Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie danych sekwencjonowania genomu za pomocą kodów kreskowych z dziesiątek tysięcy pojedynczych komórek przy użyciu szeregu urządzeń mikroprzepływowych. Ta metoda zapewnia niezrównaną przepustowość sekwencjonowania pojedynczych komórek. Używamy mikrofluidyki do kapsułkowania, lizy i kodowania kreskowego komórek indywidualnie, zachowując podstawową heterogeniczność genomu, która jest tracona w konwencjonalnym szoku w badaniach sekwencjonowania.

Główną zaletą tej techniki jest wysoka przepustowość i zdolność do generowania danych jednokomórkowych z dziesiątek tysięcy komórek. Chociaż w tej demonstracji pracujemy z mikroorganizmami, przepływ pracy można dostosować do użytku z różnymi typami komórek poprzez niewielkie modyfikacje wymiarów urządzenia mikroprzepływowego. Aby rozpocząć protokół, przygotuj jeden mililitr 3% masy na objętość agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze 1X Tris-EDTA lub TE.

Trzymaj roztwór agarozy na bloku grzewczym o temperaturze 90 stopni Celsjusza tylko do momentu załadowania strzykawki. Zawieś komórki w jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS i odwiruj komórki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze 17% objętości do pożywki gradientu gęstości objętościowej w PBS i utrzymywać komórki na lodzie do momentu załadowania strzykawki.

Następnie załaduj trzymililitrową strzykawkę olejem fluorowanym lub HFE, zawierającym środek powierzchniowo czynny PFPE-PEG o masie 2%. Wyposażyć go w igłę o rozmiarze 27 i umieścić w pompie strzykawkowej. Załaduj zawiesinę komórek i stopioną agarozę do jednomililitrowych strzykawek, które pasują do igieł o rozmiarze 27 i umieść je w pompkach strzykawkowych.

Następnie ustaw grzejnik na wysoki poziom i ustaw powierzchnię grzewczą w odległości 10 centymetrów od strzykawki. Upewnij się, że temperatura mierzona na strzykawce wynosi około 80 stopni Celsjusza. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.

Podłącz igły strzykawki do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki z polietylenu lub PE. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w 15-mililitrowej probówce zbiorczej. Po przygotowaniu kropli umieść probówkę zbiorczą w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut, aby zapewnić całkowite zżelowanie agarozy.

Usunąć dolną warstwę oleju z probówki zbiorczej za pomocą trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20G, uważając, aby nie naruszyć górnej warstwy kropelek agarozy. Dodaj jeden mililitr 10% objętości na objętość PFO w HFE, aby rozbić krople agarozy z ich warstwy środka powierzchniowo czynnego. Pipetować roztwór w górę i w dół przez jedną minutę, aby dokładnie pokryć emulsje, które powinny być jednorodne i wolne od grudek.

Obracaj stożkową probówkę 2 000 razy g przez jedną minutę, aby zebrać mikrożele agarozy. Odessać supernatant PFO/HFE i upewnić się, że mikrożele są teraz wolne od warstwy środka powierzchniowo czynnego i są klarowne. Po umyciu mikrożeli sprawdź enkapsulację komórek w mikrożelach pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu, barwiąc 10-mikrolitrową porcję żeli barwieniem 1X kwasu nukleinowego.

Zatkaj wlot ogniw urządzenia do wkraplacza z przepływem małym kawałkiem lutu ołowiowego. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w 0,2-mililitrowej probówce PCR.

Wykorzystaj natężenie przepływu na ekranie do tworzenia kropli. Zbierz krople do probówek PCR z około 50 mikrolitrami kropli w każdej probówce. Po wykonaniu kropli ostrożnie usuń dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąp ją olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% wagowo środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG.

Następnie zaprogramuj cykl termiczny. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłączyć strzykawki zawierające HFE, mieszankę do znakowania i mikrożele do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE.

Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w pustej strzykawce o pojemności jednego mililitra z tłokiem przyciągniętym do linii o pojemności jednego mililitra. Następnie sprawdź szybkość kapsułkowania mikrożelu pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. Wyposażyć strzykawkę zawierającą emulsje znakujące w igłę i inkubować ją w pozycji pionowej w bloku grzewczym lub piekarniku przez godzinę w temperaturze 55 stopni Celsjusza w celu fragmentacji genomowego DNA.

Przygotuj kropelki kodu kreskowego do połączenia, zastępując frakcję olejową FC-40 HFE 2%wagowo PFPE-PEG. Ostrożnie przenieś krople do jednomililitrowej strzykawki, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej. Załadować inkubowaną i oznakowaną strzykawkę z kroplami mikrożelu do pompy strzykawkowej.

Następnie podłącz trzy strzykawki z chlorkiem sodu do dwóch wlotów elektrod i pojedynczego wlotu fosy za pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłącz trzy strzykawki HFE zamontowane na pompach do dwóch wlotów oleju dystansowego i wlotu oleju do wytwarzania kropli za pomocą kawałków rurki PE.

Następnie przestrzel wszystkie rurki do ponownego wstrzykiwania kropelek pistoletem antystatycznym przed podłączeniem rurki do igieł strzykawki. Podłącz strzykawkę z mieszanką PCR, strzykawkę z mikrożelem i strzykawkę z kodem kreskowym do odpowiednich wlotów za pomocą rurki PE. Podłącz igłę strzykawki z elektrodą do falownika fluorescencyjnego z zimną katodą za pomocą zacisku krokodylkowego.

Ustaw zasilanie prądem stałym falownika na dwa wolty. Uruchom urządzenie do podwójnego łączenia z zalecanymi natężeniami przepływu. Zbierz krople do probówek PCR z około 50 mikrolitrami emulsji w każdej probówce.

Przed cyklem termicznym należy ostrożnie usunąć dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąpić je olejem fluorowanym FC-40 zawierającym środek powierzchniowo czynny PFPE-PEG o natężeniu 5% wagowym. Następnie zaprogramuj cykl. Aby odzyskać DNA z kropelek cyklu termicznego, należy zebrać kropelki w probówce do mikrowirówki i rozbić emulsje za pomocą 20 mikrolitrów PFO.

Wiruj je przez 10 sekund, aby wymieszać. Zakręć rurką. Ostrożnie usunąć górną warstwę wody z probówki za pomocą pipety i przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki.

Wyrzuć fazę olejową. Następnie przejdź do etapów przygotowania, sekwencjonowania i analizy biblioteki. Histogram liczby kodów kreskowych w stosunku do wielkości grupy pokazuje, że znaczna część prawidłowych grup kodów kreskowych znajduje się nieco powyżej 7,5 kilopar zasad na rozmiar progowy grupy, co wyklucza sieroty z mutacją PCR.

Względna obfitość typów komórek z syntetycznej 10-komórkowej społeczności trzech bakterii Gram-ujemnych, pięciu bakterii Gram-dodatnich i dwóch drożdży została obliczona przez zliczenie surowych odczytów i grup kodów kreskowych. Kołowa mapa zasięgu odczytów B.subtilis ze wszystkich grup kodów kreskowych ilustruje jednorodność odczytów sekwencyjnych SiC, bez obserwowalnych obszarów zaniku, w których średnie pokrycie wynosiło 5,55X. Jednorodność pokrycia zweryfikowano za pomocą rozkładu częstości znormalizowanych wartości pokrycia.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby utrzymać szybkość enkapsulacji wynoszącą około jednego kodu kreskowego lub komórki na każde 10 kropel. Ogranicza to prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia podwójnej enkapsulacji, które może splątać dane z pojedynczej komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe używane do generowania danych sekwencjonowania pojedynczych komórek.

Po opanowaniu tej techniki można ją uruchomić w ciągu ośmiu godzin lub dwóch czterogodzinnych dni.