Name: Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj efektywną metodę różnicowania neuronalnego ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w hodowli jednokomórkowej. Ta skalowalna technika umożliwia badania mechanizmów molekularnych oraz zastosowania w medycynie regeneracyjnej i przesiewowych badaniach leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Carlowi D. Bortnerowi (NIEHS) za pomoc w analizie FACS. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 do AMJ.

1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą z membraną podstawną z kwalifikacją hESC
<ol>
	<li>Roztwór matrycy błony podstawnej zakwalifikowanej do hESC (patrz tabela materiałów) należy powoli rozmrażać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2–3 godziny lub przez noc, aby uniknąć tworzenia się żelu.</li>
	<li>Aby przygotować płyty pokryte matrycą membrany podstawnej, należy rozcieńczyć matrycę w zimnym DMEM/F12 do 2% stężenia końcowego. Dobrze wymieszać i pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego roztworu matrycowego.</li>
	<li>Inkubować płytki pokryte membraną podstawną w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 3 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Płytki z matrycą membrany podstawnej można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień przed usunięciem roztworu matrycy i użyciem płytek.</li>
</ol>
2. Adaptacja hESC typu kolonii do hodowli pojedynczych komórek hESC
<ol>
	<li>Aby przejść przez wolne od karmienia kultury hESC typu kolonii H9 (WA09) wyhodowane na macierzy błony podstawnej, należy zassać pożywkę z dołków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)9.</li>
	<li>Przemyć 1x 1 ml DPBS. Dodać 1 ml roztworu do dyspazy (1 j./ml) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Usuń papę, delikatnie umyj komórki 2 ml DMEM/F12, usuń pożywkę i dodaj 2 ml DMEM/F12 do każdej płytki.</li>
	<li>Delikatnie odłącz kolonie, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować granulki przez 2 minuty przy 370 x g i odessać pożywkę.</li>
	<li>Aby rozdzielić osady komórkowe na pojedyncze komórki, dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek (stężenie 1x, patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć roztwór oddzielający.</li>
	<li>Dodaj świeżą pożywkę mTeSR1 z ludzkim ESC i rozdziel komórki na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Aby dostosować hESC typu kolonijnego do hodowli jednokomórkowej, umieść około 1,5–2,0 x 106 hESC w każdym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej w 2 ml mTeSR1 zawierającej 10 μM inhibitora ROCK przez 24 godziny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Po 24 godzinach należy zastąpić pożywkę hESC świeżym mTeSR1 bez inhibitora ROCK i pozwolić hESC rosnąć jako typ jednokomórkowy przez 3 dni. Zmieniaj medium codziennie.</li>
	<li>W 4 dniu, gdy kultury osiągną prawie 100% konfluencję, zdysocjuj komórki w roztworze oddzielającym, a następnie ponownie plateruj, jak opisano w kroku 2.6. 
	UWAGA: Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność komórek podczas początkowych 24 godzin hodowli pojedynczych komórek typu hESC.</li>
</ol>
3. Formowanie się ciała zarodka i różnicowanie w trzy listki zarodkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Aby utworzyć EB, należy najpierw ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki mTeSR1 z 10 μM inhibitorem ROCK w ciągu pierwszych 24 godzin, a następnie inkubować przez noc w 60-milimetrowych naczyniach o niskim nakładzie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić agregację.</li>
	<li>Po 24 godzinach małe EB przenosi się do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól EB osiąść na dnie probówki i delikatnie usuń pożywkę za pomocą pipety. Przenieś EB do pożywki EB (knockout-DMEM uzupełniony 20% zamiennikiem surowicy nokautującej, 1x suplementem glutaminy [patrz Tabela Materiałów], 1% NEAA [aminokwasy endogenne; patrz Tabela Materiałów] i 0,2% β-merkaptoetanolu) i pozwól im się rozwijać w naczyniach o niskim nawiązaniu przez 7 dni. Pożywkę można wymieniać co drugi dzień, jak opisano powyżej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>W 7 dniu zbierz EB z szalek i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie usunąć pożywkę pipetą i przenieść EBs na 6-dołkową płytkę pokrytą membraną podstawną.</li>
	<li>Pozwól EB przyczepić się do płytki i inkubować przez 12 dni w pożywce EB, podczas których rozróżnicują się na trzy listki zarodkowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Zmieniaj podłoże co drugi dzień. 
	UWAGA: Podczas agregacji komórek niska miska z mocowaniem pomaga uniknąć przyłączenia EB.</li>
</ol>
4. Różnicowanie jednokomórkowych typu hESC na NPC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Aby wywołać różnicowanie NPC, należy zdysocjować jednokomórkowe hESC za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml DMEM/F12 i zawiesić komórki metodą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Komórki płytkowe na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o gęstości 2 x 10 5 komórek/studzienkę w 2 ml mTeSR1 zawierającego 10 μM inhibitora ROCK.</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do indukcji neuronalnej (DMEM z 1% B27 minus witamina A) uzupełnioną 1 μM dorsomorfiną i 5 μM SB431542.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez pierwsze 4 dni indukcji neuronalnej, a następnie codziennie, aż do osiągnięcia konfluencji w 7 dniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: (1) Dorsomorfina hamuje szlak BMP poprzez celowanie w receptory ALK2,3,6, a także hamuje AMPK; SB431542 jest inhibitorem szlaku TGFβ/aktywina poprzez celowanie w ALK5,7. (2) Ten sam protokół został przetestowany z inną linią ESC (WA01), która dała podobne wyniki jak WA0916. (3) Generalnie używaliśmy Matrigelu do matrycy błony podstawnej; jednak komórki mogą być hodowane na Geltrex, a następnie różnicowane w NPC z bardzo podobnymi wynikami, na co wskazuje ekspresja kilku markerów NPC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D, E). Z lekiem Geltrex należy obchodzić się w taki sam sposób jak z lekiem Matrigel (patrz punkt 1).</li>
</ol>
5. Ekspansja NPC i kriokonserwacja
<ol>
	<li>Po 7 dniach indukcji neuronalnej rozdzielić komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki ekspandującej NPC (patrz Tabela Materiałów) i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek w 2 ml pożywki ekspansywnej NPC na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej.</li>
	<li>W razie potrzeby przechodź z NPC wiele razy, gdy kultury osiągną prawie 90% zbieżności. Podczas pierwszych 3-4 pasaży dodaj 10 μM inhibitora ROCK w ciągu pierwszych 24 godzin, aby zapobiec śmierci komórki. Po tych pasażach komórki mogą być pasażowane i hodowane bez inhibitora ROCK. Zmieniaj medium co drugi dzień podczas rozbudowy.</li>
	<li>Kriokonserwuj NPC, gdy kultury osiągną zbieg.
	<ol>
		<li>W celu kriokonserwacji należy rozdzielić komórki w 1 ml roztworu oddzielającego (1x) przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirować zawiesinę przez 2 minuty przy 370 x g w celu usunięcia roztworu oddzielającego.</li>
		<li>Dodać roztwór do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów) do zdysocjowanych NPC w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i rozprowadzić 1 ml porcji do kriowialiów.</li>
		<li>Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania i przechowuj je przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowuj kriowiale w ciekłym azocie.</li>
</ol>
6. Przygotowanie płytek pokrytych poli-L-ornityną (PLO) i lamininą
<ol>
	<li>Aby przygotować płytki powlekane PLO/lamininą, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy PLO w PBS lub wodzie do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dobrze wymieszać i pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego roztworu PLO.</li>
	<li>Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy lamininy w zimnym PBS lub wodzie o stężeniu 10 μg/ml. Dobrze wymieszaj roztwór lamininy. Usunąć PBS i natychmiast pokryć każdą studzienkę 1 ml roztworu lamininy. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia. Przemyć PBS i natychmiast dodać pożywkę hodowlaną. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby płytki pokryte PLO/lamininą wyschły.</li>
</ol>
7. Różnicowanie NPC pochodzących z hESC na neurony dopaminergiczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A)
<ol>
	<li>Płytka NPC w naczyniach pokrytych PLO/lamininą w podłożu ekspandacyjnym NPC o gęstości około 50%.</li>
	<li>Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę DA1 (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2 mM suplementu glutaminy, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/ml SHH i 100 ng/ml FGF8) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.</li>
	<li>Kultury przejścia, gdy osiągną zbieg. Dysocjować komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki DA1 i zawiesić komórki metodą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek w 2 ml pożywki DA1 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PLO/lamininą.</li>
	<li>Po 10 dniach zmień pożywkę na DA2 (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2 mM suplementu glutaminy, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM kwasu askorbinowego, 20 ng/ml BDNF i 20 ng/ml GNDF) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień przez dodatkowe 20 dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). 
	UWAGA: Codziennie dodawaj świeży kwas askorbinowy do podłoża DA2. W ciągu pierwszych 14 dni zróżnicowane komórki powinny zostać przepuszczone, gdy osiągną 90% zbieżności, ale nie już po tym.</li>
</ol>
8. Różnicowanie NPC pochodzących z ESC na astrocyty
<ol>
	<li>Płytki nerwowych komórek progenitorowych na płytkach pokrytych PLO/lamininą w podłożu ekspandującym NPC o gęstości około 50%.</li>
	<li>Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę astrocytów (pożywka DMEM/F12 w tym 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/ml IGF, 10 ng/ml aktywiny A, 10 ng/ml hereguliny β-1 i 8 ng/ml bFGF) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.</li>
	<li>Kultury przejścia, gdy osiągną zbieg. Dysocjować komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki dla astrocytów i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek w 2 ml pożywki astrocytowej na 6 dołkach pokrytych PLO/lamininą.</li>
	<li>Pozwól, aby różnicowanie trwało w sumie przez 5–6 tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
</ol>
9. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Hodować komórki w szalkach μ o średnicy 35 mm, jak opisano powyżej dla każdego typu komórek. Odessać pożywkę i dodać 1 ml 4% roztworu PFA na szalkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć 2x przez 5 min PBS. 
	UWAGA: Po utrwaleniu komórek płytki testowe można uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zabarwić przeciwciałem w ciągu 1 tygodnia po utrwaleniu.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu blokującego (surowica kozia lub ośle w PBS) na miskę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30–60 minut.</li>
	<li>Myj naczynie 2x PBS przez 5 min.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (tabela 1) (rozcieńczonego w roztworze blokującym) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć 2x PBS przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 300 μl fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego (tabela 1) w roztworze blokującym i inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze suchej.</li>
	<li>Myj komórki 2x przez 10 min PBS.</li>
	<li>Dodać roztwór barwiący Hoechst (1 μM końcowe stężenie w PBS) do barwienia jąder. Inkubować komórki w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myj komórki 1x PBS przez 5 min, a następnie dodaj 500 μL PBS. Trzymaj naczynia w ciemności, a następnie obserwuj fluorescencję za pomocą mikroskopu konfokalnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B, <silna klasa="xfig">Rysunek 5C, <silna klasa="xfig">Rysunek 6A, oraz <silna klasa="xfig">Rysunek 7B).</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li>
<li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li>
<li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li>
<li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus%3A+From+Stem+Cells+to+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li>
<li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartung%2C+O+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. 14 (1), Chapter 1 Unit 1C 10(2010).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li>
<li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li>
<li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148(2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li>
<li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167(2011).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715(2012).</li>
<li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal%2C+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li>
<li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Skalowalne i skuteczne metody różnicowania hESC w różne linie genetyczne oraz generowanie wystarczającej liczby zróżnicowanych komórek są ważnymi kryteriami badań przesiewowych leków i terapii komórkami macierzystymi. Opublikowano różne metody przekazywania pojedynczych komórek, w których komórki są hodowane w obecności inhibitora ROCK lub innych małych cząsteczek w celu poprawy przeżywalności, ale produktami końcowymi tych metod hodowli są hESC typu kolonijnego 17,18,19,20,21.<sup clas...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mają potencjał do różnicowania się w trzy główne listki zarodkowe, które następnie różnicują się w różne multipotencjalne linie komórek progenitorowych. Te linie następnie dają początek wszystkim typom komórek w ludzkim ciele. Systemy hodowli hESC in vitro zmieniły możliwości badania rozwoju embrionalnego człowieka i posłużyły jako cenne narzędzie do uzyskania nowych informacji na temat tego, w jaki sposób procesy te są regulowane na poziomie biologicznym i molekularnym. Podobnie, badania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) powstałych w wyniku przeprogramowania komórek somatycznych wyizolowanych od ludzkich pacjentów dostarczają nowych informacji na temat różnych chorób. Ponadto komórki progenitorowe i zróżnicowane pochodzące z hESC mogą być przydatne w badaniach obejmujących terapię komórkami macierzystymi i badania przesiewowe leków1,2,3,4.
hESC mogą być indukowane do różnicowania się w neuronalne komórki progenitorowe (NPC), które są komórkami wielopotencjałowymi o dużej zdolności do samoodnawiania. Następnie komórki te mogą być różnicowane w neurony, astrocyty i oligodendrocyty5,6. NPC oferują również system komórkowy do badań in vitro biologii neurorozwojowej i różnych chorób neurologicznych. Jednak obecne metody hodowli typu kolonii z udziałem hESC i różnicowania ich w NPC są nieefektywne i często obejmują kokulturę, a także tworzenie ciała zarodka (EB) i rozety5,7,8,9. Protokoły te wykazują niższe wskaźniki przeżycia i spontanicznego różnicowania oraz są bardziej czasochłonne.
Prezentowany tutaj jest ulepszony i solidny system hodowli, który jest łatwo skalowalny i wykorzystuje hodowlę pojedynczych komórek hESC o wysokiej gęstości10. Włączenie inhibitora kinazy Roh (ROCK) przyczyniło się do znacznego zwiększenia wydajności przeżycia podczas hodowli pojedynczych typów komórek hESC10,11,12,13,14. W tym systemie hodowli hESC mogą być łatwo utrzymywane i rozwijane. Ponadto protokół przedstawia wydajną metodę generowania NPC z jednokomórkowych hodowli typu hESC, co pozwala na produkcję NPC o wysokiej czystości. Hamowanie szlaków sygnałowych BMP/TGFβ/aktywiny za pomocą inhibitorów ALK skutecznie indukuje różnicowanie jednokomórkowych hESC typu na NPC15,16, które następnie można skłonić do różnicowania się w funkcjonalne linie nerwowe, takie jak neurony dopaminergiczne i astrocyty.
Podsumowując, protokół hodowli pojedynczych komórek z wykorzystaniem hESC oferuje atrakcyjny model do badania różnicowania tych komórek w różne linie, w tym NPC. Protokół ten jest łatwo skalowalny i dlatego nadaje się do generowania komórek do badań obejmujących terapię regeneracyjną i badania przesiewowe leków.

<table><tbody><tr><td>Szalki M 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td>Roztwór do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D system</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement (-Vit A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Stosowane materiały biologiczne</td><td>Z100065</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Wirówka Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td></td> Inkubator CO2 <td>DAMON/ICE</td><td>428-6759</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matryca z kluzowaniem hESC (Magrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matryca membrany podstawnej (używana w większości protokołu tutaj)</td></tr><tr><td>Cryostor CS 10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>Roztwór do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569-010</td> DMEM/F12 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Tocris</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-16A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Stosowane materiały biologiczne</td><td>Z101705</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Applied Biological Materials</td><td>Z101057</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex matrix</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td>Macierz błony podstawnej</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td>Suplement glutaminy, 100X</td></tr><tr><td>H9 (WA09) ludzka linia embrionalnych komórek macierzystych</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Heregulina b-1</td><td>Peprotech</td><td>100-3</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Knockout</td><td>DMEM Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum do nokautu</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td>pożywka hodowlana hESC</td></tr><tr><td>suplement N2</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>Stosowane materiały biologiczne</td><td>Z200617</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla progenitorów nerwowych Stemdiff</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5833</td><td>Pożywka ekspandująca NPC</td></tr></tbody></table>

efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Różnicowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) zmieniło zdolność do badania rozwoju człowieka zarówno na poziomie biologicznym, jak i molekularnym oraz dostarczyło komórek do wykorzystania w zastosowaniach regeneracyjnych. Standardowe metody hodowli hESC wykorzystujące hodowlę typu kolonii w celu utrzymania niezróżnicowanych komórek zarodkowych oraz tworzenia ciał zarodkowych (EB) i rozet w celu różnicowania się w różne listki zarodkowe są nieefektywne i czasochłonne. Przedstawiono metodę hodowli jednokomórkowej z wykorzystaniem hESC zamiast hodowli typu kolonijnego. Metoda ta pozwala na utrzymanie cech charakterystycznych niezróżnicowanych komórek macierzystych, w tym ekspresji markerów hESC na poziomach porównywalnych z ludzkimi komórkami macierzystymi. Ponadto w protokole przedstawiono skuteczną metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) z pojedynczych komórek hESC, które wytwarzają NPC w ciągu 1 tygodnia. Komórki te wykazują wysoką ekspresję kilku genów markerowych NPC i mogą różnicować się w różne typy komórek nerwowych, w tym neurony dopaminergiczne i astrocyty. Ten system hodowli pojedynczych komórek dla hESC będzie przydatny w badaniu molekularnych mechanizmów tych procesów, badaniach niektórych chorób i badaniach przesiewowych odkrywania leków.

Prezentowany tutaj jest ulepszony protokół utrzymania i rozwoju hodowli pojedynczych komórek hESC oraz ich efektywnego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe, które następnie różnicują się w różne dalsze linie nerwowe, w tym neurony dopaminergiczne i astrocyty.
Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego pokazują morfologię komórek na różnych etapach adaptacji komórek typu kolonijnego do hodowli jednokomórkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Poprzez warunki hodowli p...

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste można skłonić do różnicowania się w neuronalne komórki progenitorowe, a następnie w astrocyty neuronów i oligodendrocyty. Jednak metoda hodowli typu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich różnicowanie w nerwowe komórki progenitorowe są bardzo nieefektywne i otwarte w systemie kohodowli in vivo Tutaj przedstawiamy ulepszony i solidny system hodowli, który jest łatwo skalowalny przy użyciu hodowli pojedynczej komórki o dużej gęstości z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi. Hodowla pojedynczych typów komórek ludzkich embrionalnych komórek macierzystych zapewnia szybki i wydajny system do badania mechanizmów molekularnych, które regulują wieloetapowe różnicowanie wzdłuż różnych i odrębnych zróżnicowanych linii, w tym nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie ich w dodatkowe linie nerwowe.Zacznij od przygotowania płytek pokrytych macierzą błony podstawnej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Powoli rozmrażaj roztwór matrycy błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie do trzech godzin lub przez noc. Po rozmrożeniu rozcieńczyć matrycę w zimnym DMEM/F-12 do 2% dobrze wymieszać i pokryć każdą studzienkę sześciodołkowej płytki jednym mililitrem rozcieńczonego roztworu.Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby przejść przez wolne od karmienia kultury ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu H9 wyhodowanych na matrycy błony podstawnej, należy odessać pożywkę ze studzienek i przemyć raz jednym mililitrem DPBS. Dodaj jeden mililitr roztworu Dispase do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Usuń Dispase i delikatnie umyj komórki raz dwoma mililitrami DMEM/F-12. Po umyciu usuń pożywkę i dodaj dwa mililitry DMEM/F-12 do każdej studzienki. Delikatnie odłącz kolonie, pipetując w górę iw dół, a następnie przenieś je do 15-mililitrowej probówki.Odwirować probówkę o ciśnieniu 370 razy g przez dwie minuty. Zassać pożywkę. Następnie zdysocjuj granulki komórkowe na pojedyncze komórki, dodając dwa mililitry roztworu do odrywania komórek i inkubując je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Powtórzyć wirowanie i usunąć roztwór odłączający. Zawiesić komórki w ludzkiej pożywce ESC mTeSR-1, delikatnie pipetując w górę i w dół. Aby przystosować ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu kolonijnego do hodowli pojedynczego typu komórkowego, umieść około 1,5 do dwóch milionów komórek w każdym dołku płytki pokrytej matrycą błony podstawnej w dwóch mililitrach mTeSR-1 zawierającego 10 mikromolowy inhibitor ROCK.Po 24 godzinach zastąp pożywkę świeżym mTeSR-1 bez inhibitora ROCK. Pozwól komórkom rosnąć jako pojedynczy typ komórek przez trzy dni, zmieniając pożywkę codziennie. Czwartego dnia należy rozdzielić komórki w roztworze odłączającym i ponownie je płytkować, jak opisano wcześniej.Po ponownym wyparowaniu i inkubacji komórek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, przenieś małe ciała embrionalne do 15-mililitrowej probówki, pozwól im osiąść na dnie i delikatnie usuń pożywkę za pomocą pipety. Przenieś je na pożywkę EB i pozwól im się rozrosnąć w naczyniach o niskiej przyczepce przez siedem dni. Aby wywołać różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych lub NPC, należy oddzielić ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu pojedynczego typu komórkowego za pomocą jednego mililitra roztworu oddzielającego i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Odwirowywać komórki przez dwie minuty w temperaturze 370 razy g. Usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Następnie ponownie zawieś komórki w DMEM/F-12.Umieść komórki na sześciodołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o gęstości dwa razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w dwóch mililitrach mTeSR-1 z 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Po 24 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do indukcji neuronalnej uzupełnioną jedną mikromolową Dorsomorphiną i pięcioma SB431542 mikromolowymi. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez pierwsze cztery dni indukcji neuronalnej, a następnie codziennie, aż do osiągnięcia konfluencji w siódmym dniu.Po siedmiu dniach indukcji neuronalnej rozdziel komórki, dodając jeden mililitr roztworu odłączającego i inkubując je przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować komórki w ilości 370 razy g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodaj jeden mililitr pożywki rozprężnej NPC i delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół, aby ponownie zawiesiły.Następnie płytkę jeden razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w dwóch mililitrach pożywki ekspansacyjnej NPC na sześciodołkowych płytkach pokrytych matrycą membrany podstawnej. W razie potrzeby przechodź przez komórki, gdy hodowle osiągną 90% konfluencji, dodając 10 mikromolowych inhibitorów ROCK podczas pierwszych trzech do czterech pasaży. Zmieniaj medium co drugi dzień podczas rozbudowy.Aby przygotować płytki pokryte lamininą PLO, rozcieńczyć roztwór podstawowy PLO w PBS lub wodzie do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr, dobrze wymieszać, a następnie pokryć każdą studzienkę płytki sześciodołkowej jednym mililitrem roztworu. Inkubować płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj każdą studzienkę PBS i natychmiast po niej pokryj każdą studzienkę jednym mililitrem roztworu lamininy przygotowanego zgodnie ze wskazówkami rękopisu.Trzymaj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Aby zróżnicować NPC w neurony dopaminergiczne, umieść komórki w naczyniach pokrytych lamininą PLO w pożywce ekspansyjnej NPC o gęstości około 50%Po 24 godzinach zmień pożywkę na DA1, a następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Aby przejść kultury, gdy osiągną zbieg, oddziel komórki za pomocą jednego mililitra roztworu odłączającego i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie odwirować je w temperaturze 370 razy g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki DA1 i płytkę jeden razy 10 do piątej komórki w dwóch mililitrach pożywki na sześciodołkowych płytkach pokrytych lamininą PLO. Aby zróżnicować NPC w astrocyty, umieść komórki na płytkach lamininowych PLO i pożywce ekspansywnej NPC o gęstości 50%, zmień pożywkę na pożywkę astrocytów po 24 godzinach i przeprowadź komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.Kiedy ludzkie embrionalne komórki macierzyste typu kolonijnego zostały przystosowane do hodowli pojedynczego typu komórkowego, stwierdzono, że komórki były w stanie utrzymać wysoką gęstość, a następnie łatwo i wydajnie subhodować po osiągnięciu konfluencji. Komórki te zachowały cechy cyklu komórkowego typowe dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu kolonijnego, takie jak krótka faza G1 i wysoki odsetek komórek w fazie S. Ilościowa analiza PCR potwierdziła również, że wykazują one ekspresję markerów ESC na poziomach porównywalnych do komórek typu kolonijnego.Ponadto wykazano, że jednokomórkowe ludzkie embrionalne komórki macierzyste były zdolne do tworzenia ciał zarodkowych zawierających komórki ze wszystkich trzech listków rozrodczych: endodermy, mezodermy i ektodermy. Następnie wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste o pojedynczym typie komórek skutecznie różnicują się w NPC, na co wskazuje utrata typowej morfologii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i pojawienie się morfologii NPC. Różnicowanie zostało poparte zwiększoną ekspresją sygnaturowych markerów NPC i potwierdzone przez barwienie immunologiczne i analizę FACS.Ta sama analiza wykazała również, że ponad 90% komórek było wybarwionych pozytywnie na obecność białek SOX1, PAX6 i NCAM. Co więcej, uzyskane NPC były w stanie różnicować się w neurony dopaminergiczne i astrocyty, na co wskazuje pojawienie się charakterystycznych morfologii i ekspresja markerów specyficznych dla linii. Podczas próby tej procedury konieczne jest pokrycie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych o dużej gęstości w celu utrzymania zdrowej, niezróżnicowanej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.Protokół ten zapewnia platformę do prostej, solidnej i skalowalnej produkcji komórek progenitorowych i zróżnicowanych, które będą skalowalne do badań podstawowych, badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie neurodegeneracyjnej.

efficient-neural-differentiation-using-single-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film pokazuje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, czyli hESC, bezpośrednio w neuronalne komórki progenitorowe bez użycia komórek zasilających lub jakichkolwiek etapów pośrednich. Selektywne hamowanie szlaków sygnałowych białka morfogenetycznego kości lub BMP i transformacji czynnika wzrostu-beta lub TGF-β prowadzi do różnicowania hESC w nerwowe komórki progenitorowe lub NPC.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj efektywną metodę różnicowania neuronalnego ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w hodowli jednokomórkowej. Ta skalowalna technika umożliwia badania mechanizmów molekularnych oraz zastosowania w medycynie regeneracyjnej i przesiewowych badaniach leków.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów