Name: Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do sekwencjonowania genomu pojedynczych komórek zachowującą heterogeniczność genomową. Technika umożliwia analizę dziesiątek tysięcy komórek z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation poprzez CAREER Award (numer grantu DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (numery grantów HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); oraz Defense Advanced Research Projects Agency Living Foundries Program (numery umów HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

Patenty związane z tym przepływem pracy mogą być licencjonowane przez firmę Mission Bio, której udziałowcem jest Adam R. Abate.

Mikroprzepływowy przepływ pracy SiC-seq generuje dane sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki z tysięcy komórek bakteryjnych. Cyfrowe kody kreskowe wplecione w genomy komórek otoczonych mikrożelem pozwalają na dekonwolucję in silico danych NGS na grupy odczytów kodów kreskowych pochodzących z tej samej komórki. Eksperyment kontrolny na zbiorowisku drobnoustrojów o znanym składzie jest niezbędny do oceny czystości grup kodów kreskowych. Duża część grup o niskiej czystości wskazuje, że szybkość enkapsulacji komórek jest zbyt wysoka lub że podczas etapów przetwarzania mikroprzepływowego dochodzi do znacznego zanieczyszczenia krzyżowego kropelkami. Zgodnie ze statystykami Poissona, kody kreskowe i komórki powinny być zamknięte w docelowej proporcji 1 cząstki na każde 10 kropli, aby ograniczyć częstotliwość wielokrotnych zdarzeń enkapsulacji do mniej niż 5% wszystkich niepustych kropel. Wyższy współczynnik enkapsulacji zwiększa wykładniczo wskaźniki dubletów, dlatego weryfikacja współczynnika enkapsulacji podczas procesu wytwarzania kropli ma kluczowe znaczenie. Użytkownicy powinni zachować szczególną ostrożność w przypadku enkapsulacji wielu komórek w jednym mikrożelu, ponieważ odczyty z różnych komórek o tej samej sekwencji kodu kreskowego nie mogą być bioinformatyczne oddzielone. W przypadku, gdy 1 komórka otrzymuje 2 różne kody kreskowe, czystość grupy kodów kreskowych pozostaje nienaruszona, chociaż wskaźniki obfitości są zniekształcone podczas liczenia według sekwencji kodów kreskowych.
Zanieczyszczenie krzyżowe kropelkowe może również powstać z powodu nieoptymalnych warunków łączenia. Podczas udanej operacji urządzenie do łączenia mikroprzepływów (rysunek 5) może w kontrolowany sposób sparować 1 kroplę kodu kreskowego z 1 mikrożelem i objętością odczynnika PCR. Nieidealne natężenie przepływu spowoduje parowanie kropel w nieprawidłowych proporcjach: na przykład 1 kod kreskowy można sparować z 2 mikrożelami. Wszystkie natężenia przepływu wymienione w protokole mają charakter szacunkowy i mogą wymagać dostosowania w zależności od niewielkich różnic w geometrii urządzenia i rozmiarach kropel. Użytkownicy mający dostęp do kamer z możliwością szybkiego nagrywania (>10 000 klatek/s) powinni zweryfikować prawidłowe łączenie się kropel na początku i w trakcie operacji mikroprzepływowej. Użytkownicy, którzy nie mają dostępu do szybkiej kamery, mogą zebrać niewielką objętość połączonych danych wyjściowych i ręcznie zmierzyć rozmiary kropel pod mikroskopem. Wielkość kropel powinna być jednolita: nadmiar niepołączonych kodów kreskowych lub kropli mikrożelu wskazuje, że należy odpowiednio zmniejszyć szybkość ponownego wstrzykiwania.
Podczas obchodzenia się z mikrożelami i mikrokropelkami należy podjąć kilka ogólnych środków ostrożności, aby zachować ich integralność. Mikrożele, choć wytrzymałe mechanicznie, muszą być wystarczająco schłodzone przed etapem łamania i mycia, aby zapewnić całkowite żelowanie. Niesferyczne mikrożele wskazują, że agaroza nie miała odpowiedniego czasu na zestalenie. Podczas mycia mikrożeli należy odwirować zawiesiny z wymaganą prędkością, aby uniknąć utraty produktu. Hydrożel agarozowy ma współczynnik załamania światła ściśle zbliżony do indeksu wody i może być trudny do zauważenia w probówce22, dlatego użytkownicy powinni dokładnie określić granicę żel-ciecz przed aspiracją. Kropelki wody w oleju są podatne na koalescencję w wyniku narastania sił statycznych23 na rękawicach laboratoryjnych i rurkach. Z tego powodu zalecamy załadowanie strzykawek do ponownego wstrzykiwania kropelek gołymi rękami i potraktowanie wszystkich przewodów do ponownego wstrzykiwania pistoletem antystatycznym przed zalaniem pompy. Duże połączone kropelki można usunąć, powoli obracając emulsje w strzykawce i ręcznie zasysając większe krople, które gromadzą się w pobliżu góry ze względu na ich większą siłę wyporu.
SiC-seq to pierwsza technologia, która demonstruje sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki > 50 000 komórek bakteryjnych. Platforma ta oferuje znaczne korzyści w zakresie przepustowości w porównaniu z istniejącymi podejściami i umożliwia dokładniejsze pobieranie próbek heterogenicznych społeczności mikroorganizmów. Do tej pory technologie mikroprzepływowe do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki wykorzystywały mikrokomory9 i mikrostudzienki24 do izolacji i amplifikacji komórek, ale z przepustowością w zakresie zaledwie dziesiątek do setek komórek. Sortowanie przepływowe pojedynczych komórek do płytek studzienkowych 5,6 nie wymaga specjalistycznego oprzyrządowania mikroprzepływowego, ale charakteryzuje się podobnie niską przepustowością. Biorąc pod uwagę, że próbki gleby i wody ze środowiska zwykle mają różnorodność alfa wynoszącą >1000 na poziomie gatunku25,26, sekwencja SiC jest bardzo korzystna ze względu na jej zdolność do pobierania próbek znacznie większej liczby organizmów. Przepływ pracy SiC-seq można dostosować do danych wejściowych z hodowli laboratoryjnej, środowiska naturalnego lub żywego gospodarza. Próbka komórkowa musi być jedynie w zawiesinie wodnej i wolna od dużych cząstek (>10 μm), aby nadawała się do enkapsulacji mikroprzepływowej. Na przykład metoda ta została wcześniej zastosowana do próbki wody morskiej przy użyciu szeregu etapów płukania i filtrowania w celu wstępnego przetworzenia komórek przed enkapsulacją17.
Protokół SiC-seq generuje stosunkowo niewielką ilość danych sekwencjonowania z każdej pojedynczej komórki i może nie być odpowiedni dla wszystkich zastosowań. Niektóre algorytmy bioinformatyczne, takie jak składanie genomu de novo lub wywoływanie wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), wymagają większej głębokości pokrycia, aby działać skutecznie. Zamiast tego grupy kodów kreskowych mogą być grupowane in silico za pomocą taksonomicznych metod kategoryzacji27 , dzięki czemu algorytmy mogą być stosowane do większych zestawów odczytów. Stosunkowo niska ogólna wydajność kodów kreskowych w przepływie pracy SiC-seq może również stanowić wyzwanie w przypadkach, gdy dostępność próbki wejściowej jest niska. SiC-seq opiera się na etapie enkapsulacji kodów kreskowych z dystrybucją Poissona, dlatego około 10% komórek otrzymuje molekularny kod kreskowy i jest wzmacniane na ostatnim etapie przygotowania biblioteki. Chociaż jest to porównywalne z innymi schematami kodowania kreskowego opartymi na mikrokropelkach10, użytkownicy pracujący z cennymi próbkami komórek mogą mieć trudności z osiągnięciem odpowiedniej wydajności biblioteki do sekwencjonowania i mogą być zmuszeni do zwiększenia liczby cykli PCR na końcowym etapie amplifikacji. Innym potencjalnym rozwiązaniem dla użytkowników posiadających wiedzę z zakresu mikroprzepływów jest sortowanie dodatnich kropelek kodów kreskowych po etapie cyfrowego PCR, co zwiększa ogólną wydajność kodów kreskowych do >85%28.
Potencjalnym przyszłym kierunkiem rozwoju technologii SiC-seq jest dostosowanie przepływu pracy do użytku z komórkami ssaków, torując drogę do nowych badań klinicznych na pojedynczych komórkach. Na przykład analiza zmienności liczby kopii wśród pojedynczych komórek nowotworowych może pogłębić nasze zrozumienie roli heterogeniczności w patologii raka2. Alternatywnie, zintegrowanie SiC-seq z istniejącymi metodami badania i wzbogacania sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania29 umożliwiłoby ukierunkowane sekwencjonowanie pojedynczych komórek subpopulacji lub rzadkich szczepów komórek. Dzięki próbkom środowiskowym można było namierzyć geny pochodzące ze znanego szlaku metabolicznego i przeanalizować je kontekstowo wraz z sąsiednimi genami w celu zidentyfikowania nowych wysp genomowych. Z poziomu ludzkiego środowiska gospodarza można wyizolować próbki bakterii chorobotwórczych o niskim mianie i zsekwencjonować je na poziomie pojedynczej komórki, aby dokładniej zbadać ich genotypowe pochodzenie zjadliwości.

Genom służy jako plan tożsamości i funkcji komórki, zawierający całość potencjału kodującego organizmu. Zrozumienie biologii komórkowej na poziomie genomu może wyjaśnić obserwowaną różnorodność fenotypową w heterogenicznych populacjach komórek. Ta heterogeniczność jest widoczna w systemach biologicznych i ma szerokie implikacje dla zdrowia i chorób ludzkich. Na przykład różnice w liczbie kopii genów wśród komórek nowotworowych są związane z ewolucją i rozprzestrzenianiem się raka1,2. W infekcjach bakteryjnych wyspy chorobotwórczości obecne w niewielkiej części genomów mogą być przenoszone poziomo i prowadzić do namnażania się bakterii opornych na antybiotyki3,4. Podstawowym wyzwaniem w badaniu genomów na poziomie pojedynczej komórki jest niewielka ilość dostępnego DNA, a także konieczność analizy tysięcy komórek w celu pobrania próbki pełnej różnorodności genotypów. Z tych powodów ograniczenia w przepustowości eksperymentalnej utrudniły skuteczność badań na pojedynczych komórkach, wypaczając wyniki w kierunku najliczniejszych komórek. Techniki izolacji pojedynczych komórek, takie jak sortowanie przepływowe5,6, pęseta optyczna7, osadzanie w żelach luzem8 i microfluidics9 są w stanie przetwarzać setki komórek do sekwencjonowania; Stanowi to jednak tylko niewielki ułamek większości próbek. Metoda sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki o znacznie większej przepustowości pozwoliłaby na głębsze i pełniejsze profilowanie populacji komórek, wyjaśniając w ten sposób rolę różnorodności genotypowej w tych społecznościach.
Mikrofluidyka kropelkowa umożliwia wysokoprzepustową manipulację komórkami i odczynnikami biologicznymi w milionach reaktorów o skali pikolitrowej. Do tej pory technologie mikrokropelek były wykorzystywane do badania zróżnicowanych wzorców ekspresji między komórkami z heterogenicznych tkanek10,11,12, głęboko sekwencjonuj długie cząsteczki13,14,15, oraz przeprowadzaj analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChiP-seq) na pojedynczych komórkach16. Rzeczywiście, mikrokropelki są zdolne do wysokoprzepustowych, podzielonych na przedziały operacji, dzięki czemu można je stosować w genomice pojedynczej komórki. Rozwój tej technologii wiąże się jednak z unikalnymi wyzwaniami technologicznymi. Komórki muszą być poddawane lizie, oczyszczane i amplifikowane z minimalnym odchyleniem, aby równomiernie pobrać próbki z populacji komórek. Dodatkowo, w przeciwieństwie do poliadenylowanych transkryptów mRNA w komórkach ssaków, w genomie nie ma porównywalnego motywu molekularnego, który ułatwiałby wychwytywanie docelowego kwasu nukleinowego. Z tych powodów sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki było trudne do wdrożenia na platformach mikrokropelkowych.
W tej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół naszego wcześniej opisanego podejścia mikroprzepływowego do pojedynczych komórek, zdolnego do sekwencjonowania genomów dziesiątek tysięcy komórek w jednym eksperymencie17. Dzięki tej technologii, zwanej SiC-seq, komórki bakteryjne są zamykane w hydrożelach w skali mikronowej i indywidualnie lizowane, znakowane i łączone z mikrokropelką zawierającą unikalny oligonukleotydowy kod kreskowy, który jest spleciony z genomowym DNA komórki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z pojedynczym nałożeniem na siebie (PCR). Hydrożele służą jako izolowane pojemniki, w których genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest sterycznie zamknięte, umożliwiając mniejszym cząsteczkom, takim jak detergenty i enzymy lityczne, dostęp i oczyszczenie DNA przed kodowaniem kreskowym18. Protokół ten przetwarza >50 000 pojedynczych komórek w ciągu kilku godzin, w wyniku czego powstaje biblioteka kodów kreskowych gotowa do sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu odczyty są demultipleksowane zgodnie z sekwencją kodów kreskowych w jednej komórce, w wyniku czego powstaje zestaw danych składający się z milionów odczytów, z których każdy ma indeks komórkowy.

<table><tbody><tr><td>3-calowe wafle krzemowe, typ P, klasa dziewicza</td> klasy <td>testowej Wafle uniwersyteckie</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotorezystor</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>powlekarka wirowa</td><td>Specjalistyczne systemy powłok</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Fotomaski</td><td>CadArt Servcies</td> <td>(niestandardowe)</td><td>Zobacz pliki uzupełniające do projektów masek</td></tr><tr><td>Programista PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr> Zestaw elastomerów silikonowych <tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Komora</td> odgazowująca Krayden <td>4019862</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe szklane (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (hydrofobowa obróbka szkła)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe PE-2</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Igły BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge</td><td>Pompa</td><td></td> strzykawkowa BD 305109 <td></td></tr> New <tr><td></td><td>Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 olej fluorowany ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 olej fluorowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>Środek powierzchniowo czynny PEG-PFPE</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfaktant</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik Lasko</td><td>&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7,4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (medium gradientu gęstości)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (monooleinian sorbitanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym typu IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza (enzym lityczny drożdży)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lizostafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylowy siarczan litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (barwienie kwasami nukleinowymi)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (etoksylat oktylofenolu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Zestaw do przygotowania biblioteki DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>Nowa Anglia Nauki biologiczne</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polimeraza (polimeraza izotermiczna)</td><td>Bufor New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT z zestawu Nextera XT (bufor neutralizacyjny)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Inwerter fluorescencyjny z zimną katodą</td> <td>(niestandardowy)</td> <td>(niestandardowy)</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 pistolet antystatyczny</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>wydrukowany w 3D uchwyt na strzykawkę wirówki</td> <td>(niestandardowy)</td> <td>(niestandardowy)</td><td>Zobacz pliki uzupełniające do pliku do druku 3D</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Koncentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Technologie sekwencjonowania przeszły zmianę paradygmatu z rozdzielczości masowej na jednokomórkową w odpowiedzi na rozwijające się zrozumienie roli heterogeniczności komórkowej w systemach biologicznych. Jednak sekwencjonowanie pojedynczych komórek w dużych populacjach jest utrudnione przez ograniczenia w przetwarzaniu genomów do sekwencjonowania. W tym artykule opisujemy metodę sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki (SiC-seq), która wykorzystuje mikrofluidykę kropelkową do izolacji, amplifikacji i kodowania kreskowego genomów pojedynczych komórek. Enkapsulacja komórek w mikrożelach umożliwia przedziałowe oczyszczanie i znakowanie DNA, podczas gdy fuzja mikroprzepływowa skutecznie łączy każdy genom z unikalnym kodem kreskowym oligonukleotydu pojedynczej komórki, umożliwiając sekwencjonowanie > 50 000 pojedynczych komórek w jednym przebiegu. Dane sekwencjonowania są demultipleksowane za pomocą kodu kreskowego, generując grupy odczytów pochodzących z pojedynczych komórek. Jako metoda sekwencjonowania pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości i niskim odchyleniu, SiC-seq umożliwi szerszy zakres badań genomicznych ukierunkowanych na różne populacje komórek.

Procedura eksperymentalna SiC-seq obejmuje 3 mikroprzepływowe urządzenia PDMS wykonane metodą miękkiej litografii (Rysunek 1). Generator kropel współpłynnych (Rysunek 3A) wytwarza krople cyfrowych kodów kreskowych o rozmiarze 25 µm służące do znakowania DNA genomowego unikalnym identyfikatorem pojedynczej komórki. Oligonukleotydy kodów kreskowych składają się z 15 bp sekwencji zdegenerowanej, flankowanej przez uchwyty PCR do amplifikacji (Tabela 2, starter BAR). Kody kreskowe rozcieńcza się do stężenia femtomolarnego, aby uzyskać enkapsulację pojedynczych cząsteczek, tak aby każda kropla zawierała 0 lub 1 fragment kodu. Krople zawierające kod są amplifikowane, co daje wiele kopii dwuniciowych amplikonów kodów kreskowych. Barwnik kwasów nukleinowych jest wykorzystywany do weryfikacji pomyślnej amplifikacji oraz ilościowego określenia stopnia enkapsulacji fragmentów kodów kreskowych (Rysunek 4B). Mikrzele są generowane poprzez współpłynięcie zawiesiny komórek bakteryjnych i stopionego żelu agarozy przy równych prędkościach przepływu (Rysunek 2A). Agarozę przygotowuje się w dwukrotności pożądanej stężenia końcowego, ponieważ proces generowania kropel współpłynnych skutecznie rozcieńcza roztwory wodne dwukrotnie. W miarę stygnięcia agaroza krzepnie, tworząc mikrzele o średnicy 25 µm zajmujące sferyczną objętość kropli.
Seria etapów przemywania i lizy służy do oczyszczania wysokocząsteczkowego DNA genomowego w mikrogelach (Rysunek 2B). Po rozbiciu emulsji przeprowadza się przemywania wodne w dużych objętościach, aby rozcieńczyć śladowe ilości rozpuszczalników organicznych, które mogą hamować późniejsze procesy enzymatyczne. Przemyte mikrogela obserwuje się pod mikroskopem w celu zweryfikowania stopnia enkapsulacji komórek (Rysunek 4A). Do zawiesiny mikrogeli dodaje się koktajl enzymów o szerokim spektrum aktywności litycznej w celu strawienia ścian komórkowych bakterii i mikroorganizmów eukariotycznych19. Druga obróbka z użyciem Proteinazy K i detergentu degraduje białka i solubilizuje szczątki komórkowe.
Tagmentację oczyszczonego DNA przeprowadza się w kropelkach, aby uniknąć potencjalnej kontaminacji krzyżowej wynikającej z dyfuzji niewielkich fragmentów tagmentowanego DNA między mikrogelami18. Urządzenie do enkapsulacji w kropelkach (Ryc. 3B) wydziela każdy mikrogel wraz z buforem i enzymem do tagmentacji, który jednocześnie fragmentuje dwuniciowe DNA i „oznacza” je załadowanym wcześniej oligonukleotydem20. Mikrogele są ładowane do kropelek jako gęsto upakowane cząsteczki, co pozwala osiągnąć stopień enkapsulacji bliski 1 mikrogelowi na każdą kropelkę, z niewielką liczbą dubletów21 (Ryc. 4C).
W ostatnim kroku procesu mikroprzepływowego (Rysunek 2C), urządzenie wykonuje operację podwójnego łączenia, łącząc 1 kroplę z kodem kreskowym, 1 kroplę zawierającą mikrogel oraz mieszaninę do amplifikacji w kontrolowanym, dwuetapowym procesie. Najpierw kropla zawierająca odczynnik PCR zostaje sparowana i połączona z kroplą z kodem kreskowym w obszarze zaznaczonym na żółto (Rysunek 5). Elektrody solankowe w kanale mikroprzepływowym wytwarzają wysoki gradient pola elektrycznego, który inicjuje łączenie kropel. W podobny sposób pierwsza połączona kropla zostaje sparowana z kroplą mikrogelu i połączona po raz drugi w obszarze zaznaczonym na czerwono. Krople są zbierane i poddawane cyklom termicznym poza układem (off-chip) w reakcji PCR z jednokrotnym przedłużeniem nakładki (SOE PCR). Nakładające się komplementarne końce kodu kreskowego i tagmentowanego DNA genomowego umożliwiają fuzję i wykładniczą amplifikację wyłącznie prawidłowo okodowanych konstruktów.
Dane z sekwencjonowania są najpierw filtrowane pod kątem jakości odczytów, a następnie analizowane poprzez grupowanie odczytów zgodnie z ich 15-bp sekwencją kodów kreskowych dla pojedynczych komórek. Aby grupa kodów kreskowych została uznana za prawidłową, musi zawierać minimalną liczbę odczytów; takie progowanie ogranicza analizę do komórek z użyteczną ilością danych sekwencyjnych i usuwa z zestawu danych „sieroty”, czyli kody kreskowe zmutowane w wyniku PCR. W tym przykładowym przebiegu wartość minimalna została ustawiona na 7,5 kbps na grupę (50 odczytów po 150 bp każdy). Histogram liczby kodów kreskowych w stosunku do wielkości grupy pokazuje, że znaczna część prawidłowych grup kodów kreskowych znajduje się tuż powyżej wartości progowej (Rysunek 6A).
W eksperymencie kontrolnym, w którym skład społeczności mikrobiologicznej jest znany, do oceny jakości przebiegu SiC-seq wykorzystuje się wskaźniki czystości i względnej liczebności. W tym przypadku analizowana jest syntetyczna społeczność 10 komórek składająca się z 3 bakterii gram-ujemnych, 5 bakterii gram-dodatnich i 2 drożdży. Czystość danej grupy kodów kreskowych definiuje się jako liczbę odczytów mapujących do najczęstszego genomu w grupie podzieloną przez całkowitą liczbę odczytów w grupie. Zdecydowana większość grup kodów kreskowych wykazuje czystość przekraczającą 0,95 (Rysunek 6B). Względna liczebność typów komórek jest obliczana poprzez zliczanie surowych odczytów oraz zliczanie grup kodów kreskowych, gdzie grupom przypisuje się typ komórki odpowiadający konsensusowi odczytów będących ich członkami (Rysunek 6C). Liczebność odczytów i grup kodów kreskowych przebiega w zbliżonych proporcjach, co wskazuje, że populacje komórek są próbkowane w taki sposób, że niektóre gatunki nie są zawarte w nieproporcjonalnie małych lub dużych grupach kodów kreskowych. Wykreślenie zagregowanego pokrycia wszystkich grup kodów kreskowych z jednego gatunku wskazuje na wysokie pokrycie w obrębie całego genomu, z niewielką liczbą regionów z brakami (dropout) lub ich całkowitym brakiem (Rysunek 7). Jednolitość pokrycia można zweryfikować za pomocą rozkładu częstości znormalizowanych wartości pokrycia, w którym większość wartości skupia się wokół średniej (Rysunek 7, wstawka).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych metodą fotolitografii. (A) Formy matrycowe o pojedynczej wysokości struktur wytwarza się poprzez nanoszenie warstwy fotorezystu SU-8 na wafer krzemowy metodą spin coatingu. Następnie fotorezyst jest naświetlany przez maskę fotolitograficzną światłem UV, co powoduje sieciowanie naświetlonego SU-8. Na koniec nienasiękowany SU-8 zostaje rozpuszczony w kąpieli wywoływacza. Powstałą formę wykorzystuje się do odlewania PDMS, który jest następnie wiązany z szkiełkiem przedmiotowym w celu uzyskania kompletnego urządzenia mikroprzepływowego. (B) W przypadku urządzenia dwuwarstwowego proces wytwarzania analogicznie rozpoczyna się od etapów nanoszenia warstwy i naświetlania. Kroki te są następnie powtarzane w celu stworzenia urządzenia dwuwarstwowego. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Przegląd schematu pracy SiC-seq. (A) Zawiesina drobnoustrojów jest wprowadzana wspólnie z roztopioną agarozą do urządzenia do tworzenia kropli w celu enkapsulacji pojedynczych komórek w mikrożelach. (B) Mikrożele poddawane są serii płukań w celu oczyszczenia bakteryjnego DNA genomicznego. Enzymy lityczne trawią ściany komórkowe bakterii gram-dodatnich i drożdżaków, a detergent solubilizuje szczątki komórkowe. Mikrożele są ponownie enkapsulowane w kroplach w celu przeprowadzenia tagmentacji, aby zredukować zanieczyszczenia krzyżowe. (C) Mikrofluidyczny merger łączy kod kreskowy cyfrowego PCR, tagmentowany genom w mikrożelu oraz mieszaninę do amplifikacji z częstotliwością &#62;1 kHz. Poza układem (off-chip) SOE-PCR łączy unikalny kod kreskowy pojedynczej komórki z tagmentowanym genomem i selektywnie amplifikuje w pełni obarkodowane konstrukty. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Urządzenia mikroprzepływowe do wytwarzania kropel i ponownej enkapsulacji mikrożeli. (A) Ten panel przedstawia wytwórcę kropel w układzie współpływu (wysokość kanału 25 µm). Komórki i stopiona agaroza są wprowadzane do urządzenia z takimi samymi prędkościami przepływu, aby wytworzyć krople o średnicy 25 µm w złączu o wymiarach 25 µm x 25 µm. W przypadku wytwarzania kropel z cyfrowym kodem kreskowym wlot komórkowy zostaje zablokowany, a do wlotu agarozy wprowadzana jest mieszanina PCR. (B) Ten panel przedstawia urządzenie do ponownej enkapsulacji mikrożeli (wysokość kanału 25 µm). Mikrożele przepływają przez lejkowaty wlot, aby zachować ich gęste upakowanie, a następnie otrzymują objętość mieszaniny do tagmentacji przed ponowną enkapsulacją w złączu o wymiarach 25 µm x 30 µm. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Mikrografie kropli i mikrożeli. (A) Ten panel przedstawia wypłukane mikrożele o średnicy 25 µm przed lizą enzymatyczną. Bakterie zostały zabarwione fluorescencyjnie w celu ilościowego oznaczenia stopnia enkapsulacji. Statystyka rozkładu Poissona wskazuje, że komórki powinny być enkapsulowane w tempie 1 na 10 kropli lub mniej, aby zminimalizować częstotliwość zdarzeń wielokrotnej enkapsulacji. (B) Ten panel przedstawia obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kropli z cyfrowym kodem kreskowym o średnicy 25 µm, poddanych zabarwieniu kwasami nukleinowymi. Krople zawierające amplifikowane fragmenty kodów kreskowych emitują silny sygnał fluorescencyjny. (C) Ten panel przedstawia mikrożele ponownie enkapsulowane w kroplach o średnicy 50 µm. Gęste upakowanie mikrożeli pozwala na osiągnięcie stopnia enkapsulacji bliskiego 1 żelowi na kroplę przy niewielkiej liczbie dubletów. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Mikroprzepływowe urządzenie do podwójnego łączenia kropel przeznaczone do kodowania paskowego genomu pojedynczych komórek. Dwuetapowa operacja łączenia pozwala na wysokoprzepustowe parowanie kropel z kodem kreskowym z tagmentowanymi genomami. Najpierw generowana jest kropla mieszaniny PCR, która zostaje połączona z kroplą kodu kreskowego w obszarze zaznaczonym na żółto za pomocą elektrod solankowych. Następnie wprowadzana jest kropla zawierająca mikrogel, która zostaje połączona po raz drugi w obszarze zaznaczonym na czerwono. Wloty oleju umożliwiają precyzyjną kontrolę odstępów między ponownie wstrzykiwanymi kroplami. Komora ponownego wstrzykiwania kodu kreskowego oraz olej separatorowy są umieszczone w cieńszej warstwie o grubości 25 µm, zaznaczonej na niebiesko. Pozostałe elementy urządzenia znajdują się w warstwie grubszej o całkowitej wysokości 45 µm. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Metryki grup kodów kreskowych dla syntetycznej społeczności mikrobiologicznej składającej się z 10 komórek. (A) Ten panel przedstawia rozkład wielkości grup kodów kreskowych. Liczba grup danej wielkości maleje wykładniczo wraz ze wzrostem wielkości grupy. Minimalny próg 7,5 kbps na grupę ogranicza analizę do grup zawierających wystarczającą ilość informacji i usuwa „sieroty”, czyli sekwencje zmutowane podczas PCR. (B) Ten panel przedstawia rozkład czystości grup kodów kreskowych. Zdecydowana większość (&gt;90%) grup wykazuje bardzo wysoką czystość (&gt;95%). (C) Ten panel przedstawia względną liczność 10 gatunków obliczoną na poziomie odczytów oraz na poziomie grup kodów kreskowych. Obie metody zliczania dają podobne wyniki, co wskazuje na spójność wielkości grup kodów kreskowych pomiędzy gatunkami. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg" /> 
Rycina 7Zagregowane pokrycie genomowe dla Bacillus subtilis grupy kodów kreskowych Odczyty ze wszystkich grup kodów kreskowych mapujące do bakterii B. subtilis (N = 9 398) zostają połączone i przeanalizowane zbiorczo. Kołowa mapa pokrycia ilustruje jednorodność pokrycia odczytów SiC-seq, bez widocznych regionów luk (dropout). Przerywana linia wokół obwodu wskazuje średnie pokrycie (5,55x). Wstawiony histogram względnych częstotliwości pokrycia pokazuje, że większość zasad jest pokryta na głębokości zbliżonej do średniej dla całego genomu, reprezentowanej przez linię przerywaną. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urządzenie</td>
			<td>Wysokość pierwszej warstwy (&#181;m)</td>
			<td>Prędkość wirowania pierwszej warstwy (obr./min)</td>
			<td>Wysokość drugiej warstwy (&#181;m)</td>
			<td>Prędkość wirowania drugiej warstwy (obr./min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Współpływowy generator kropel</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urządzenie do ponownej enkapsulacji w żelu</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podwójna fuzja</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych. Tabela ta zawiera wykaz urządzeń mikroprzepływowych wykorzystywanych w procesie SiC-seq wraz z wymaganymi prędkościami nanoszenia fotorezystu metodą spin coatingu (na podstawie specyfikacji producenta dla SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Etykieta</td>
			<td colspan="5">Sekwencja (5' &#62; 3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD_KRESKOWY_DNA</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I7_CZYTAJ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sekwencje starterów.
Plik uzupełniający 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania >50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie danych sekwencjonowania genomu za pomocą kodów kreskowych z dziesiątek tysięcy pojedynczych komórek przy użyciu szeregu urządzeń mikroprzepływowych. Ta metoda zapewnia niezrównaną przepustowość sekwencjonowania pojedynczych komórek. Używamy mikrofluidyki do kapsułkowania, lizy i kodowania kreskowego komórek indywidualnie, zachowując podstawową heterogeniczność genomu, która jest tracona w konwencjonalnym szoku w badaniach sekwencjonowania.Główną zaletą tej techniki jest wysoka przepustowość i zdolność do generowania danych jednokomórkowych z dziesiątek tysięcy komórek. Chociaż w tej demonstracji pracujemy z mikroorganizmami, przepływ pracy można dostosować do użytku z różnymi typami komórek poprzez niewielkie modyfikacje wymiarów urządzenia mikroprzepływowego. Aby rozpocząć protokół, przygotuj jeden mililitr 3% masy na objętość agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze 1X Tris-EDTA lub TE.Trzymaj roztwór agarozy na bloku grzewczym o temperaturze 90 stopni Celsjusza tylko do momentu załadowania strzykawki. Zawieś komórki w jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS i odwiruj komórki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze 17% objętości do pożywki gradientu gęstości objętościowej w PBS i utrzymywać komórki na lodzie do momentu załadowania strzykawki.Następnie załaduj trzymililitrową strzykawkę olejem fluorowanym lub HFE, zawierającym środek powierzchniowo czynny PFPE-PEG o masie 2%. Wyposażyć go w igłę o rozmiarze 27 i umieścić w pompie strzykawkowej. Załaduj zawiesinę komórek i stopioną agarozę do jednomililitrowych strzykawek, które pasują do igieł o rozmiarze 27 i umieść je w pompkach strzykawkowych.Następnie ustaw grzejnik na wysoki poziom i ustaw powierzchnię grzewczą w odległości 10 centymetrów od strzykawki. Upewnij się, że temperatura mierzona na strzykawce wynosi około 80 stopni Celsjusza. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.Podłącz igły strzykawki do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki z polietylenu lub PE. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w 15-mililitrowej probówce zbiorczej. Po przygotowaniu kropli umieść probówkę zbiorczą w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut, aby zapewnić całkowite zżelowanie agarozy.Usunąć dolną warstwę oleju z probówki zbiorczej za pomocą trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20G, uważając, aby nie naruszyć górnej warstwy kropelek agarozy. Dodaj jeden mililitr 10% objętości na objętość PFO w HFE, aby rozbić krople agarozy z ich warstwy środka powierzchniowo czynnego. Pipetować roztwór w górę i w dół przez jedną minutę, aby dokładnie pokryć emulsje, które powinny być jednorodne i wolne od grudek.Obracaj stożkową probówkę 2 000 razy g przez jedną minutę, aby zebrać mikrożele agarozy. Odessać supernatant PFO/HFE i upewnić się, że mikrożele są teraz wolne od warstwy środka powierzchniowo czynnego i są klarowne. Po umyciu mikrożeli sprawdź enkapsulację komórek w mikrożelach pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu, barwiąc 10-mikrolitrową porcję żeli barwieniem 1X kwasu nukleinowego.Zatkaj wlot ogniw urządzenia do wkraplacza z przepływem małym kawałkiem lutu ołowiowego. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w 0,2-mililitrowej probówce PCR.Wykorzystaj natężenie przepływu na ekranie do tworzenia kropli. Zbierz krople do probówek PCR z około 50 mikrolitrami kropli w każdej probówce. Po wykonaniu kropli ostrożnie usuń dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąp ją olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% wagowo środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG.Następnie zaprogramuj cykl termiczny. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłączyć strzykawki zawierające HFE, mieszankę do znakowania i mikrożele do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE.Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w pustej strzykawce o pojemności jednego mililitra z tłokiem przyciągniętym do linii o pojemności jednego mililitra. Następnie sprawdź szybkość kapsułkowania mikrożelu pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. Wyposażyć strzykawkę zawierającą emulsje znakujące w igłę i inkubować ją w pozycji pionowej w bloku grzewczym lub piekarniku przez godzinę w temperaturze 55 stopni Celsjusza w celu fragmentacji genomowego DNA.Przygotuj kropelki kodu kreskowego do połączenia, zastępując frakcję olejową FC-40 HFE 2%wagowo PFPE-PEG. Ostrożnie przenieś krople do jednomililitrowej strzykawki, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej. Załadować inkubowaną i oznakowaną strzykawkę z kroplami mikrożelu do pompy strzykawkowej.Następnie podłącz trzy strzykawki z chlorkiem sodu do dwóch wlotów elektrod i pojedynczego wlotu fosy za pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu. Podłącz trzy strzykawki HFE zamontowane na pompach do dwóch wlotów oleju dystansowego i wlotu oleju do wytwarzania kropli za pomocą kawałków rurki PE.Następnie przestrzel wszystkie rurki do ponownego wstrzykiwania kropelek pistoletem antystatycznym przed podłączeniem rurki do igieł strzykawki. Podłącz strzykawkę z mieszanką PCR, strzykawkę z mikrożelem i strzykawkę z kodem kreskowym do odpowiednich wlotów za pomocą rurki PE. Podłącz igłę strzykawki z elektrodą do falownika fluorescencyjnego z zimną katodą za pomocą zacisku krokodylkowego.Ustaw zasilanie prądem stałym falownika na dwa wolty. Uruchom urządzenie do podwójnego łączenia z zalecanymi natężeniami przepływu. Zbierz krople do probówek PCR z około 50 mikrolitrami emulsji w każdej probówce.Przed cyklem termicznym należy ostrożnie usunąć dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąpić je olejem fluorowanym FC-40 zawierającym środek powierzchniowo czynny PFPE-PEG o natężeniu 5% wagowym. Następnie zaprogramuj cykl. Aby odzyskać DNA z kropelek cyklu termicznego, należy zebrać kropelki w probówce do mikrowirówki i rozbić emulsje za pomocą 20 mikrolitrów PFO.Wiruj je przez 10 sekund, aby wymieszać. Zakręć rurką. Ostrożnie usunąć górną warstwę wody z probówki za pomocą pipety i przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki.Wyrzuć fazę olejową. Następnie przejdź do etapów przygotowania, sekwencjonowania i analizy biblioteki. Histogram liczby kodów kreskowych w stosunku do wielkości grupy pokazuje, że znaczna część prawidłowych grup kodów kreskowych znajduje się nieco powyżej 7,5 kilopar zasad na rozmiar progowy grupy, co wyklucza sieroty z mutacją PCR.Względna obfitość typów komórek z syntetycznej 10-komórkowej społeczności trzech bakterii Gram-ujemnych, pięciu bakterii Gram-dodatnich i dwóch drożdży została obliczona przez zliczenie surowych odczytów i grup kodów kreskowych. Kołowa mapa zasięgu odczytów B.subtilis ze wszystkich grup kodów kreskowych ilustruje jednorodność odczytów sekwencyjnych SiC, bez obserwowalnych obszarów zaniku, w których średnie pokrycie wynosiło 5,55X. Jednorodność pokrycia zweryfikowano za pomocą rozkładu częstości znormalizowanych wartości pokrycia.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby utrzymać szybkość enkapsulacji wynoszącą około jednego kodu kreskowego lub komórki na każde 10 kropel. Ogranicza to prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia podwójnej enkapsulacji, które może splątać dane z pojedynczej komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe używane do generowania danych sekwencjonowania pojedynczych komórek.Po opanowaniu tej techniki można ją uruchomić w ciągu ośmiu godzin lub dwóch czterogodzinnych dni.

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Szczegółowe są tutaj protokoły działania i montażu modułowej platformy do badań przesiewowych mikroprzepływowych do systematycznej charakterystyki syntez koloidalnych półprzewodników nanokrystalicznych. Dzięki w pełni regulowanym układom systemów, wysoce wydajne zbieranie widm może być przeprowadzane w 4 skalach czasu reakcji rzędu wielkości w przestrzeni próbkowania kontrolowanej przeniesieniem masy.

Modułowa technologia mikroprzepływowa do systematycznych badań koloidalnych nanokryształów półprzewodnikowych

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę mikroprzepływową do sekwencjonowania genomu pojedynczych komórek zachowującą heterogeniczność genomową. Technika umożliwia analizę dziesiątek tysięcy komórek z wysoką wydajnością.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów