Name: Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę SANS z dopasowaniem kontrastu detergentów do analizy strukturalnej białek błonowych. Technika ta umożliwia określenie stanu oligomerycznego, rozmiaru i kształtu białek w roztworze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych wspierało badania w Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB) ORNL oraz Bio-SANS przy użyciu urządzeń wspieranych przez Wydział Obiektów Naukowych Użytkowników, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii USA. Prace strukturalne nad białkami błonowymi w laboratorium Liebermana były wspierane przez NIH (DK091357, GM095638) i NSF (0845445).

Autorzy Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss i Ryan C. Oliver są zakontraktowani przez UT-Battelle z US DOE w celu wspierania Neutron Science User Program i instrumentu Bio-SANS w Oak Ridge National Laboratory, o których mowa w tym artykule.
Współautorem tego manuskryptu jest UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych (DOE). Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów rządu Stanów Zjednoczonych. DOE zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE. Rozdział 82

Naukowcy zajmujący się biologią strukturalną wykorzystują uzupełniające techniki strukturalne, takie jak rozpraszanie roztworu, w celu uzyskania szczegółów biochemicznych i strukturalnych (takich jak ogólny rozmiar i kształt) z biomolekuł w roztworze. SANS jest szczególnie atrakcyjną techniką do określania struktur białek błonowych o niskiej rozdzielczości, która jest głównym przedmiotem zainteresowania współczesnej biologii strukturalnej i biochemii. SANS wymaga ilości oczyszczonych białek porównywalnych z ilościami uzy...

Białka błonowe są kodowane przez około 30% wszystkich genów1 i stanowią zdecydowaną większość celów dla nowoczesnych leków. 2 Białka te pełnią szeroki wachlarz ważnych funkcji komórkowych,3, ale pomimo ich obfitości i znaczenia — stanowią tylko około 1% wszystkich struktur zdeponowanych w Banku Danych Białkowych Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). 4 Ze względu na ich częściowo hydrofobową naturę, strukturalne określanie białek związanych z błoną było niezwykle trudne. 5,6,7
Ponieważ wiele technik biofizycznych wymaga monodyspersyjnych cząstek w roztworze do pomiaru, izolowanie białek błonowych od natywnych błon i stabilizowanie tych białek w rozpuszczalnym naśladownictwie natywnych błon było aktywnym obszarem badań w ostatnich dziesięcioleciach. 8,9,10 Badania te doprowadziły do opracowania wielu nowych zespołów amfifilowych do rozpuszczania białek błonowych, takich jak nanodyski,11,12,13 bicelles,14,15 i amfipole. 16,17 Jednak stosowanie miceli detergentowych pozostaje jednym z najbardziej powszechnych i najprostszych podejść do spełnienia wymagań dotyczących rozpuszczalności danego białka. 18,19,20,21,22,23,24,25 Niestety, obecnie nie istnieje żaden pojedynczy detergent ani magiczna mieszanka detergentów, która spełniałaby wszystkie białka błonowe; W związku z tym warunki te muszą być empirycznie przebadane pod kątem unikalnych wymagań każdego białka. 26,27
Detergenty samoorganizują się w roztworze powyżej ich krytycznego stężenia miceli, tworząc struktury zbiorcze zwane miceli. Micele składają się z wielu monomerów detergentów (zwykle w zakresie od 20 do 200) z hydrofobowymi łańcuchami alkilowymi tworzącymi rdzeń miceli i hydrofilowymi grupami głów ułożonymi w warstwie otoczki miceli skierowanej w stronę wodnego rozpuszczalnika. Zachowanie detergentów i tworzenie miceli zostało klasycznie opisane przez Charlesa Tanforda w The Hydrophobic Effect, 28, a rozmiary i kształty miceli z powszechnie stosowanych detergentów w badaniach białek błonowych zostały scharakteryzowane za pomocą rozpraszania pod małym kątem. 29,30 Organizacja detergentów wokół białek błonowych została również zbadana i oczekuje się tworzenia kompleksów białkowo-detergentowych (PDC) z cząsteczkami detergentu otaczającymi białko w układzie przypominającym schludne micele detergentu. 31
Jedną z dodatkowych zalet korzystania z detergentów jest to, że uzyskane właściwości miceli mogą być manipulowane poprzez włączenie innych detergentów. Wiele detergentów wykazuje idealne mieszanie, a wybrane właściwości mieszanych miceli można nawet przewidzieć na podstawie składników i proporcji mieszania. 22 Jednak obecność detergentu może nadal stanowić wyzwanie dla charakterystyki biofizycznej, przyczyniając się do ogólnego sygnału. Na przykład w przypadku technik promieniowania rentgenowskiego i rozpraszania światła sygnał z detergentu w PDC jest praktycznie nie do odróżnienia od białka. 32 Badania z użyciem mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM) zazwyczaj opierają się na uwięzionych (zamrożonych) cząstkach; Szczegóły strukturalne białka są nadal zasłonięte przez niektóre detergenty lub wysokie stężenie detergentu, które dodaje tła. 33 Alternatywne podejścia do interpretacji pełnej struktury PDC (w tym detergentu) zostały stworzone za pomocą metod obliczeniowych, które mają na celu rekonstrukcję detergentu wokół danego białka błonowego. 34
W przypadku rozpraszania neutronów, układ rdzeń-powłoka detergentu w miceli wytwarza współczynnik kształtu, który przyczynia się do obserwowanego rozpraszania. Na szczęście składniki roztworu można zmienić w taki sposób, aby nie przyczyniały się do obserwowanego rozpraszania netto. Ten proces "dopasowania kontrastowego" uzyskuje się poprzez zastąpienie deuteru wodorem w celu uzyskania gęstości długości rozpraszania, która odpowiada gęstości tła (bufora). Należy wziąć pod uwagę rozsądny wybór detergentu (z dostępnymi deuterowanymi odpowiednikami) i stosunek ich mieszania. W przypadku miceli detergentu substytucję tę można przeprowadzić przy użyciu detergentu o tej samej grupie głównej, ale posiadającym deuterowany łańcuch alkilowy (ogon d zamiast ogona h). Ponieważ detergenty są dobrze wymieszane,35 ich agregaty będą miały gęstość długości rozproszenia, która jest średnią ważoną ułamkiem molowym dwóch składników (ogony h i ogony d). Gdy ten średni kontrast jest zgodny z kontrastem grupy głównej, jednorodne struktury agregacji mogą być w pełni dopasowane, aby usunąć wszystkie czynniki przyczyniające się do obserwowanego rozpraszania.
Prezentujemy tutaj protokół do manipulowania kontrastem neutronów miceli detergentu poprzez włączenie chemicznie identycznych cząsteczek detergentu z łańcuchami alkilowymi znakowanymi deuterem. 19,36,37 Pozwala to na pełne jednoczesne dopasowanie kontrastu rdzenia i powłoki miceli, co jest unikalną zdolnością rozpraszania neutronów. 35,38 Dzięki temu znacznie wyrafinowanemu poziomowi szczegółowości, dopasowanie kontrastu może umożliwić badania struktur białek błonowych, które w innym przypadku byłyby niewykonalne. Ponadto to podejście oparte na dopasowaniu kontrastu można rozszerzyć na inne systemy obejmujące detergenty, takie jak reakcje wymiany polimerów39 i dyspergatory olejowo-wodne,40 lub nawet inne środki solubilizujące, takie jak bicele,41 nanodyski,42 lub kopolimery blokowe. 43 Podobne podejście, jak opisane w tym manuspekcie, ale wykorzystujące pojedynczy rodzaj detergentu z częściowymi podstawieniami deuteru na łańcuchu alkilowym i/lub grupie głównej, zostało niedawno opublikowane. 37 Chociaż można się spodziewać, że poprawi to losowy rozkład wodoru i deuteru w całym detergencie w porównaniu z podejściem przedstawionym tutaj, ograniczona liczba dostępnych pozycji na detergencie do zastąpienia i wymaganej dwuetapowej syntezy detergentu stanowi dodatkowe wyzwanie do rozważenia.
Kroki 1 i 2 protokołu opisanego poniżej często się pokrywają, ponieważ wstępne planowanie eksperymentu musi być wykonane w celu złożenia propozycji jakości. Jednak złożenie wniosku jest tutaj uważane za pierwszy krok do podkreślenia, że proces ten powinien zostać rozpoczęty na długo przed eksperymentem neutronowym. Należy również zauważyć, że warunkiem wstępnym, który powinien zostać wykazany we wniosku, jest posiadanie charakterystyki biochemicznej i fizycznej (w tym czystości i stabilności) próbki, co potwierdza potrzebę badań neutronów. Ogólne omówienie rozpraszania neutronów pod małymi kątami (SANS) wykracza poza zakres tego artykułu. Krótkie, ale dokładne wprowadzenie jest dostępne w pracy referencyjnej Characterization of Materials autorstwa Kaufmanna, 44, a niedawno opublikowano obszerny podręcznik poświęcony biologicznemu rozpraszaniu roztworów pod małymi kątami. 45 Dalsze zalecane lektury znajdują się w sekcji Dyskusja. Rozpraszanie pod małym kątem wykorzystuje tak zwany wektor rozpraszania Q jako centralną wielkość opisującą proces rozpraszania. W artykule tym użyto powszechnie przyjętej definicji Q = 4π sin(θ)/λ, gdzie θ jest połową kąta między wiązką przychodzącą a rozproszoną, a λ jest długością fali promieniowania neutronowego w angstremach. Istnieją inne definicje, które używają różnych symboli, takich jak "s" dla wektora rozpraszania, i które mogą różnić się o czynnik 2π lub użycie nanometrów zamiast angstrema (zobacz także dyskusję na temat <silna klasa="xfig">Rysunek 10).

<table><tbody><tr><td>Koncentrator Amicon Ultra MWCO 50KDa&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Dwuzasadowy cytrynian amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>System bioreaktorów Bioflo 310</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td></td></tr> sprzęt <tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>składnik</td></tr> średni<tr><td>Karbenicylina</td><td>IBI Naukowy</td><td>antybiotyk</td><td>IB02025</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>EMD Milipore</td><td>3130</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu (II)</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II)</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>Średni składnik</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Drierite Gas Purifier</td><td>WA Hammond Drierite Co., Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disód, dihydrat</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>sprzęt</td></tr> <tr><td>i Auml; kta Purifier UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>sprzęt</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR kolumna</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza(III)</td><td>MP Biochemikalia</td><td>ICN19404590</td><td>składnik średni</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Monohydrat siarczanu manganu(II)</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Wytrząsarka inkubowana/z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>sprzęt</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-d25-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Wirówka RC 6 Plus</td><td>Sprzęt Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST inhibitor proteazy tabletki koktajlowe, Bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>średni składnik</td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy 25 mm z 0,2 i mikro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td> sprzęt <td>laboratoryjny</td></tr><tr><td>Sterylny jednorazowy filtr do butelek z 0,2 i mikro; m Membrana PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>Sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Kolumna Superose-12 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Gęstościomierz Ultrospec 10 komórek GE</td><td>Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>urządzenia</td></tr><tr><td>Siarczan jednowodny</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>Średni składnik</td></tr></tbody></table>

detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Biologiczny instrument do rozpraszania neutronów pod małym kątem w High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory jest przeznaczony do badania materiałów biologicznych, przetwarzania biopaliw i materiałów inspirowanych biologicznie, w skali od nanometrów do mikrometrów. Przedstawione tutaj metody badania właściwości fizycznych (tj. wielkości i kształtu) białek błonowych (w tym przypadku MmIAP, wewnątrzbłonowej proteazy aspartylowej z Methanoculleus marisnigri) w roztworach detergentów tworzących micele są dobrze dostosowane między innymi do tego instrumentu do rozpraszania neutronów pod małym kątem. Inne techniki charakterystyki biofizycznej są utrudnione ze względu na ich niezdolność do uwzględnienia udziału detergentu w złożonej strukturze białko-detergent. Dodatkowo, dostęp do Laboratorium Bio-Deuteracji zapewnia unikalne możliwości przygotowania upraw na dużą skalę i ekspresji białek znakowanych deuterem w celu wzmocnienia sygnału rozpraszania z białka. Chociaż technika ta nie zapewnia szczegółów strukturalnych w wysokiej rozdzielczości, luka w wiedzy strukturalnej na temat białek błonowych obejmuje wiele adresowalnych obszarów badań bez konieczności uzyskania rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Na przykład obszary te obejmują określanie stanów oligomerycznych, tworzenie kompleksów, zmiany konformacyjne podczas perturbacji oraz zdarzenia fałdowania/rozwijania. Badania te można łatwo przeprowadzić dzięki zastosowaniu tej metody.

Wniosek o czas dostępu do wiązki i wykorzystanie instrumentu powinien jasno przekazywać wszystkie informacje niezbędne dla komisji recenzenckiej, aby umożliwić rzetelną ocenę proponowanego eksperymentu. Niedoświadczonym użytkownikom zdecydowanie zaleca się kontakt z NSS. Specjalista NSS może ocenić wstępną wykonalność i pomóc w przygotowaniu wniosku, kładąc nacisk na realność przeprowadzenia badań, bezpieczeństwo oraz potencjał do uzyskania wysokiej jakości wyników naukowych. Informacje z...

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące integralnych białek błonowych, takich jak stan oligomeryczny, ich rozmiar, ogólny kształt i struktura o niskiej rozdzielczości w roztworze. Badania roztworów białek błonowych wymagają stabilizujących cząsteczek, takich jak detergenty. Technika ta ma tę zaletę, że sprawia, że detergenty stają się niewidoczne i podkreślają sygnał z białka błonowego.Implikacje tej techniki rozciągają się na wiele biologicznych i medycznych pytań badawczych, ponieważ ponad 1/3 białek znajduje się w błonach, gdzie pełnią wiele ważnych funkcji komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy znakowania deuterem i rozpraszania neutronów są trudne do nauczenia, ponieważ bardzo niewiele instytucji oferuje szkolenia w zakresie tych technik. Na początek określ gęstości długości rozpraszania neutronów lub SLD za pomocą aplikacji internetowej MULCh, modułów do analizy danych dotyczących zmienności kontrastu.Otwórz moduł kontrastu, klikając kontrast znajdujący się w lewym okienku nawigacji. Podaj tekst tytułu projektu i wprowadź poniżej szczegóły dotyczące dwóch komponentów jako podjednostki pierwszej i podjednostki drugiej. Wprowadź wzór cząsteczkowy dla każdego składnika w polu tekstowym formuły.Następnie wprowadź objętość w angstremach sześciennych dla każdego składnika w polu poniżej objętości. Na koniec wprowadź szczegóły składników bufora. Kliknij przycisk Prześlij, aby wykonać obliczenia kontrastu neutronów.Generowana jest strona wyników, która zawiera tabelę punktów dopasowania długości rozpraszania, gęstości i kontrastu, a także wzory do określania tych parametrów przy dowolnym procencie D2O w buforze. Przejrzyj parametry rozpraszania, zwracając szczególną uwagę na punkty dopasowania kontrastu komponentów. Hoduj komórki E. coli zawierające indukowalny wektor ekspresyjny dla docelowej sekwencji białka w pożywce LB do gęstości optycznej przy 600 nanometrach lub OD 600 około jednego.Dostosuj komórki E. coli do pożywki znakowanej deuterem przed zwiększeniem skali w celu nadekspresji zdeuterowanego białka, rozcieńczając kulturę LB od jednego do 20 w trzech mililitrach minimalnej pożywki. Po osiągnięciu OD 600 około jednego, powtórz od jednego do 20 rozcieńczeń, używając minimalnej pożywki zawierającej 50, 75 i 100% D2O. Po adaptacji kontynuuj hodowlę w bioreaktorze, aby zwiększyć wydajność deuterowanej masy komórkowej.Wraz ze wzrostem zawartości D2O tempo wzrostu będzie się zmniejszać. Przystąp do zbierania, lizy i oczyszczania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość z większą niż dwiema objętościami kolumny końcowego buforu wymiennego przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek.Po wstrzyknięciu próbki uruchomić kolumnę we frakcjach izolujących odpowiadających białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Zarezerwuj podwielokrotność dopasowanego bufora dla rozpraszania neutronów pod małym kątem lub odejmowania tła SANS. Aby zebrać dane SANS, najpierw załaduj próbki i do ogniw kwarcowych.Po upewnieniu się, że przesłona wiązki jest zamknięta, zbliż się do obszaru środowiska próbki i umieść ogniwa kwarcowe w podajniku próbek. Zapisać pozycję podajnika próbek dla każdej celi próbki. Sprawdź obszar i upewnij się, że ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód przed opuszczeniem obszaru środowiska próbki.Następnie otwórz żaluzję wiązki. Wykonaj skanowanie tabeli w celu automatycznego zbierania danych. Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi instrumentu dostarczonymi przez naukowca zajmującego się rozpraszaniem neutronów.Użyj oprogramowania Mantid Plot i skryptu Python do redukcji danych SANS z obrazu 2D do wykresu 1D. Aby to zrobić, zaloguj się do klastra zdalnej analizy i uruchom wykres Mantid z wiersza poleceń. Następnie otwórz dostarczony skrypt redukcyjny użytkownika i umieść odpowiednie numery skanowania lub identyfikację próbki w parach na odpowiedniej liście.Uruchom skrypt, aby wygenerować zredukowane dane jako czterokolumnowy plik tekstowy w określonej lokalizacji. Kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednią przestrzeń roboczą i wykres modliszki, a następnie wybierz wykres z błędami, aby wstępnie zbadać profile rozpraszania. Pobierz pakiet oprogramowania ATSAS i korzystaj z PRIMUS do wykreślania danych, skalowania i odejmowania oraz analizy Guiniera.Uruchom aplikację do analizy danych ATSAS, SAS i załaduj zredukowane pliki danych odpowiadające parze próbki i bufora. Aby odpowiednio przeskalować bufor, należy wybrać zakres danych w punkcie wysokiego Q, w którym oba profile są do siebie podobne na płasko i kliknąć przycisk skalowania znajdujący się pod zakładką operacji. Zwiększ zakres danych, aby wyświetlić wszystkie punkty, kliknij przycisk odejmij, aby wykonać tę operację.Wykonaj analizę Guiniera danych próbki odjętych od buforu, korzystając z zakładki analiza w aplikacji do analizy danych SAS. Upewnij się, że na liście został wybrany właściwy plik i kliknij promień bezwładności. Automatyczna próba wykonania dopasowania Guiniera zostanie zapewniona po kliknięciu przycisku auto RG.Rozszerz zakres danych używanych do uwzględnienia wszystkich danych o niskim Q i zacznij zawężać zakres danych, usuwając wysokie punkty Q, aż limit Q max razy RG spadnie poniżej 1,3. Użyj wykresu reszt, aby sprawdzić, czy dane są liniowe w zakresie dopasowania. Dokonaj niewielkich korekt w obszarze dopasowania i monitoruj wrażliwość tych wartości na zakres danych używanych w dopasowaniu.Uzyskaj funkcję rozkładu prawdopodobieństwa P z R w gnom. Teraz uruchom kreatora rozkładu odległości w zakładce analiza. Uzyskanie dobrego dopasowania do danych jest niezbędne do uzyskania modelu wysokiej jakości.Określ Dmax, maksymalną odległość międzyatomową w cząsteczce. Oszacuj wartość Dmax, usuwając zaznaczenie pola, aby wymusić wartość Rmax równą zero i wprowadzając dużą wartość Dmax. Pierwsze przecięcie X na wykresie P z R daje to oszacowanie.Wprowadź przyrostowe zmiany w tej wartości Dmax, a także w zakresie danych używanych do optymalizacji dopasowania gnoma do danych i wynikowej krzywej P R. Uruchom kreatora kształtu PRIMUS za pomocą przycisku dammif na karcie analizy danych SAS i użyj ręcznego wyboru parametrów. Zdefiniuj zakres Guiniera od dopasowania i przejdź do następnego kroku za pomocą przycisków nawigacyjnych.Zdefiniuj wartości dopasowania na podstawie wykresu P z R i przejdź do następnego kroku. Podaj parametry procesu modelowania ab initio. Następnie zainicjuj proces za pomocą przycisku zatwierdź.Nałóż i nałóż ostateczną obwiednię sans z powiązanym modelem o wysokiej rozdzielczości za pomocą supcomb w ATSAS. Umieść w katalogu roboczym kopię modelu PDB o wysokiej rozdzielczości, który ma być dopasowany do koperty SANS. Następnie uruchom supcomb z wiersza poleceń, używając nazw plików PDB jako dwóch argumentów ze strukturą szablonu wymienioną jako pierwszą.Na koniec wizualizuj wyniki modelu ab initio za pomocą PyMOL, programu do przeglądania grafiki molekularnej 3D. Po nałożeniu na siebie obwiedni SANS i struktury o wysokiej rozdzielczości, modele te można wizualizować za pomocą dowolnego programu do przeglądania grafiki molekularnej. Przedstawiono przegląd procesu wizualizacji PyMOL.Po otwarciu plików struktury PDB w PyMOL modele powinny być widoczne w oknie przeglądarki PyMOL. Reprezentacje każdego modelu można zmienić za pomocą przycisku S znajdującego się obok nazwy każdego pliku. W tym przypadku reprezentacja powierzchni jest używana dla obwiedni SANS, a reprezentacja kreskówkowa jest używana dla szkieletu białkowego modelu o wysokiej rozdzielczości.Odpowiednią kolorystykę można wybrać spośród opcji dostępnych pod przyciskiem C. W przypadku łańcuchów białkowych barwienie łuku łańcuchowego zapewnia gradient kolorów od końca N do C, aby ułatwić interpretację. Przezroczystość jest stosowana do reprezentacji powierzchni, aby umożliwić lepszą wizualizację struktury białka w obwiedni.W przypadku obrazów do publikacji zalecane jest białe tło. Po zastosowaniu tych wskazówek wizualizacyjnych struktury 3D można badać, klikając i przeciągając strukturę. Można dokonywać manipulacji perspektywą oraz rotacją i translacją cząsteczek.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym dopasowaniu kontrastu neutronowego grup głowicy i ogona detergentu z rozpuszczalnikiem D2O H2O. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do zbadania struktury wewnątrzbłonowych proteaz asparto. Białka te biorą udział w odpowiedzi immunologicznej, wirusowym zapaleniu wątroby typu C i chorobie Alzheimera.Nie zapominaj, że praca w laboratoriach biochemicznych i przy zakładach wykorzystujących wiązkę neutronów może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury obowiązkowe są środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej oraz przestrzeganie wszystkich zasad bezpieczeństwa w obiekcie i wpisów radiologicznych.

contrast-matching-detergent-small-angle-neutron-scattering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Jako przykład opisujemy protokół wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi za pomocą wiązania receptora sortującego, sortyliny, z pierwszą pętlą luminalną białka transportera glukozy, GLUT4.

Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Poznaj metodę SANS z dopasowaniem kontrastu detergentów do analizy strukturalnej białek błonowych. Technika ta umożliwia określenie stanu oligomerycznego, rozmiaru i kształtu białek w roztworze.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio (Wideo) | JoVE Journal

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Przeglądaj więcej filmów