Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste można skłonić do różnicowania się w neuronalne komórki progenitorowe, a następnie w astrocyty neuronów i oligodendrocyty. Jednak metoda hodowli typu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich różnicowanie w nerwowe komórki progenitorowe są bardzo nieefektywne i otwarte w systemie kohodowli in vivo Tutaj przedstawiamy ulepszony i solidny system hodowli, który jest łatwo skalowalny przy użyciu hodowli pojedynczej komórki o dużej gęstości z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi. Hodowla pojedynczych typów komórek ludzkich embrionalnych komórek macierzystych zapewnia szybki i wydajny system do badania mechanizmów molekularnych, które regulują wieloetapowe różnicowanie wzdłuż różnych i odrębnych zróżnicowanych linii, w tym nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie ich w dodatkowe linie nerwowe.

Zacznij od przygotowania płytek pokrytych macierzą błony podstawnej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Powoli rozmrażaj roztwór matrycy błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie do trzech godzin lub przez noc. Po rozmrożeniu rozcieńczyć matrycę w zimnym DMEM/F-12 do 2% dobrze wymieszać i pokryć każdą studzienkę sześciodołkowej płytki jednym mililitrem rozcieńczonego roztworu.

Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby przejść przez wolne od karmienia kultury ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu H9 wyhodowanych na matrycy błony podstawnej, należy odessać pożywkę ze studzienek i przemyć raz jednym mililitrem DPBS. Dodaj jeden mililitr roztworu Dispase do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Usuń Dispase i delikatnie umyj komórki raz dwoma mililitrami DMEM/F-12. Po umyciu usuń pożywkę i dodaj dwa mililitry DMEM/F-12 do każdej studzienki. Delikatnie odłącz kolonie, pipetując w górę iw dół, a następnie przenieś je do 15-mililitrowej probówki.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 370 razy g przez dwie minuty. Zassać pożywkę. Następnie zdysocjuj granulki komórkowe na pojedyncze komórki, dodając dwa mililitry roztworu do odrywania komórek i inkubując je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Powtórzyć wirowanie i usunąć roztwór odłączający. Zawiesić komórki w ludzkiej pożywce ESC mTeSR-1, delikatnie pipetując w górę i w dół. Aby przystosować ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu kolonijnego do hodowli pojedynczego typu komórkowego, umieść około 1,5 do dwóch milionów komórek w każdym dołku płytki pokrytej matrycą błony podstawnej w dwóch mililitrach mTeSR-1 zawierającego 10 mikromolowy inhibitor ROCK.

Po 24 godzinach zastąp pożywkę świeżym mTeSR-1 bez inhibitora ROCK. Pozwól komórkom rosnąć jako pojedynczy typ komórek przez trzy dni, zmieniając pożywkę codziennie. Czwartego dnia należy rozdzielić komórki w roztworze odłączającym i ponownie je płytkować, jak opisano wcześniej.

Po ponownym wyparowaniu i inkubacji komórek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, przenieś małe ciała embrionalne do 15-mililitrowej probówki, pozwól im osiąść na dnie i delikatnie usuń pożywkę za pomocą pipety. Przenieś je na pożywkę EB i pozwól im się rozrosnąć w naczyniach o niskiej przyczepce przez siedem dni. Aby wywołać różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych lub NPC, należy oddzielić ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu pojedynczego typu komórkowego za pomocą jednego mililitra roztworu oddzielającego i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Odwirowywać komórki przez dwie minuty w temperaturze 370 razy g. Usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Następnie ponownie zawieś komórki w DMEM/F-12.

Umieść komórki na sześciodołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o gęstości dwa razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w dwóch mililitrach mTeSR-1 z 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Po 24 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do indukcji neuronalnej uzupełnioną jedną mikromolową Dorsomorphiną i pięcioma SB431542 mikromolowymi. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez pierwsze cztery dni indukcji neuronalnej, a następnie codziennie, aż do osiągnięcia konfluencji w siódmym dniu.

Po siedmiu dniach indukcji neuronalnej rozdziel komórki, dodając jeden mililitr roztworu odłączającego i inkubując je przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować komórki w ilości 370 razy g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodaj jeden mililitr pożywki rozprężnej NPC i delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół, aby ponownie zawiesiły.

Następnie płytkę jeden razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w dwóch mililitrach pożywki ekspansacyjnej NPC na sześciodołkowych płytkach pokrytych matrycą membrany podstawnej. W razie potrzeby przechodź przez komórki, gdy hodowle osiągną 90% konfluencji, dodając 10 mikromolowych inhibitorów ROCK podczas pierwszych trzech do czterech pasaży. Zmieniaj medium co drugi dzień podczas rozbudowy.

Aby przygotować płytki pokryte lamininą PLO, rozcieńczyć roztwór podstawowy PLO w PBS lub wodzie do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr, dobrze wymieszać, a następnie pokryć każdą studzienkę płytki sześciodołkowej jednym mililitrem roztworu. Inkubować płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj każdą studzienkę PBS i natychmiast po niej pokryj każdą studzienkę jednym mililitrem roztworu lamininy przygotowanego zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

Trzymaj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Aby zróżnicować NPC w neurony dopaminergiczne, umieść komórki w naczyniach pokrytych lamininą PLO w pożywce ekspansyjnej NPC o gęstości około 50%Po 24 godzinach zmień pożywkę na DA1, a następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Aby przejść kultury, gdy osiągną zbieg, oddziel komórki za pomocą jednego mililitra roztworu odłączającego i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie odwirować je w temperaturze 370 razy g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki DA1 i płytkę jeden razy 10 do piątej komórki w dwóch mililitrach pożywki na sześciodołkowych płytkach pokrytych lamininą PLO. Aby zróżnicować NPC w astrocyty, umieść komórki na płytkach lamininowych PLO i pożywce ekspansywnej NPC o gęstości 50%, zmień pożywkę na pożywkę astrocytów po 24 godzinach i przeprowadź komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.

Kiedy ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu kolonijnego zostały przystosowane do hodowli pojedynczego typu komórkowego, stwierdzono, że komórki były w stanie utrzymać wysoką gęstość, a następnie łatwo i wydajnie subhodować po osiągnięciu konfluencji. Komórki te zachowały cechy cyklu komórkowego typowe dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu kolonijnego, takie jak krótka faza G1 i wysoki odsetek komórek w fazie S. Ilościowa analiza PCR potwierdziła również, że wykazują one ekspresję markerów ESC na poziomach porównywalnych do komórek typu kolonijnego.

Ponadto wykazano, że jednokomórkowe ludzkie embrionalne komórki macierzyste były zdolne do tworzenia ciał zarodkowych zawierających komórki ze wszystkich trzech listków rozrodczych: endodermy, mezodermy i ektodermy. Następnie wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste o pojedynczym typie komórek skutecznie różnicują się w NPC, na co wskazuje utrata typowej morfologii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i pojawienie się morfologii NPC. Różnicowanie zostało poparte zwiększoną ekspresją sygnaturowych markerów NPC i potwierdzone przez barwienie immunologiczne i analizę FACS.

Ta sama analiza wykazała również, że ponad 90% komórek było wybarwionych pozytywnie na obecność białek SOX1, PAX6 i NCAM. Co więcej, uzyskane NPC były w stanie różnicować się w neurony dopaminergiczne i astrocyty, na co wskazuje pojawienie się charakterystycznych morfologii i ekspresja markerów specyficznych dla linii. Podczas próby tej procedury konieczne jest pokrycie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych o dużej gęstości w celu utrzymania zdrowej, niezróżnicowanej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Protokół ten zapewnia platformę do prostej, solidnej i skalowalnej produkcji komórek progenitorowych i zróżnicowanych, które będą skalowalne do badań podstawowych, badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie neurodegeneracyjnej.