Name: Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Odkryj metodę transkryptomiki pojedynczych komórek opartą na kropelkowym kodowaniu kreskowym dla tkanek ssaków dorosłych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek skóry i nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi pomocniczemu w Ośrodku Usług UCDNA, jak również personelowi placówki opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary. Dziękujemy Mattowi Workentine'owi za wsparcie bioinformatyczne i Jensowi Durruthy'emu za wsparcie techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu CIHR (R.M. i J.B.), nagrody CIHR New Investigator Award dla J.B. oraz stypendium Alberta Children's Health Research Institute (J.S.).

<ol><li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li>
<li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/03/23/206573">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li>
<li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li>
<li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li>
<li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCENIC%3A+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li>
<li>10X Genomics. User Guides. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression">http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression</a> (2018).</li>
<li>Agilent. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018).</li>
<li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li>
<li>10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018).</li>
<li>Datacamp. Introduction to R. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018).</li>
<li>Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. User Guides. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018).</li>
<li>UNIX Tutorial for Beginners. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/">http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. System Requirements. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. Software Downloads. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018).</li>
<li>scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018).</li>
<li>Conda. Downloading conda. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018).</li>
<li>Anaconda. r / packages / r 3.5.1. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018).</li>
<li>Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018).</li>
<li>Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. , 
 <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018).</li>
<li>Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018).</li>
<li>Monocle. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories">http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories</a> (2018).</li>
<li>Github. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22An+R+package+to+test+for+batch+effects+in+high-dimensional+single-cell+RNA+sequencing+data%22">An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data</a>. , (2018).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li>
<li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+read+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li>
<li>NIH. GenBank Submission Portal Wizards. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018).</li>
<li>NIH. Submitting data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018).</li>
<li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li>
<li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1(2013).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts%3A+a+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li>
<li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li>
<li>Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li>
</ol>

Brak ujawniania informacji

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób odpowiednie przygotowanie pojedynczych komórek może odkryć niejednorodność transkrypcyjną tysięcy pojedynczych komórek i rozróżnić stany funkcjonalne lub unikalne tożsamości komórkowe w tkance. Protokół nie wymaga fluorescencyjnych białek reporterowych ani narzędzi transgenicznych i może być stosowany do izolacji pojedynczych komórek z różnych tkanek będących przedmiotem zainteresowania, w tym tkanek ludzkich; Należy pamiętać, że każda tkanka jest wyjątkowa i ten protokół będzie wymagał pewnego stopnia dostosowania/modyfikacji.
Zróżnicowane i wysoce dynamiczne programy transkrypcyjne w komórkach podkreśliły wartość genomiki pojedynczej komórki. Oprócz wyizolowania wysokiej jakości RNA, krytycznym etapem przygotowania próbki niezbędnym do uzyskania wysokiej jakości zestawów danych jest upewnienie się, że komórki są całkowicie uwolnione z tkanki oraz że komórki są zdrowe i nienaruszone. Jest to stosunkowo proste w przypadku zbierania komórek, które są łatwo uwalniane, takich jak komórki krążące lub w tkankach, w których komórki są luźno zatrzymane, takie jak tkanki limfoidalne. Może to jednak stanowić wyzwanie dla innych dorosłych tkanek ze względu na wysoko rozwiniętą architekturę komórkową obejmującą duże odległości, otaczającą macierz zewnątrzkomórkową i często sztywne białka cytoszkieletu zaangażowane w utrzymanie struktury komórki. Nawet przy zastosowaniu odpowiednich technik dysocjacji w celu pełnego uwolnienia komórek, istnieje możliwość, że rygorystyczne i często długotrwałe przetwarzanie zmieni jakość mRNA i integralność komórki. Ponadto wysokie temperatury stosowane do dysocjacji wspomaganej enzymatycznie wpływają również na sygnatury transkrypcyjne29,30. Celem protokołu jest przedstawienie kontroli jakości przy użyciu tkanek takich jak mielinizowany nerw dorosłego człowieka i bogata w macierz zewnątrzkomórkową skóra osoby dorosłej, aby pokazać, w jaki sposób optymalizacja może pomóc w pokonaniu tych przeszkód.
Główną kwestią braną pod uwagę przy projektowaniu każdego eksperymentu scRNA-Seq jest wybór głębokości sekwencjonowania. Sekwencjonowanie może być wysoce multipleksowane, a głębokość odczytu może wahać się od bardzo niskiej przy użyciu Drop-Seq2 do do 5 milionów odczytów na komórkę14 przy użyciu metody sekwencjonowania RNA o pełnej długości, takiej jak Smart-Seq. Większość eksperymentów scRNA-Seq może wykryć transkrypty o umiarkowanej lub wysokiej ekspresji przy sekwencjonowaniu tak niskim, jak 10 000 odczytów / komórkę, co zwykle wystarcza do klasyfikacji typu komórki 41,42. Niewielka głębokość sekwencjonowania jest cenna, aby zaoszczędzić na kosztach sekwencjonowania podczas próby wykrycia rzadkich populacji komórek w złożonych tkankach, gdzie tysiące komórek mogą być potrzebne do pewnego przypisania rzadkich populacji. Jednak sekwencjonowanie na płytkiej głębokości nie jest wystarczające, gdy niezbędne są szczegółowe informacje na temat ekspresji genów i procesów związanych z subtelnymi sygnaturami transkrypcyjnymi. Obecnie szacuje się, że zdecydowana większość genów w komórce jest wykrywana przy 500 000 odczytów na komórkę, ale może się to różnić w zależności od protokołu i typu tkanki43,44. Podczas gdy sekwencjonowanie transkryptu o pełnej długości omija potrzebę składania i dlatego może wykrywać nowe lub rzadkie warianty splicingu, koszty sekwencjonowania często ograniczają skalowanie takich podejść w celu zbadania tysięcy komórek składających się na złożony system tkankowy. W przeciwieństwie do tego, biblioteki jednokomórkowe oznaczone 3', takie jak te opisane w tym protokole, mają zazwyczaj mniejszą złożoność i wymagają płytszego sekwencjonowania. Należy zauważyć, że biblioteki wygenerowane przy użyciu opisanego protokołu mogą być sekwencjonowane na jednym z pięciu obsługiwanych sekwencerów: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 Rapid Run and High Output, 4) NextSeq 500/550 i 5) MiSeq.
Alternatywnym podejściem do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, które zmniejsza potrzebę delikatnego obchodzenia się z tkankami i komórkami, a jednocześnie zachowuje niektóre korzyści płynące z sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, jest analiza RNA z pojedynczych jąder45. Takie podejście pozwala na szybsze przetwarzanie zmniejszające degradację RNA i bardziej ekstremalne środki w celu zapewnienia odpowiedniego uwalniania jąder, a tym samym prawdopodobnie pozwala na pewniejsze uchwycenie profili transkrypcyjnych reprezentujących wszystkie komórki w danej tkance. To oczywiście zapewniłoby tylko część aktywności transkrypcyjnej obecnej w danej komórce, więc w zależności od tego, jakie cele eksperymentalne są przedmiotem zainteresowania, takie podejście może, ale nie musi być odpowiednie.
Oprócz pełnej charakterystyki tożsamości komórkowych w danej tkance, jedną z najcenniejszych analiz zestawów danych scRNA-Seq jest ocena pośrednich stanów transkrypcyjnych w "zdefiniowanych" populacjach komórek. Te stany pośrednie mogą dostarczyć wglądu w relacje liniowe między komórkami w zidentyfikowanych populacjach, co nie było możliwe w przypadku tradycyjnych podejść do masowego sekwencjonowania RNA. Aby to wyjaśnić, opracowano kilka narzędzi bioinformatycznych scRNA-Seq. Takie narzędzia mogą oceniać procesy związane na przykład z przejściem komórek nowotworowych w stan onkogenny/przerzutowy, dojrzewaniem komórek macierzystych do różnych terminalnych losów lub przemieszczaniem się komórek odpornościowych między stanem aktywnym i spoczynkowym. Subtelne różnice w transkryptomie w komórkach mogą również wskazywać na odchylenia rodowe, które, jak niedawno opracowane narzędzia bioinformatyczne, takie jak FateID, mogą wywnioskować47. Ponieważ różnice między komórkami przejściowymi mogą być trudne do ustalenia, biorąc pod uwagę, że różnice transkrypcyjne mogą być subtelne, konieczne może być głębsze sekwencjonowanie46. Na szczęście pokrycie płytko zsekwencjonowanej biblioteki można zwiększyć, jeśli jest zainteresowany dalszym badaniem zestawu danych przez ponowne uruchomienie biblioteki w innej komórce przepływu.
Podsumowując, protokół ten zapewnia łatwy do dostosowania przepływ pracy, który umożliwia użytkownikom transkrypcyjne profilowanie setek lub tysięcy pojedynczych komórek w jednym eksperymencie. Ostateczna jakość zestawu danych scRNA-Seq zależy od zoptymalizowanej izolacji komórek, cytometrii przepływowej, generowania biblioteki cDNA i interpretacji surowych matryc genów i kodów kreskowych. W tym celu protokół ten zapewnia kompleksowy przegląd wszystkich kluczowych kroków, które można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić badania różnych typów tkanek.

Wraz z rozwojem technologii pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości1,2 oraz postępom w przyjaznych dla użytkownika narzędziach bioinformatycznych w ciągu ostatniej dekady3, pojawiła się nowa dziedzina analizy ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości - sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq). Badanie ekspresji genów w pojedynczej komórce zostało po raz pierwszy opracowane w celu zidentyfikowania heterogeniczności w określonych populacjach komórek, takich jak komórki macierzyste lub komórki rakowe, lub w celu zidentyfikowania rzadkich populacji komórek4,5, które były nieosiągalne przy użyciu tradycyjnych technik sekwencjonowania masowego RNA. Narzędzia bioinformatyczne umożliwiły identyfikację nowych subpopulacji (Seurat)2, wizualizację kolejności komórek w przestrzeni psuedotime (Monocle)6, definicję aktywnych sieci sygnalizacyjnych w obrębie lub między populacjami (SCENIC)7, przewidywanie montażu pojedynczych komórek w sztucznej przestrzeni 3D (Seurat i inne)8. Dzięki tym nowym i ekscytującym analizom dostępnym dla społeczności naukowej, scRNA-Seq szybko staje się nowym standardowym podejściem do analizy ekspresji genów.
Pomimo ogromnego potencjału scRNA-Seq, umiejętności techniczne wymagane do stworzenia czystego zbioru danych i dokładnej interpretacji wyników mogą stanowić wyzwanie dla nowicjuszy. W tym miejscu przedstawiono podstawowy, ale kompleksowy protokół, począwszy od izolacji pojedynczych komórek z całych tkanek pierwotnych, a skończywszy na wizualizacji i prezentacji danych do publikacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po pierwsze, izolacja zdrowych pojedynczych komórek może być uznana za trudną, ponieważ różne tkanki różnią się stopniem wrażliwości na trawienie enzymatyczne i późniejszą dysocjację mechaniczną. Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące tych etapów izolacji i identyfikuje ważne punkty kontrolne kontroli jakości w całym procesie. Po drugie, zrozumienie kompatybilności i wymagań między technologią pojedynczych komórek a sekwencjonowaniem nowej generacji może być mylące. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wdrożenia przyjaznej dla użytkownika, opartej na kropelkach platformy kodów kreskowych z pojedynczymi komórkami i wykonywania sekwencjonowania. Wreszcie, programowanie komputerowe jest ważnym warunkiem wstępnym do analizy zbiorów danych transkryptomicznych pojedynczych komórek. Ten protokół zawiera zasoby umożliwiające rozpoczęcie pracy z językiem programowania R i zawiera wskazówki dotyczące implementowania dwóch popularnych pakietów języka R specyficznych dla scRNA-Seq. Razem protokół ten może pomóc nowicjuszom w przeprowadzaniu analizy scRNA-Seq w celu uzyskania jasnych, możliwych do zinterpretowania wyników. Protokół ten można dostosować do większości tkanek myszy i, co ważne, można go zmodyfikować do stosowania z innymi organizmami, w tym z tkankami ludzkimi. Wymagane będą korekty w zależności od tkanki i użytkownika.
Jest kilka kwestii, o których należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu; w tym, 1) Zaleca się przestrzeganie wszystkich wytycznych dotyczących kontroli jakości w krokach 1 i 2 niniejszego protokołu, aby zapewnić żywotną zawiesinę wszystkich komórek w badanej próbie, zapewniając jednocześnie dokładną całkowitą liczbę komórek (podsumowane w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Gdy zostanie to osiągnięte i jeśli wszystkie zoptymalizowane warunki zostaną spełnione, etapy kontroli jakości mogą zostać porzucone (w celu zaoszczędzenia czasu - zachowania jakości RNA i zmniejszenia utraty komórek). Potwierdzenie pomyślnej izolacji pojedynczych komórek o wysokiej żywotności z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania jest wysoce zalecane przed jakimkolwiek dalszym przetwarzaniem. 2) Ponieważ niektóre typy komórek są bardziej wrażliwe na stres niż inne, nadmierne techniki dysocjacji mogą nieumyślnie zniekształcić populację, zakłócając w ten sposób dalszą analizę. Delikatna dysocjacja bez zbędnego ścinania i trawienia komórek ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności komórkowej i dokładnego odwzorowania składu tkankowego. Siły ścinające występują podczas etapów rozcierania, FACS i ponownego zawieszenia. 3) Podobnie jak w przypadku każdej pracy z RNA, najlepiej jest wprowadzić jak najmniej dodatkowej RNazy do próbki podczas przygotowania. Pomoże to utrzymać wysoką jakość RNA. Używaj roztworów inhibitorów rybonukleazy z płukaniem do czyszczenia narzędzi i wszelkiego sprzętu, który nie jest wolny od RNazy, ale unikaj produktów poddanych działaniu DEPC. 4) Wykonaj przygotowania tak szybko, jak to możliwe. Pomoże to utrzymać wysokiej jakości RNA i zmniejszyć śmierć komórki. W zależności od długości sekcji tkanek i liczby zwierząt, rozważ rozpoczęcie wielu sekcji/przygotowań w tym samym czasie. 5) Przygotuj komórki na lodzie, jeśli to możliwe, aby utrzymać wysoką jakość RNA, zmniejszyć śmierć komórki oraz spowolnić sygnalizację komórkową i aktywność transkrypcyjną. Chociaż przetwarzanie na zimno jest idealne dla większości typów komórek, niektóre typy komórek (np. neutrofile) działają lepiej, gdy są przetwarzane w temperaturze pokojowej. 6) Unikaj produktów poddanych działaniu wapnia, magnezu, EDTA i DEPC podczas przygotowywania komórek.

<table><tbody><tr><td>Products</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse out</td><td>Biosciences</td><td>786-70</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Eutanyl</td><td></td><td>50mg/kg</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 5U/ml</td><td>StemCell Technologies</td><td>7913</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Kolagenaza-4 125 CDU/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>10mg/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Wąska rurka denna VWR&reg; Wysokowydajne probówki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Sytox Orange Viability Dye</td><td>11320972</td><td>1,3 nM / & mikro; l</td></tr><tr><td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer Odczynniki DNA o wysokiej wrażliwości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji DNA Kapa Kapa</td><td>Biosystems</td><td>KK4844</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3</td>' <td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td> Platforma bioanalizatora <td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina&reg; HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina&reg; Kontroler MiSeq SR50</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X + akcesoria</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Cell Ranger</td><td>10x GENOMICS</td><td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome</td><td></td></tr><tr><td>przeglądarka komórek lupy</td><td>10x GENOMIKA</td><td></td><td></td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</tr><tr><td>R</td><td></td><td>https://anaconda.org/r/r</td><td></td></tr></tbody></table>

transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Analiza ekspresji genów pojedynczej komórki w tysiącach pojedynczych komórek w tkance lub mikrośrodowisku jest cennym narzędziem do identyfikacji składu komórki, dyskryminacji stanów funkcjonalnych i szlaków molekularnych leżących u podstaw obserwowanych funkcji tkanek i zachowań zwierząt. Jednak izolacja nienaruszonych, zdrowych pojedynczych komórek z tkanek dorosłych ssaków w celu późniejszej analizy molekularnej pojedynczych komórek może być wyzwaniem. Protokół ten opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do uzyskania wysokiej jakości preparatów dorosłych pojedynczych komórek z układu nerwowego lub skóry, które umożliwiły późniejsze bezstronne sekwencjonowanie i analizę RNA pojedynczej komórki. Zapewniono również wytyczne dotyczące dalszej analizy bioinformatycznej.

Repertuar pakietów open source zaprojektowanych do analizy zbiorów danych scRNA-Seq znacznie wzrósł40, przy czym większość z nich opiera się na językach programowania R3. W niniejszej pracy przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu dwóch z tych pakietów: ocenę nienadzorowanego grupowania pojedynczych komórek na podstawie ekspresji genów oraz szeregowanie pojedynczych komórek wzdłuż trajektorii w celu rozstrzygnięcia heterogeniczności komórkowej i dekonstrukcji procesów biologicznych.
Rysunek 4 ilustruje wykorzystanie pakietu Seurat do kontroli jakości podczas wstępnego przetwarzania oraz do późniejszej analizy bioinformatycznej. Po pierwsze, niezbędnym elementem kontroli jakości jest filtracja i usunięcie komórek odstających z analizy. W tym celu wykorzystano wykresy skrzypcowe (Rysunek 4a) oraz wykresy rozrzutu (Rysunek 4b) do wizualizacji procentowej zawartości genów mitochondrialnych, liczby genów (nGene) oraz liczby UMI (nUMI) w celu zidentyfikowania dubletów komórkowych i wartości odstających. Wszelkie komórki z ewidentnie odstającą liczbą genów, UMI lub procentową zawartością genów mitochondrialnych zostały usunięte przy użyciu funkcji FilterCells pakietu Seurat. Ponieważ Seurat wykorzystuje wyniki analizy głównych składowych (PC) do grupowania komórek, kluczowym krokiem jest określenie statystycznie istotnych PC, które zostaną uwzględnione w analizie. Do wyboru PC zastosowano wykresy łokciowe (Rysunek 4c), w których wykluczono PC znajdujące się poza plateau osi „standard deviation of PC”. Manipulowano również rozdzielczością grupowania, co wykazało, że liczba klastrów może ulegać zmianie, w zakresie od 0,4 (niska rozdzielczość prowadząca do mniejszej liczby klastrów komórkowych, Rysunek 4d) do 4 (wysoka rozdzielczość prowadząca do większej liczby klastrów komórkowych, Rysunek 4e). Przy niskiej rozdzielczości prawdopodobne jest, że każdy klaster reprezentuje określony typ komórki, natomiast przy wysokiej rozdzielczości może on również reprezentować podtypy lub stany przejściowe populacji komórkowej. W tym przypadku do dalszej analizy map ciepła ekspresji (przy użyciu funkcji DoHeatmap pakietu Seurat) zastosowano ustawienia klastrów o niskiej rozdzielczości, aby zidentyfikować geny o najwyższej ekspresji w danym klastrze (Rysunek 4f). W tym przypadku geny o najwyższej ekspresji zidentyfikowano poprzez ocenę różnicowej ekspresji w danym klastrze w porównaniu do wszystkich pozostałych klastrów łącznie, co wykazało, że każdy klaster był w sposób unikalny reprezentowany przez określone geny. Dodatkowo poszczególne geny kandydackie można wizualizować na wykresach tSNE przy użyciu funkcji FeaturePlot pakietu Seurat (Rysunek 4g). Pozwoliło to rozstrzygnąć, czy istnieją klastry reprezentujące makrofagi. Za pomocą FeaturePlot stwierdzono, że zarówno klaster 2, jak i 4 wykazują ekspresję Cd68 – pan-marker makrofagów.
Pakiet Monocle został wykorzystany do potwierdzenia klastrów komórkowych zidentyfikowanych w programie Seurat oraz do budowy trajektorii komórkowych, czyli uporządkowania pseudoczasowego, aby odtworzyć procesy biologiczne (Rycina 5). Uporządkowanie pseudoczasowe można stosować w przypadku próbek, w których oczekuje się, że profile ekspresji pojedynczych komórek będą odpowiadać biologicznemu przebiegowi czasowemu. Komórki mogą być ustawione wzdłuż kontinuum pseudoczasowego w celu rozróżnienia stanów pośrednich, punktów bifurkacji dwóch alternatywnych losów komórkowych oraz zidentyfikowania sygnatur genowych leżących u podstaw nabycia każdego z tych losów. W pierwszej kolejności, podobnie jak w przypadku filtracji w programie Seurat, usunięto komórki słabej jakości w taki sposób, aby rozkład mRNA we wszystkich komórkach był log-normalny i mieścił się w granicach górnej i dolnej, określonych na Rycynie 5a. Następnie, przy użyciu funkcji newCellTypeHierarchy w pakiecie Monocle, pojedyncze komórki zostały zaklasyfikowane i policzone z wykorzystaniem znanych genów markerów linii komórkowych (Rycina 5b, 5c). Na przykład komórki wykazujące ekspresję receptora PDGF alfa lub białka specyficznego dla fibroblastów 1 (Fibroblast Specific Protein 1) przypisano do Typu Komórek #1, aby stworzyć kryterium definiujące fibroblasty. Następnie populację tę (Typ Komórek #1) poddano ocenie w celu rozszyfrowania trajektorii fibroblastów. W tym celu wykorzystano funkcję różnicową GeneTest z pakietu Monocle, która porównała komórki reprezentujące stany ekstremalne w obrębie populacji i znalazła geny różnicowe służące do uporządkowania pozostałych komórek w populacji (Rycina 5d). Poprzez zastosowanie metod uczenia rozmaitości (typ nieliniowej redukcji wymiarowości) dla wszystkich komórek, przypisano współrzędną wzdłuż ścieżki pseudoczasowej. Trajektoria ta została następnie zwizualizowana w zależności od stanu komórkowego (Rycina 5e) oraz pseudoczasu (Rycina 5f).
<img alt="Schemat przepływu pracy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek; obejmuje sortowanie FACS, sekwencjonowanie bibliotek, analizę danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy. Kroki od przygotowania całego organizmu, poprzez analizę zbiorów danych scRNA-Seq (sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek), aż po przesłanie końcowych zbiorów danych do publicznie dostępnego repozytorium. GEM-y (Gel beads in Emulsion) to kulekowe nośniki z okodowanymi oligonukleotydami, które enkapsulują tysiące pojedynczych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces uwalniania i walidacji komórek; wykresy cytometrii przepływowej; obrazy mikroskopowe; separacja debris." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie żywej zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki nerwowej. (a) Schematyczny przegląd kontroli jakości. (b) Komórki i debris z komórkami wciąż w nich zawartymi (czerwone strzałki). (c) Komórki uwolnione z debris (czerwone strzałki). (d) Izolacja komórek metodą FACS. P0: frakcja debris; P1: frakcja komórkopodobna; P3: wykluczenie dubletów; P4: frakcja negatywna względem barwnika żywotności (Sytox Orange). (e) Kontrola bez barwnika żywotności. (f) Obraz frakcji P0 reprezentujący wyizolowany debris. (g) Obraz frakcji P4 reprezentujący wyizolowane żywe komórki (czerwone strzałki). Do próbek (b)(c)(f) i (g) dodano barwnik jądrowy 20 minut przed obrazowaniem. Paski skali: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="analiza liczby UMI; wykres kodów kreskowych MiSeq i dopasowanie transkryptomu; tabela danych; sekwencjonowanie RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Płytkie sekwencjonowanie pozwala przewidzieć liczbę odzyskanym komórek w próbkach przetworzonych metodą 10X. (a) Przykład (Próbka 1.6) wygenerowanego przez MiSeq pliku csv zawierającego listę kodów kreskowych komórek i odpowiadające im liczby UMI wyznaczone na podstawie odczytów z pewnym dopasowaniem. (b) Wykres rangi kodów kreskowych dla Próbki 1.6 pokazuje jeden znaczący spadek liczby UMI w funkcji kodów kreskowych komórek. Linie przerywana i ciągła reprezentują granicę między komórkami a tłem, wyznaczoną na podstawie inspekcji wizualnej. (c) Kody kreskowe komórek zaobserwowane przy użyciu potoku Cell Ranger po sekwencjonowaniu HiSeq wykazują, że płytkie sekwencjonowanie dokładnie przybliżyło liczbę komórek dla Próbki 1.6. (d) Przykład konfiguracji ogniwa przepływowego w oparciu o szacunki liczby komórek uzyskane z płytkiego sekwencjonowania. Dla Próbki 1.6, ponieważ płytkie sekwencjonowanie przewidziało 3480 komórek, przydzielono 1,17 ścieżki, aby zapewnić &gt;pokrycie sekwencjonowania na poziomie 10 00 odczytów na komórkę w systemie HiSeq. Uwaga: Suma wszystkich ścieżek musi wynosić 10%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek; wykresy kropkowe, PCA, klasteryzacja tSNE, mapa ciepła ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kontrola jakości i bioinformatyka zbioru danych single-cell RNA-Seq z wykorzystaniem pakietu Seurat w języku R. (a) Wykresy wskaźników kontroli jakości, obejmujące liczbę genów, liczbę unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) oraz procent transkryptów mapujących do genomu mitochondrialnego. (b) Przykładowe wykresy genów służące do wykrywania komórek z odchylonymi poziomami transkryptów mitochondrialnych oraz UMI. (c) Przykładowy wykres łokciowy wykorzystany do ad hoc wyznaczenia statystycznie istotnych głównych składowych (PC). Linie przerywane i kropkowane reprezentują punkt odcięcia, w którym na wykresie staje się widoczny wyraźny „łokieć”. Wymiary PC przed tym łokciem są uwzględniane w dalszej analizie. (d, e) Klastry komórek oparte na grafie, zwizualizowane w dwóch różnych rozdzielczościach w przestrzeni niskowymiarowej za pomocą wykresu tSNE. (f) Najważniejsze geny markerowe (żółte) dla każdego klastra, zwizualizowane na mapie ciepła ekspresji przy użyciu funkcji DoHeatmap pakietu Seurat. (g) Wizualizacja ekspresji markera, np. genu Cd68 reprezentującego makrofagi (fioletowy), przy użyciu funkcji FeaturePlot pakietu Seurat. Sugeruje to, że klastry 2 i 4 (na panelu d) w tym zbiorze danych reprezentują makrofagi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów z wykorzystaniem histogramów, wykresu kołowego, tabeli danych, wykresu rozproszenia i wykresów PCA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Kategoryzacja i uporządkowanie komórek wzdłuż trajektorii pseudoczasowej przy użyciu narzędzia Monocle. (a) Analiza rozkładu mRNA (wnioskowana na podstawie liczby UMI) we wszystkich komórkach w próbce. Do dalszych analiz wykorzystano wyłącznie komórki z liczbą mRNA w zakresie od 0 do ok. 20 00. (b, c) Przypisywanie i zliczanie typów komórek na podstawie znanych markerów linii komórkowych. Na przykład komórki wykazujące ekspresję receptora alfa PDGF lub białka specyficznego dla fibroblastów 1 zostały przypisane do typu komórek nr 1 reprezentującego pan-fibroblasty przy użyciu funkcji newCellTypeHierarchy w programie Monocle. Liczbę różnych typów komórek można przedstawić na wykresie kołowym (b) oraz w formie tabeli (c). (d) Na przykładzie typu komórek nr 1 (fibroblasty) geny wykorzystane do uporządkowania komórek można przedstawić na wykresie rozrzutu, który obrazuje dyspersję genów w stosunku do średniej ekspresji. Czerwona krzywa wskazuje punkt odcięcia dla genów użytych do uporządkowania, obliczony za pomocą modelu średnia-wariancja przy użyciu funkcji estimateDispersions w programie Monocle. Geny spełniające to kryterium zostały wykorzystane do dalszego uporządkowania w czasie pseudochronicznym (pseudotime). (e, f) Wizualizacja trajektorii komórek w zredukowanej przestrzeni dwuwymiarowej, z kolorowaniem według „stanu” (State) komórki (e) oraz przypisanego przez program Monocle „czasu pseudochronicznego” (Pseudotime) (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak zrozumienie zmian ekspresji genów w tysiącach pojedynczych komórek po urazie lub chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na analizę transkryptomów poszczególnych komórek w złożonej tkance i lepsze docenienie dynamiki funkcjonalnej w danej populacji. Zaletą naszego protokołu jest to, że zapewnia kompleksowe metody, od izolacji pojedynczych komórek w tkankach pierwotnych, po analizę i wizualizację tego zestawu danych.Chociaż metoda ta zaczyna się od zawiesin jednokomórkowych ze skóry i nerwu, opisane przez nas metody sekwencjonowania można zastosować do badania dowolnej tkanki ssaków. Tę procedurę zademonstrują Elodie Labit i Wisoo Shin, dwoje stażystów z mojego laboratorium. Na początek przeprowadź sekcję nerwu kulszowego myszy poddanej eutanazji, najpierw odcinając skórę od tylnej części grzbietu myszy.Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż uda. Następnie użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby odsłonić i usunąć nerw kulszowy. Aby wypreparować skórę grzbietu pleców, użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać nacięcia od ramienia do ramienia, w poprzek zadu i w dół pleców.Umyj chusteczki dwukrotnie lodowatym HBSS. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń niechcianą tkankę łączną, złogi tłuszczu lub zanieczyszczenia. Tylko w przypadku skóry pokrój ją w cienkie plasterki za pomocą sterylnego ostrza skalpela.Aby uzyskać skórę właściwą, należy spławić plastry skóry w dyspazie, w HBSS w 10-centymetrowym naczyniu, przez 30 do 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj cienkich kleszczyków, aby obrać i oddzielić naskórek od skóry właściwej, a następnie wyrzuć naskórek. Następnie, w przypadku skóry i nerwów, użyj pary sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić każdą próbkę na kawałki o długości od jednego do dwóch milimetrów.Umieść kawałki tkanki w świeżo rozmrożonym, dwa gramy na mililitr zimnego enzymu kolagenazy-czterech w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Inkubować każdą próbkę w enzymie w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie wstrząsając co 10 minut. Po 30 minutach użyj pipetera P1000, aby rozcierać tkankę 20 do 30 razy i wróć do łaźni wodnej.Powtarzaj rozcieranie co 30 minut, aż roztwór stanie się mętny, a kawałki tkanki zostaną w dużej mierze zdysocjowane. Tylko w przypadku skóry, w ostatniej godzinie inkubacji, dodać jeden miligram na mililitr DNAzy do próbki skóry. Ponieważ niektóre typy komórek są bardziej wrażliwe niż inne na stres mechaniczny, nadmierne techniki dysocjacji mogą wpływać na populację.Ogólna dysocjacja ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności komórek i dokładnego odwzorowania składu tkanki. Następnie użyj filtra o długości 40 mikrometrów na 50-mililitrowej stożkowej rurce, aby dwukrotnie przefiltrować każdą próbkę tkanki. Przepłukać filtr jednym procentem BSA/HBSS.Po odwirowaniu próbek zgodnie z opisem w manuskrypcie, ponownie zawiesić osad komórkowy w HBSS, zawierający jeden procent BSA, za pomocą końcówki o szerokim otworze i umieścić na lodzie. Dodatek barwnika żywotności pomoże Ci zoptymalizować przygotowanie. Powinieneś dążyć do co najmniej 80 procent żywotnych komórek.Po optymalizacji ten i inne etapy kontroli jakości można pominąć, aby przyspieszyć proces dysocjacji, co pozwoli lepiej zachować jakość RNA i zmniejszyć utratę komórek. Aby wyizolować żywotne i zdrowe komórki za pomocą FACS, najpierw przygotuj 15-mililitrowe probówki z wąskim dnem z ośmioma mililitrami lodowatego jednego procenta BSA/HBSS do pobierania próbek. Aby upewnić się, że powierzchnia styku cieczy z wnętrzem probówki jest wilgotna oraz aby zapobiec napięciu statycznemu i powierzchniowemu, odwróć probówki przed pobraniem.Natychmiast po sortowaniu komórek FACS, po zebraniu komórek w 15-mililitrowej probówce, użyj jednego mililitra jednego procenta BSA/HBSS, aby umyć i popchnąć wszystkie komórki w dół z bocznej powierzchni probówki. Następnie odwirować każdą próbkę o masie 260 g przez osiem minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym procencie BSA/HBSS i dodać 33,8 mikrolitra do probówki i trzymać tę probówkę na lodzie.Ten krok jest przeznaczony do wykonania przy użyciu odczynników uzyskanych ze standardowego zestawu. Wszystkie pokazane kroki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Aby przygotować się do generowania GEM, umieść chip w uchwycie na wióry, a następnie przygotuj mieszankę główną ogniwa na lodzie, zgodnie z protokołem producenta.Dodać 56,2 mikrolitra mieszanki wzorcowej do probówki zawierającej 33,8 mikrolitrów samozawiesiny. Aby przygotować chip, najpierw w 50 procentach glicerolu do dołków, które nie będą używane. Następnie dodaj 90 mikrolitrów głównej mieszanki komórkowej do studzienki pierwszej, 40 mikrolitrów kulek żelowych do studzienki drugiej i 270 mikrolitrów oleju rozdzielającego do studzienki trzeciej.Przykryj chip uszczelką. Aby załadować chip i uruchomić go w kontrolerze jednokomórkowym, najpierw wysuń tacę. Umieść frytki na tacy.Schowaj tacę i naciśnij przycisk odtwarzania. Po zakończeniu serii zbierz 100 mikrolitrów próbki i umieść ją w probówce do PCR. Umieść probówki do PCR w wstępnie ustawionej maszynie do PCR i uruchom zgodnie z zestawem.Po zakończeniu serii GEM-y będą zawierały pełnowymiarowe, oznaczone kodem kreskowym cDNA z poliadenylowanego mRNA. Umieść probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc. Kontynuuj budowę, sekwencjonowanie, wyrównywanie i analizę biblioteki.Po zsekwencjonowaniu i wyrównaniu próbek zgodnie z opisem w manuskrypcie zdeponuj dane w publicznym repozytorium, takim jak GEO NCBI. Aby to zrobić, zarejestruj się na konto osoby przesyłającej. Najpierw wypełnij zgłoszenie GEO, pobierając arkusz metadanych.Upewnij się, że dołączasz tylko jeden arkusz metadanych na zgłoszenie projektu. Umieść arkusz kalkulacyjny w katalogu. Po drugie, dodaj do katalogu plik danych pierwotnych wygenerowany ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek.Trzeci folder to przetworzone pliki danych. Umieść przetworzone pliki danych wygenerowane ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek w katalogu. Użyj danych uwierzytelniających serwera FTP osoby przesyłającej GEO, aby przenieść katalog zawierający wszystkie trzy komponenty.Po uruchomieniu Cell Ranger, gotowe do analizy matryce kodów kreskowych genów mogą być dalej przetwarzane przy użyciu zaawansowanej bioinformatyki. Po pierwsze, przeprowadzono wstępne kontrole ilości przy użyciu pakietu Seurat R, który wygenerował wykresy skrzypiec i rozproszenia w celu wizualizacji liczby genów, liczby unikalnych identyfikatorów molekularnych i procentu genów mitochondrialnych w celu identyfikacji dubletów komórkowych i wartości odstających. Do wyboru głównych składowych lub PC wykorzystano wykresy kolankowe, w których wykluczono PC znajdujące się poza plateau odchylenia standardowego osi PC.Manipulowano również rozdzielczością grupowania. Niska rozdzielczość doprowadziła do mniejszej liczby klastrów komórek, przy czym każdy klaster prawdopodobnie reprezentował zdefiniowany typ komórki. Wysoka rozdzielczość doprowadziła do większego prawdopodobieństwa komórek, reprezentujących podtypy lub stany przejściowe populacji komórek.Ustawienia klastrów o niskiej rozdzielczości wykorzystano do dalszej analizy map cieplnych ekspresji w celu zidentyfikowania genów o najwyższej ekspresji w danym klastrze. Poszczególne geny kandydujące zostały zwizualizowane na wykresach tSNE, przy użyciu funkcji wykresu cechowego Seurata, która pozwoliła rozszyfrować, czy istnieją klastry reprezentujące na przykład makrofagi. Zarówno w klastrze drugim, jak i czwartym stwierdzono ekspresję CD68, markera panmakrofagów.Inne pakiety również zapewniają narzędzia do kontroli jakości, na przykład Monocle, pakiet R używany do budowania trajektorii komórek, usuwa komórki o niskiej jakości i zapewnia, że dystrybucja mRNA we wszystkich komórkach jest logarytmicznie normalna i mieści się między górną a dolną granicą. Pojedyncze komórki zostały następnie sklasyfikowane i policzone przy użyciu znanych genów markerów linii, a komórki wyrażające interesujące markery przypisano do typu komórki numer jeden. Ustalono, że typem komórki numer jeden są fibroblasty.Populacja ta została oceniona pod kątem budowy trajektorii rozwoju fibroblastów. Po tej procedurze należy przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR, hybrydyzacja in situ, chemia immunologiczna, aby potwierdzić dokładność wyników ekspresji genów. Sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki utorowało drogę naukowcom z wielu różnych dziedzin do zbadania heterogeniczności między komórkami i zidentyfikowania dynamiki funkcjonalnej w różnych tkankach podczas homeostazy oraz tego, jak mogą się one zmienić po urazie lub w rozwoju choroby.

droplet-barcoding-based-single-cell-transcriptomics-adult-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Odkryj metodę transkryptomiki pojedynczych komórek opartą na kropelkowym kodowaniu kreskowym dla tkanek ssaków dorosłych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek skóry i nerwów.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Przeglądaj więcej filmów