Name: Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych nerwowych za pomocą zimnej plazmy atmosferycznej in vitro. Technika ta umożliwia bezpieczne kierowane różnicowanie komórek mysich do zastosowań w transplantologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Huazhong Scholar Program, Niezależny Fundusz Innowacji Uniwersytetu Nauki i Technologii Huazhong (nr 2018KFYYXJJ071) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31501099 i 51707012).

1. Hodowle komórkowe i predyferencjacja
<ol>
	<li>Hodowla nerwowych komórek macierzystych i preróżnicowanie
	<ol>
		<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną. Umieścić sterylne szkiełko nakrywkowe (o średnicy 20 mm) na płytkę 12-dołkową. Pokryj szkło nakrywkowe poli-D-lizyną, 0,1% w/v, w wodzie (tabela materiałów), aby uzyskać lepszą przyczepność komórek do szkiełek nakrywkowych, wykonując następujące czynności. 
		UWAGA: Dla każdej linii komórkowej i aplikacji należy określić optymalne warunki.
		<ol>
			<li>Aseptycznie pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego poli-D-lizyną o stężeniu 0,1% w/v w wodzie. Kołysz delikatnie, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
			<li>Po nocnym hodowli (~12 h) w temperaturze 37 °C usunąć roztwór poli-D-lizyny i spłukać powierzchnię 3x 1 ml sterylnej wody.</li>
			<li>Wysuszyć komórki co najmniej 30 minut przed ich wysiewem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla mysich nerwowych komórek macierzystych C17.2 (C17.2-NSC) i preróżnicowanie
	<ol>
		<li>Inkubować C17.2-NSC w kolbie o średnicy 25cm2 w zmodyfikowanym podłożu Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5% surowicą końską (HS) i 1% penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez ~ 2 - 3 dni.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 85% zbieżności, usuń pożywkę, przemyj komórki 1 ml PBS i dodaj 1 ml świeżej trypsyny (0,25%) do kolby. Pozostaw na 1 minutę; Następnie dodać 1 ml pożywki hodowlanej do kolby i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Policz gęstość komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 2 x 104 komórek/ml.</li>
		<li>Wysiewać C17.2-NSC na powlekanych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowej płytce o gęstości ~2 x 104 komórek na studzienkę. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. 
		UWAGA: Aby uzyskać lepszy wynik, przed eksperymentem immunofluorescencyjnym należy określić optymalną gęstość komórek.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 12 godzin, aby umożliwić przyłączenie.</li>
		<li>Po przyłączeniu przemyć komórki 2x 1 ml PBS i hodować komórki z pożywką różnicującą składającą się z DMEM/F12 z 1% suplementem N2 przez 48 godzin przed obróbką osocza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwotna hodowla nerwowych komórek macierzystych szczura i preróżnicowanie
	<ol>
		<li>Hodowla pierwotnej zawiesiny NSC szczura w pożywce wzrostowej NSC szczura w niepowlekanych kolbach T25 o gęstości 5 x 105 komórek. 
		UWAGA: Pierwotne szczurze NSC zostały wyizolowane zgodnie z protokołem Xie i wsp.9.</li>
		<li>Sprawdź powstawanie neurosfer pod odwróconym mikroskopem. Upewnij się, że morfologia neurosfer wykazuje kuliste i przezroczyste kompleksy wielokomórkowe.</li>
		<li>Gdy neurosfery osiągną średnicę 3 mm lub większą, przenieś zawiesinę neurosfery do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant, aby pozostawić neurosfery w minimalnej objętości pożywki.</li>
		<li>Przepłucz neurosfery 1x 5 ml PBS i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie. Usunąć supernatant, aby pozostawić minimalną objętość PBS.</li>
		<li>Dodaj odpowiednią objętość pożywki różnicującej, aby dostosować gęstość komórek do ~12 - 15 neurosfer na mililitr. Pożywka różnicująca dla pierwotnych NSC szczurów składa się z DMEM/F12, 2% B27 i 1% FBS.</li>
		<li>Umieść 1 ml zawiesiny neurosfery na każdym powlekanym szkiełku nakrywkowym na płytce 12-dołkowej. 
		UWAGA: Delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że neurosfery są równomiernie rozłożone. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania lepszego wyniku immunofluorescencji.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić do wstępnego różnicowania przez 24 godziny przed obróbką plazmową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie dysz plazmowych
<ol>
	<li>Wybierz półotwartą rurkę kwarcową o średnicy wewnętrznej 2 mm i średnicy zewnętrznej 4 mm. Włóż do rurki przewód wysokiego napięcia o średnicy 2 mm.</li>
	<li>Włóż rurkę kwarcową z przewodem wysokiego napięcia do strzykawki o pojemności 5 ml i użyj uchwytu, aby zamontować ją wewnątrz środka strzykawki. Ustaw odległość między uszczelnionym końcem rurki kwarcowej a końcówką strzykawki na 1 cm.</li>
	<li>Podłączyć rurkę z gumy silikonowej o długości 1 m (o średnicy wewnętrznej 12 mm) do otwartego końca strzykawki, a następnie podłączyć ją kolejno do przepływomierza i zaworu gazowego.</li>
</ol>
3. Przejęcie Jets
<ol>
	<li>Podłącz obwód, jak pokazano na Rysunek 1. Podłącz przewód wyjściowy zasilacza do urządzenia do strumienia plazmy, a następnie połącz końcówkę sondy wysokonapięciowej z przewodem wyjściowym, aby wykryć napięcie. Podłącz drugi koniec sondy wysokonapięciowej do oscyloskopu, aby zarejestrować informacje o napięciu wyjściowym. Sprawdź cały obwód i upewnij się, że zasilacz, oscyloskop i sonda wysokiego napięcia są uziemione.</li>
	<li>Sprawdź przewód gazowy. Upewnij się, że rura gazowa została podłączona do urządzenia do strumienia plazmy; następnie otwórz zawór gazowy helu (ułamek objętościowy, 99,999%) i tlenu (ułamek objętościowy, 99,999%) i ustaw przepływ gazu na 1 L: 0,01 l / min (He: O2). 
	UWAGA: Pozwól gazowi płynąć przez kilka minut przed pierwszym włączeniem zasilania.</li>
	<li>Ustaw amplitudę, częstotliwość i szerokość impulsu odpowiednio na 8 kV, 8 kHz i 1600 ns. Sprawdź ponownie obwód, a następnie włącz przycisk wyjścia, aby utworzyć strumień plazmy. 
	UWAGA: Nigdy nie dotykaj przewodu wysokiego napięcia.</li>
</ol>
4. Plazmowe leczenie nerwowych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Ustaw odległość między dyszą strzykawki a otworem w komorze na 15 mm. 
	UWAGA: Odległość jest mierzona od dołu platformy, na której umieszczona jest płytka 12-dołkowa.</li>
	<li>Wyjąć 12-dołkową płytkę z inkubatora i zmienić pożywkę z wstępnie zróżnicowanych komórek na 800 μl świeżej pożywki różnicującej.</li>
	<li>Podziel komórki na trzy grupy: nieleczoną grupę kontrolną, grupę leczoną przepływem gazu He-and-O2 (1%) przez 60 s i grupę leczoną osoczem 60 s. 
	UWAGA: Nie ma oczywistej utraty płynów w warunkach zabiegu.</li>
	<li>Umieść 12-dołkową płytkę pod dyszami plazmy, upewnij się, że dysza strzykawki jest zamocowana na środku każdego otworu i poddaj odpowiednią obróbkę różnym grupom wymienionym w kroku 4.3. 
	UWAGA: Niepoddane działaniu substancji kontrolnej trzymano w pożywce różnicującej w temperaturze pokojowej podczas procedury eksperymentalnej, aby zapewnić jednolite warunki leczenia. Grupa leczona przepływem gazu He-and-O2 (1%) była traktowana tylko przepływem gazu He i O2 (1%), bez wytwarzania plazmy. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.</li>
</ol>
5. Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy usunąć oryginalną kulturę i dodać 1 ml nowej pożywki różnicującej do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 dni. Zmieniać podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj stan różnicowania różnych grup pod mikroskopem światła z odwróconym kontrastem fazowym. Losowo wybierz co najmniej 12 pól i zrób zdjęcia, aby zarejestrować zmiany morfologiczne.</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Płukania
	<ol>
		<li>Wyjąć próbki z inkubatora komórkowego i usunąć pożywkę przez aspirację. Przepłukać komórki 1x 1 ml PBS. 
		UWAGA: Po różnicowaniu komórki łatwo się odłączają. Konieczne jest dodanie PBS od strony studzienek hodowlanych, aby uniknąć zmywania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu delikatnie spłucz komórki 3x 1 ml PBS po 5 minut każda, aby usunąć resztki 4% paraformaldehydu. 
		UWAGA: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek należy określić w zależności od typów komórek. Po utrwaleniu dodać 1 ml PBS od strony studzienek hodowlanych i pozostawić próbkę na stole na 5 minut. Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapewnić minimalną utratę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność
	<ol>
		<li>Próbki należy przepuszczać 0,2% TritonX-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po przepuszczalności delikatnie przepłukać komórki 1 ml PBS trzy razy po 5 minut każda. 
		UWAGA: Optymalny punkt czasowy przenikania komórek należy określić w zależności od typu komórek. Po przepuszczalności dodać 1 ml PBS od strony studzienek hodowlanych, pozostawić próbkę na stole na 5 minut. Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapewnić minimalną utratę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Do każdej próbki dodać 1 ml 10% surowicy koziej w PBS i pozostawić próbkę na stole na 1 godzinę, aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje. 
		UWAGA: Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapobiec odłączeniu się komórek od szkiełka. Na tym etapie płukanie nie jest konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą buforu do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych. 
		UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, ostateczny stosunek rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego należy określić za pomocą testu wstępnego. Proporcje rozcieńczenia anty-Nestin (dla niezróżnicowanych komórek macierzystych), anty-β-tubuliny III (dla neuronów), anty-O4 (dla oligodendrocytów), anty-NF200 (dla dojrzałych neuronów), anty-ChAT (dla neuronów cholinergicznych), anty-LHX3 (dla neuronów ruchowych), anty-GABA (dla neuronów GABA-ergicznych), anty-serotoniny (dla neuronów serotoninergicznych) i anty-TH (dla neuronów dopaminergicznych) wynoszą odpowiednio 1:80, 1:200, 1:100, 1:100, 1:100, 1:200 i 1:100.</li>
		<li>Zastosować 300 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych do różnych próbek.</li>
		<li>Próbki komórek inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Zaleca się inkubację przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 °C w celu zmniejszenia tła i barwienia niespecyficznego.</li>
		<li>Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i delikatnie przepłucz komórki 3x 1 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Cy3 lub Alexa Fluor 488 za pomocą 3% surowicy koziej w PBS. 
		UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, ostateczny stosunek rozcieńczenia przeciwciała drugorzędowego należy określić za pomocą testu wstępnego.</li>
		<li>Zastosuj 300 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, aby wykryć każde przeciwciało pierwszorzędowe. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w ciemności, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.</li>
		<li>Inkubować próbkę komórek w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń przeciwciała drugorzędowe i delikatnie przepłucz komórki 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie jądrowe
	<ol>
		<li>Zastosować 500 μl roztworu roboczego Hoechst 33258, aby zanurzyć próbkę komórki.</li>
		<li>Inkubować próbkę komórkową w ciemności przez 8 minut w temperaturze pokojowej, aby oznaczyć jądra.</li>
		<li>Delikatnie spłucz komórki 3x 1 ml PBS po 10 minut każda, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Aby zminimalizować utratę komórek, optymalny stan prania należy określić empirycznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Umieść jedną kroplę medium montażowego na środku mikroszkiełka.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka nakrywkowe (z próbkami) za pomocą pęsety i ostrożnie umieść próbkę na podłożu mocującym. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Usuń nadmiar nośnika montażowego za pomocą chłonnego papieru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja pod mikroskopem fluorescencyjnym
	<ol>
		<li>Obserwuj próbki pod mikroskopią fluorescencyjną wyposażoną w filtry do Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 i Cy3. Dla każdej próbki wybierz losowo co najmniej 8 - 12 pól i zarejestruj obrazy za pomocą kamery.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

C17.2-NSC to rodzaj unieśmiertelnionej linii nerwowych komórek macierzystych z komórek ziarnistej warstwy móżdżku noworodków myszy, opracowanej przez Snydera i innych 10,11. C17.2-NSC mogą różnicować się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty i są szeroko stosowane w neurobiologii12. W naszym poprzednim badaniu CAP mogą zwiększyć różnicowanie C17.2-NSC w neurony. Przeprowadzono również badanie potwierdzające słuszność zasady przy użyciu pi...

Ukierunkowane różnicowanie NSC w pewną linię transportu tkanek jest uważane za jedną z najbardziej obiecujących terapii chorób neurodegeneracyjnych i neurotraumatycznych1. Na przykład katecholaminergiczne neurony dopaminergiczne są szczególnie pożądane w leczeniu choroby Parkinsona (PD). Jednak tradycyjne metody przygotowania pożądanych komórek do transportu mają wiele wad, takich jak toksyczność chemiczna, tworzenie się blizn lub inne, co w dużej mierze utrudnia zastosowanie NSC w medycynie regeneracyjnej2. Dlatego bardzo ważne jest znalezienie nowatorskiego i bezpiecznego sposobu różnicowania NSC.
Plazma jest czwartym stanem materii, po stałym, ciekłym i gazowym, i stanowi ponad 95% materii w całym wszechświecie. Plazma jest elektrycznie obojętna z niezwiązanymi cząstkami dodatnimi/ujemnymi i obojętnymi i jest zwykle generowana przez wyładowanie wysokonapięciowe w laboratorium. W ciągu ostatnich dwóch dekad zastosowanie plazmy w biomedycynie przyciągnęło ogromną uwagę na całym świecie wraz z rozwojem technologii plazmy pod zimnym ciśnieniem atmosferycznym. Dzięki tej technice, stabilna plazma niskotemperaturowa może być generowana w otaczającym powietrzu w atmosferze bez tworzenia łuku i składa się z różnych reaktywnych form, takich jak reaktywne formy azotu (RNS), reaktywne formy tlenu (ROS), promieniowanie ultrafioletowe (UV), elektrony, jony i pole elektryczne3. Płytki o wysokiej odporności na mikroorganizmy mają wyjątkowe zalety w zakresie inaktywacji mikroorganizmów, terapii nowotworów, gojenia się ran, leczenia chorób skóry, proliferacji komórek i różnicowania komórek4,5,6,7. W poprzednich pracach wykazaliśmy, że strumień plazmy z zimnej atmosfery może zwiększyć różnicowanie NSC zarówno w mysich nerwowych komórkach macierzystych C17.2 (C17.2-NSC), jak i pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych szczurów, wykazując ogromny potencjał, aby stać się potężnym narzędziem do ukierunkowanego różnicowania NSCs8. Chociaż mechanizm wzmacniania zróżnicowania NSC w ramach WPR nie jest jeszcze w pełni poznany, udowodniono, że NO generowany przez CAP jest kluczowym czynnikiem w tym procesie. W tej pracy staramy się przedstawić szczegółowy protokół eksperymentalny wykorzystania strumienia plazmy helowo-tlenowej pod ciśnieniem atmosferycznym do leczenia NSC in vitro, przygotowania i wstępnego leczenia komórek, obserwacji morfologii za pomocą mikroskopu odwróconego oraz obserwacji barwienia immunofluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM podłoże</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 średni</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Surowicy konia dawcy</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>rozdartej w temperaturze -20 & stopni; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Hyklonu</td><td>penicyliny/Streptomycyny</td><td>SV30010</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>HyClone</td><td>trypsyny</td><td>25300054</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>Roztwór PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normalny roztwór blokujący surowicę kozią</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>anty-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-&beta;-Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-O4</td><td>R & Systemy D</td><td>MAB1326</td><td>przechowywane w temperaturze -20 &deg; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-NF200</td><td>Sigma</td><td></td><td>przechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td><td>przechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-LHX3</td><td>Sigma</td><td></td><td>przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>przechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-serotoniny</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>anty-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody Dibution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Cy3 Znakowany kozią anty-króliczą IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Oznakowany Goat</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>przechowywane w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Wysoko&ndash; napięcie Wzmacniacz mocy</td><td>Energia ukierunkowana</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego</td> Generator funkcyjny <td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>Sonda wysokonapięciowa</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Wraz z rozwojem technologii plazmy fizycznej, plazmy zimnej atmosfery (CAP) były szeroko badane w procesie dekontaminacji, leczenia raka, gojenia się ran, leczenia kanałowego itp., tworząc nową dziedzinę badań o nazwie medycyna plazmowa. Będąc mieszaniną elektrycznie, chemicznie i biologicznie reaktywnych, CAP wykazały swoje zdolności do zwiększania różnicowania nerwowych komórek macierzystych zarówno in vitro, jak i in vivo i stają się obiecującym sposobem leczenia chorób neurologicznych w przyszłości. O wiele bardziej ekscytującą wiadomością jest to, że zastosowanie CAP może umożliwić jednoetapowe i bezpiecznie ukierunkowane różnicowanie nerwowych komórek macierzystych (NSC) do transportu tkanek. Pokazujemy tutaj szczegółowy protokół eksperymentalny polegający na użyciu samodzielnie wykonanego urządzenia strumieniowego CAP w celu zwiększenia różnicowania NSC w C17.2-NSC i pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych szczura, a także obserwacji losu komórek za pomocą mikroskopii odwróconej i fluorescencyjnej. Za pomocą technologii barwienia immunofluorescencyjnego stwierdziliśmy, że oba NSC wykazywały przyspieszoną różnicę niż grupa nieleczona, a ~ 75% NSC selektywnie różnicowało się w neurony, które są głównie neuronami dojrzałymi, cholinergicznymi i ruchowymi.

Morfologię komórek obserwowano codziennie po zabiegu CAP za pomocą mikroskopu odwróconego. Rysunek 2 przedstawia typowe obrazy z mikroskopu świetlnego z kontrastem fazowym i odwróconym układem optycznym, ukazujące różnicowanie komórek w obu liniach komórkowych. Grupa poddana działaniu plazmy wykazuje przyspieszone tempo różnicowania oraz wysoki stopień różnicowania w porównaniu z grupą kontrolną i grupą przepływu gazu.
<p class="jove_con...

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych etapów eksperymentalnych leczenia komórkami macierzystymi układu nerwowego zimną plazmą atmosferyczną oraz wykrywania immunofluorescencji w celu poprawy różnicowania.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Metoda ta może zwiększyć różnicowanie nerwowych komórek macierzystych in vitro i przyczynić się do leczenia chorób neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona. Główną zaletą tej techniki jest to, że zimna plazma atmosferyczna może być stosowana w jednym kroku w celu bezpiecznego, ukierunkowanego różnicowania nerwowych komórek macierzystych do przeszczepu tkanek. Zimne osocze atmosferyczne może zwiększyć różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w krótkim okresie leczenia.I z potrzebą większego uszkodzenia komórek, zapewniając pożądane komórki do przeszczepu. Zacznij od wysiewu około pięć razy dziesięć do piątej mysich nerwowych komórek macierzystych w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Zawiera pięć mililitrów kompletnego DMEM przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla.Gdy komórki osiągną 85-procentową konfluencję, umyj kulturę jednym mililitrem PBS. Przed zabiegiem z jednym mililitrem 25 procent trypsyny przez jedną minutę. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki hodowlanej.I pipetować kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Po policzeniu rozcieńczyć komórki do stężenia dwa razy dziesięć do czwartego ogniwa na mililitr. Wysiewaj jeden mililitr komórek macierzystych na jednym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną na basenik w dziewięciu dołkach na 12-komórkową płytkę hodowlaną.Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. I włóż komórki z powrotem do inkubatora na 12 godzin. Gdy komórki się złączą, umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie i traktuj komórki pożywką różnicującą przez 48 godzin.W celu akwizycji strumienia najpierw podłącz przewód wyjściowy zasilacza do urządzenia strumieniowego plazmy. I końcówka sondy wysokiego napięcia z przewodem wyjściowym do wykrywania napięcia. Następnie podłącz drugi koniec sondy wysokiego napięcia do oscyloskopu, aby zarejestrować informacje z napięcia wyjściowego.Sprawdź cały obwód, aby upewnić się, że zasilacz, oscyloskop i sonda wysokiego napięcia są uziemione. I sprawdź przewód gazowy, aby upewnić się, że rura gazowa jest podłączona do urządzenia do strumienia plazmy. Następnie otwórz zawory helu i tlenu gazowego i ustaw przepływ gazu na stosunek helu do tlenu od jednego litra do 01 litra na minutę.Sprawdź ponownie obwód i naciśnij przycisk wyjścia, aby wytworzyć strumień plazmy. Aby leczyć plazmą nerwowe komórki macierzyste, ustaw odległość między dyszą strzykawki a pierwszym dołkiem komórek na 15 milimetrów. Zastąp supernatanty w hodowlach nerwowych komórek macierzystych 800 mikrolitrami świeżej pożywki różnicującej.I umieść płytkę pod dyszami plazmy. Upewnij się, że dysza strzykawki jest zamocowana nad środkiem każdej studzienki. Stwórz trzy studzienki z plazmą przez 60 sekund na zabieg i trzy studzienki z jednym procentem helu i tlenu gazowego przez 60 sekund na zabieg.Pozostawienie trzech studzienek niepoddanych obróbce, jako kontroli. Następnie zastąpić supernatanty jednym mililitrem świeżej pożywki różnicującej. I zwróć komórki do inkubatora na sześć dni.Codziennie sprawdzaj stan różnicowania różnych grup pod mikroskopem światła z odwróconym kontrastem fazowym. Po poddaniu działaniu substancji należy pozwolić komórkom na pełną równowagę w pożywce warunkowej przez około godzinę przed zastąpieniem supernatantu świeżą pożywką różnicującą. W celu analizy immunofluorescencyjnej utrwal kultury 500 mikrolitrami czteroprocentowego paraformaldehydu na studzienkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Następnie trzy delikatne pięciominutowe płukania, z jednym mililitrem PBS na pranie. Następnie należy przepuszczać utrwalone próbki za pomocą 2-procentowego Tritona X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie spłucz, jak pokazano.Po ostatnim praniu zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania jednym mililitrem 10-procentowej surowicy koziej w PBS na próbkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji oznacz komórki w każdej studzience 300 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie trzy prania w PBS, jak pokazano.Po ostatnim myciu oznacz komórki 300 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Następnie delikatnie płucz komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.Zobrazuj komórki na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiednie filtry. Nerwowe komórki macierzyste poddane działaniu osocza wykazują przyspieszone tempo różnicowania i wyższy współczynnik różnicowania w porównaniu z nieleczonymi komórkami macierzystymi poddanymi działaniu grupy kontrolnej i przepływem gazu. Po leczeniu osoczem stężenie Nestin zmniejsza się.Beta-tubulina III znacznie wzrasta. A O4 nieznacznie wzrasta w porównaniu z komórkami macierzystymi poddanymi działaniu grupy kontrolnej i leczonych przepływem gazu. Ponadto, po 60 sekundach leczenia osoczem, obserwuje się silną ekspresję markerów dojrzałego neuronu, neuronu cholinergicznego i neuronu ruchowego.Z bardzo małą liczbą neuronów GABA-ergicznych i serotoninergicznych oraz bez wykrytych neuronów dopaminergicznych. Podejmując się tych procedur, ważne jest, aby pamiętać, aby traktować komórki odpowiednią dawką osocza, ponieważ długi i intensywny okres leczenia osoczem wywoła apoptozę lub martwicę komórek. Pamiętaj również, aby wstępnie przetestować żywotność ogniw przed dalszym zastosowaniem.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Ten film pokazuje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, czyli hESC, bezpośrednio w neuronalne komórki progenitorowe bez użycia komórek zasilających lub jakichkolwiek etapów pośrednich. Selektywne hamowanie szlaków sygnałowych białka morfogenetycznego kości lub BMP i transformacji czynnika wzrostu-beta lub TGF-β prowadzi do różnicowania hESC w nerwowe komórki progenitorowe lub NPC.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe

Ten film przedstawia metodę wywoływania różnicowania w nerwowych komórkach macierzystych za pomocą zimnego plazmy atmosferycznej. Generuje to promieniowanie UV i reaktywne cząsteczki, które stymulują komórki nerwowe do wytwarzania wypustek, wskazujących na różnicowanie komórek neuronalnych.

Stymulacja różnicowania nerwowych komórek macierzystych za pomocą leczenia zimną plazmą atmosferyczną

Ten film pokazuje proces generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, a następnie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Ten proces generowania oligodendrocytów otwiera wiele możliwości poprawy badań i leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oligodendrocyty

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Generowanie zróżnicowanych typów komórek z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest bardzo obiecujące terapeutycznie, ale nadal stanowi wyzwanie. PSC często wykazują wrodzoną niezdolność do różnicowania, nawet gdy są stymulowane odpowiednim zestawem sygnałów. Opisane tutaj jest proste narzędzie do zwiększania różnicowania wieloliniowego w różnych liniach PSC.

Przejściowe leczenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych DMSO w celu promowania różnicowania

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych nerwowych za pomocą zimnej plazmy atmosferycznej in vitro. Technika ta umożliwia bezpieczne kierowane różnicowanie komórek mysich do zastosowań w transplantologii.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

Przeglądaj więcej filmów