dopasowania do danych jest niezbędne do uzyskania modelu wysokiej jakości.

Określ Dmax, maksymalną odległość międzyatomową w cząsteczce. Oszacuj wartość Dmax, usuwając zaznaczenie pola, aby wymusić wartość Rmax równą zero i wprowadzając dużą wartość Dmax. Pierwsze przecięcie X na wykresie P z R daje to oszacowanie.

Wprowadź przyrostowe zmiany w tej wartości Dmax, a także w zakresie danych używanych do optymalizacji dopasowania gnoma do danych i wynikowej krzywej P R. Uruchom kreatora kształtu PRIMUS za pomocą przycisku dammif na karcie analizy danych SAS i użyj ręcznego wyboru parametrów. Zdefiniuj zakres Guiniera od dopasowania i przejdź do następnego kroku za pomocą przycisków nawigacyjnych.

Zdefiniuj wartości dopasowania na podstawie wykresu P z R i przejdź do następnego kroku. Podaj parametry procesu modelowania ab initio. Następnie zainicjuj proces za pomocą przycisku zatwierdź.

Nałóż i nałóż ostateczną obwiednię sans z powiązanym modelem o wysokiej rozdzielczości za pomocą supcomb w ATSAS. Umieść w katalogu roboczym kopię modelu PDB o wysokiej rozdzielczości, który ma być dopasowany do koperty SANS. Następnie uruchom supcomb z wiersza poleceń, używając nazw plików PDB jako dwóch argumentów ze strukturą szablonu wymienioną jako pierwszą.

Na koniec wizualizuj wyniki modelu ab initio za pomocą PyMOL, programu do przeglądania grafiki molekularnej 3D. Po nałożeniu na siebie obwiedni SANS i struktury o wysokiej rozdzielczości, modele te można wizualizować za pomocą dowolnego programu do przeglądania grafiki molekularnej. Przedstawiono przegląd procesu wizualizacji PyMOL.

Po otwarciu plików struktury PDB w PyMOL modele powinny być widoczne w oknie przeglądarki PyMOL. Reprezentacje każdego modelu można zmienić za pomocą przycisku S znajdującego się obok nazwy każdego pliku. W tym przypadku reprezentacja powierzchni jest używana dla obwiedni SANS, a reprezentacja kreskówkowa jest używana dla szkieletu białkowego modelu o wysokiej rozdzielczości.

Odpowiednią kolorystykę można wybrać spośród opcji dostępnych pod przyciskiem C. W przypadku łańcuchów białkowych barwienie łuku łańcuchowego zapewnia gradient kolorów od końca N do C, aby ułatwić interpretację. Przezroczystość jest stosowana do reprezentacji powierzchni, aby umożliwić lepszą wizualizację struktury białka w obwiedni.

W przypadku obrazów do publikacji zalecane jest białe tło. Po zastosowaniu tych wskazówek wizualizacyjnych struktury 3D można badać, klikając i przeciągając strukturę. Można dokonywać manipulacji perspektywą oraz rotacją i translacją cząsteczek.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym dopasowaniu kontrastu neutronowego grup głowicy i ogona detergentu z rozpuszczalnikiem D2O H2O. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do zbadania struktury wewnątrzbłonowych proteaz asparto. Białka te biorą udział w odpowiedzi immunologicznej, wirusowym zapaleniu wątroby typu C i chorobie Alzheimera.

Nie zapominaj, że praca w laboratoriach biochemicznych i przy zakładach wykorzystujących wiązkę neutronów może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury obowiązkowe są środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej oraz przestrzeganie wszystkich zasad bezpieczeństwa w obiekcie i wpisów radiologicznych.