Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak zrozumienie zmian ekspresji genów w tysiącach pojedynczych komórek po urazie lub chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na analizę transkryptomów poszczególnych komórek w złożonej tkance i lepsze docenienie dynamiki funkcjonalnej w danej populacji. Zaletą naszego protokołu jest to, że zapewnia kompleksowe metody, od izolacji pojedynczych komórek w tkankach pierwotnych, po analizę i wizualizację tego zestawu danych.

Chociaż metoda ta zaczyna się od zawiesin jednokomórkowych ze skóry i nerwu, opisane przez nas metody sekwencjonowania można zastosować do badania dowolnej tkanki ssaków. Tę procedurę zademonstrują Elodie Labit i Wisoo Shin, dwoje stażystów z mojego laboratorium. Na początek przeprowadź sekcję nerwu kulszowego myszy poddanej eutanazji, najpierw odcinając skórę od tylnej części grzbietu myszy.

Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż uda. Następnie użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby odsłonić i usunąć nerw kulszowy. Aby wypreparować skórę grzbietu pleców, użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać nacięcia od ramienia do ramienia, w poprzek zadu i w dół pleców.

Umyj chusteczki dwukrotnie lodowatym HBSS. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń niechcianą tkankę łączną, złogi tłuszczu lub zanieczyszczenia. Tylko w przypadku skóry pokrój ją w cienkie plasterki za pomocą sterylnego ostrza skalpela.

Aby uzyskać skórę właściwą, należy spławić plastry skóry w dyspazie, w HBSS w 10-centymetrowym naczyniu, przez 30 do 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj cienkich kleszczyków, aby obrać i oddzielić naskórek od skóry właściwej, a następnie wyrzuć naskórek. Następnie, w przypadku skóry i nerwów, użyj pary sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić każdą próbkę na kawałki o długości od jednego do dwóch milimetrów.

Umieść kawałki tkanki w świeżo rozmrożonym, dwa gramy na mililitr zimnego enzymu kolagenazy-czterech w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Inkubować każdą próbkę w enzymie w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie wstrząsając co 10 minut. Po 30 minutach użyj pipetera P1000, aby rozcierać tkankę 20 do 30 razy i wróć do łaźni wodnej.

Powtarzaj rozcieranie co 30 minut, aż roztwór stanie się mętny, a kawałki tkanki zostaną w dużej mierze zdysocjowane. Tylko w przypadku skóry, w ostatniej godzinie inkubacji, dodać jeden miligram na mililitr DNAzy do próbki skóry. Ponieważ niektóre typy komórek są bardziej wrażliwe niż inne na stres mechaniczny, nadmierne techniki dysocjacji mogą wpływać na populację.

Ogólna dysocjacja ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności komórek i dokładnego odwzorowania składu tkanki. Następnie użyj filtra o długości 40 mikrometrów na 50-mililitrowej stożkowej rurce, aby dwukrotnie przefiltrować każdą próbkę tkanki. Przepłukać filtr jednym procentem BSA/HBSS.

Po odwirowaniu próbek zgodnie z opisem w manuskrypcie, ponownie zawiesić osad komórkowy w HBSS, zawierający jeden procent BSA, za pomocą końcówki o szerokim otworze i umieścić na lodzie. Dodatek barwnika żywotności pomoże Ci zoptymalizować przygotowanie. Powinieneś dążyć do co najmniej 80 procent żywotnych komórek.

Po optymalizacji ten i inne etapy kontroli jakości można pominąć, aby przyspieszyć proces dysocjacji, co pozwoli lepiej zachować jakość RNA i zmniejszyć utratę komórek. Aby wyizolować żywotne i zdrowe komórki za pomocą FACS, najpierw przygotuj 15-mililitrowe probówki z wąskim dnem z ośmioma mililitrami lodowatego jednego procenta BSA/HBSS do pobierania próbek. Aby upewnić się, że powierzchnia styku cieczy z wnętrzem probówki jest wilgotna oraz aby zapobiec napięciu statycznemu i powierzchniowemu, odwróć probówki przed pobraniem.

Natychmiast po sortowaniu komórek FACS, po zebraniu komórek w 15-mililitrowej probówce, użyj jednego mililitra jednego procenta BSA/HBSS, aby umyć i popchnąć wszystkie komórki w dół z bocznej powierzchni probówki. Następnie odwirować każdą próbkę o masie 260 g przez osiem minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym procencie BSA/HBSS i dodać 33,8 mikrolitra do probówki i trzymać tę probówkę na lodzie.

Ten krok jest przeznaczony do wykonania przy użyciu odczynników uzyskanych ze standardowego zestawu. Wszystkie pokazane kroki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Aby przygotować się do generowania GEM, umieść chip w uchwycie na wióry, a następnie przygotuj mieszankę główną ogniwa na lodzie, zgodnie z protokołem producenta.

Dodać 56,2 mikrolitra mieszanki wzorcowej do probówki zawierającej 33,8 mikrolitrów samozawiesiny. Aby przygotować chip, najpierw w 50 procentach glicerolu do dołków, które nie będą używane. Następnie dodaj 90 mikrolitrów głównej mieszanki komórkowej do studzienki pierwszej, 40 mikrolitrów kulek żelowych do studzienki drugiej i 270 mikrolitrów oleju rozdzielającego do studzienki trzeciej.

Przykryj chip uszczelką. Aby załadować chip i uruchomić go w kontrolerze jednokomórkowym, najpierw wysuń tacę. Umieść frytki na tacy.

Schowaj tacę i naciśnij przycisk odtwarzania. Po zakończeniu serii zbierz 100 mikrolitrów próbki i umieść ją w probówce do PCR. Umieść probówki do PCR w wstępnie ustawionej maszynie do PCR i uruchom zgodnie z zestawem.

Po zakończeniu serii GEM-y będą zawierały pełnowymiarowe, oznaczone kodem kreskowym cDNA z poliadenylowanego mRNA. Umieść probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc. Kontynuuj budowę, sekwencjonowanie, wyrównywanie i analizę biblioteki.

Po zsekwencjonowaniu i wyrównaniu próbek zgodnie z opisem w manuskrypcie zdeponuj dane w publicznym repozytorium, takim jak GEO NCBI. Aby to zrobić, zarejestruj się na konto osoby przesyłającej. Najpierw wypełnij zgłoszenie GEO, pobierając arkusz metadanych.

Upewnij się, że dołączasz tylko jeden arkusz metadanych na zgłoszenie projektu. Umieść arkusz kalkulacyjny w katalogu. Po drugie, dodaj do katalogu plik danych pierwotnych wygenerowany ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek.

Trzeci folder to przetworzone pliki danych. Umieść przetworzone pliki danych wygenerowane ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek w katalogu. Użyj danych uwierzytelniających serwera FTP osoby przesyłającej GEO, aby przenieść katalog zawierający wszystkie trzy komponenty.

Po uruchomieniu Cell Ranger, gotowe do analizy matryce kodów kreskowych genów mogą być dalej przetwarzane przy użyciu zaawansowanej bioinformatyki. Po pierwsze, przeprowadzono wstępne kontrole ilości przy użyciu pakietu Seurat R, który wygenerował wykresy skrzypiec i rozproszenia w celu wizualizacji liczby genów, liczby unikalnych identyfikatorów molekularnych i procentu genów mitochondrialnych w celu identyfikacji dubletów komórkowych i wartości odstających. Do wyboru głównych składowych lub PC wykorzystano wykresy kolankowe, w których wykluczono PC znajdujące się poza plateau odchylenia standardowego osi PC.

Manipulowano również rozdzielczością grupowania. Niska rozdzielczość doprowadziła do mniejszej liczby klastrów komórek, przy czym każdy klaster prawdopodobnie reprezentował zdefiniowany typ komórki. Wysoka rozdzielczość doprowadziła do większego prawdopodobieństwa komórek, reprezentujących podtypy lub stany przejściowe populacji komórek.

Ustawienia klastrów o niskiej rozdzielczości wykorzystano do dalszej analizy map cieplnych ekspresji w celu zidentyfikowania genów o najwyższej ekspresji w danym klastrze. Poszczególne geny kandydujące zostały zwizualizowane na wykresach tSNE, przy użyciu funkcji wykresu cechowego Seurata, która pozwoliła rozszyfrować, czy istnieją klastry reprezentujące na przykład makrofagi. Zarówno w klastrze drugim, jak i czwartym stwierdzono ekspresję CD68, markera panmakrofagów.

Inne pakiety również zapewniają narzędzia do kontroli jakości, na przykład Monocle, pakiet R używany do budowania trajektorii komórek, usuwa komórki o niskiej jakości i zapewnia, że dystrybucja mRNA we wszystkich komórkach jest logarytmicznie normalna i mieści się między górną a dolną granicą. Pojedyncze komórki zostały następnie sklasyfikowane i policzone przy użyciu znanych genów markerów linii, a komórki wyrażające interesujące markery przypisano do typu komórki numer jeden. Ustalono, że typem komórki numer jeden są fibroblasty.

Populacja ta została oceniona pod kątem budowy trajektorii rozwoju fibroblastów. Po tej procedurze należy przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR, hybrydyzacja in situ, chemia immunologiczna, aby potwierdzić dokładność wyników ekspresji genów. Sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki utorowało drogę naukowcom z wielu różnych dziedzin do zbadania heterogeniczności między komórkami i zidentyfikowania dynamiki funkcjonalnej w różnych tkankach podczas homeostazy oraz tego, jak mogą się one zmienić po urazie lub w rozwoju choroby.