Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych etapów eksperymentalnych leczenia komórkami macierzystymi układu nerwowego zimną plazmą atmosferyczną oraz wykrywania immunofluorescencji w celu poprawy różnicowania.

Metoda ta może zwiększyć różnicowanie nerwowych komórek macierzystych in vitro i przyczynić się do leczenia chorób neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona. Główną zaletą tej techniki jest to, że zimna plazma atmosferyczna może być stosowana w jednym kroku w celu bezpiecznego, ukierunkowanego różnicowania nerwowych komórek macierzystych do przeszczepu tkanek. Zimne osocze atmosferyczne może zwiększyć różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w krótkim okresie leczenia.

I z potrzebą większego uszkodzenia komórek, zapewniając pożądane komórki do przeszczepu. Zacznij od wysiewu około pięć razy dziesięć do piątej mysich nerwowych komórek macierzystych w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Zawiera pięć mililitrów kompletnego DMEM przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla.

Gdy komórki osiągną 85-procentową konfluencję, umyj kulturę jednym mililitrem PBS. Przed zabiegiem z jednym mililitrem 25 procent trypsyny przez jedną minutę. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki hodowlanej.

I pipetować kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Po policzeniu rozcieńczyć komórki do stężenia dwa razy dziesięć do czwartego ogniwa na mililitr. Wysiewaj jeden mililitr komórek macierzystych na jednym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną na basenik w dziewięciu dołkach na 12-komórkową płytkę hodowlaną.

Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. I włóż komórki z powrotem do inkubatora na 12 godzin. Gdy komórki się złączą, umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie i traktuj komórki pożywką różnicującą przez 48 godzin.

W celu akwizycji strumienia najpierw podłącz przewód wyjściowy zasilacza do urządzenia strumieniowego plazmy. I końcówka sondy wysokiego napięcia z przewodem wyjściowym do wykrywania napięcia. Następnie podłącz drugi koniec sondy wysokiego napięcia do oscyloskopu, aby zarejestrować informacje z napięcia wyjściowego.

Sprawdź cały obwód, aby upewnić się, że zasilacz, oscyloskop i sonda wysokiego napięcia są uziemione. I sprawdź przewód gazowy, aby upewnić się, że rura gazowa jest podłączona do urządzenia do strumienia plazmy. Następnie otwórz zawory helu i tlenu gazowego i ustaw przepływ gazu na stosunek helu do tlenu od jednego litra do 01 litra na minutę.

Sprawdź ponownie obwód i naciśnij przycisk wyjścia, aby wytworzyć strumień plazmy. Aby leczyć plazmą nerwowe komórki macierzyste, ustaw odległość między dyszą strzykawki a pierwszym dołkiem komórek na 15 milimetrów. Zastąp supernatanty w hodowlach nerwowych komórek macierzystych 800 mikrolitrami świeżej pożywki różnicującej.

I umieść płytkę pod dyszami plazmy. Upewnij się, że dysza strzykawki jest zamocowana nad środkiem każdej studzienki. Stwórz trzy studzienki z plazmą przez 60 sekund na zabieg i trzy studzienki z jednym procentem helu i tlenu gazowego przez 60 sekund na zabieg.

Pozostawienie trzech studzienek niepoddanych obróbce, jako kontroli. Następnie zastąpić supernatanty jednym mililitrem świeżej pożywki różnicującej. I zwróć komórki do inkubatora na sześć dni.

Codziennie sprawdzaj stan różnicowania różnych grup pod mikroskopem światła z odwróconym kontrastem fazowym. Po poddaniu działaniu substancji należy pozwolić komórkom na pełną równowagę w pożywce warunkowej przez około godzinę przed zastąpieniem supernatantu świeżą pożywką różnicującą. W celu analizy immunofluorescencyjnej utrwal kultury 500 mikrolitrami czteroprocentowego paraformaldehydu na studzienkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie trzy delikatne pięciominutowe płukania, z jednym mililitrem PBS na pranie. Następnie należy przepuszczać utrwalone próbki za pomocą 2-procentowego Tritona X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie spłucz, jak pokazano.

Po ostatnim praniu zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania jednym mililitrem 10-procentowej surowicy koziej w PBS na próbkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji oznacz komórki w każdej studzience 300 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie trzy prania w PBS, jak pokazano.

Po ostatnim myciu oznacz komórki 300 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Następnie delikatnie płucz komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Zobrazuj komórki na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiednie filtry. Nerwowe komórki macierzyste poddane działaniu osocza wykazują przyspieszone tempo różnicowania i wyższy współczynnik różnicowania w porównaniu z nieleczonymi komórkami macierzystymi poddanymi działaniu grupy kontrolnej i przepływem gazu. Po leczeniu osoczem stężenie Nestin zmniejsza się.

Beta-tubulina III znacznie wzrasta. A O4 nieznacznie wzrasta w porównaniu z komórkami macierzystymi poddanymi działaniu grupy kontrolnej i leczonych przepływem gazu. Ponadto, po 60 sekundach leczenia osoczem, obserwuje się silną ekspresję markerów dojrzałego neuronu, neuronu cholinergicznego i neuronu ruchowego.

Z bardzo małą liczbą neuronów GABA-ergicznych i serotoninergicznych oraz bez wykrytych neuronów dopaminergicznych. Podejmując się tych procedur, ważne jest, aby pamiętać, aby traktować komórki odpowiednią dawką osocza, ponieważ długi i intensywny okres leczenia osoczem wywoła apoptozę lub martwicę komórek. Pamiętaj również, aby wstępnie przetestować żywotność ogniw przed dalszym zastosowaniem.