Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oligodendrocyty

Zacznij od wysiewu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na pokrytej matrycą płytce wielodołkowej.

Środowisko macierzy zapobiega przedwczesnemu dojrzewaniu do wyspecjalizowanej komórki.

Dodać odpowiednią pożywkę konserwacyjną uzupełnioną dimetylosulfotlenkiem lub DMSO.

Leczenie DMSO zwiększa odpowiedź komórek na sygnały dojrzewania.

Następnie zastąp pożywkę pożywką do indukcji neuronalnej zawierającą specyficzne inhibitory.

Inhibitory blokują sygnały rozwoju komórek nienerwowych, kierując komórkami macierzystymi do przekształcenia się w neuronalne komórki progenitorowe lub NPC.

Zastąp pożywkę roztworem odrywającym, aby oddzielić NPC. Umieść żądaną liczbę komórek na innej płytce wielodołkowej.

Dodaj specyficzną dla komórki pożywkę różnicującą uzupełnioną DMSO, aby promować przekształcanie NPC w komórki prekursorowe oligodendrocytów lub OPC.

Zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania specyficzną dla komórki, aby ułatwić rozwój OPC w oligodendrocyty.

Aby przeprowadzić generowanie nerwowych komórek progenitorowych, należy wyhodować ludzkie komórki ES H1 i zróżnicować je w neuronalne komórki progenitorowe, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W dniu ujemnym 1 zasiewaj od 0,5 do 1 miliona komórek w pożywce podtrzymującej komórki ES do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, pokrytej roztworem matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu.

W dniu zero traktuj komórki przez 24 godziny pożywką podtrzymującą komórki ES, uzupełnioną 2% DMSO. W dniach od 1 do 6 zmień całe podłoże na ciepłe podłoże do indukcji neuronów zawierające inhibitory SMAD z komercyjnego zestawu. W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do odłączania komórek i płytkuje je w gęstości osadzenia od 1 do 2 x 10⁵ komórek na dołek na 24-dołkowej płytce.

Aby wygenerować komórki prekursorowe oligodendrocytów, umieść NPC w ciepłym pożywce do indukcji neuronów z inhibitorami SMAD z komercyjnego zestawu. W dniu 8 przygotuj roztwór 1% DMSO w pożywce różnicującej OPC i traktuj posiałe NPC przez 24 godziny. W dniu 9 zastąp pożywkę świeżą pożywką różnicującą OPC bez DMSO, a następnie podawaj komórki co drugi dzień do 15 dnia.

Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 15 dniem, przejdź je do gęstości wysiewu 1 do 2 x 10⁵ komórek na dołek. W dniu 14 płytek OPC w pożywce różnicującej OPC o gęstości 1 do 2 x 10⁵ komórek na dołek na płytce 24-dołkowej. W dniu 15 zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania OL.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień lub codziennie. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, podziel je w stosunku 1 do 3 na maksymalnie dwa przejścia lub do momentu, gdy podział komórek znacznie spowolni. Jeśli OPC dzielą się zbyt szybko i osiągają zbieg w czasie krótszym niż trzy dni, dodaj Ara-C w stężeniu od 2 do 5 mikromolów przez jeden do trzech dni.