Name: Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj multipleksową analizę obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania w próbkach tkanek nowotworowych. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie mikrośrodowiska guza i interakcji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Donaldowi R. Norwoodowi z Editing Services, Research Medical Library w MD Anderson za edycję tego artykułu oraz laboratorium multipleksu IF i analizy obrazu w Departamencie Translacyjnej Patologii Molekularnej w MD Anderson. Projekt ten był częściowo wspierany przez Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform na Wydziale Translacyjnej Patologii Molekularnej, The University of Texas MD Anderson Cancer Center oraz NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (do MD Anderson Cancer Center CIMAC).

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+Functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment%3A+A+milieu+hindering+and+obstructing+antitumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses.</a> Frontiers in Immunology. 11, 940(2020).</li>
<li>Jin, M. Z., Jin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+updated+landscape+of+tumor+microenvironment+and+drug+repurposing%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166(2020).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+From+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Eng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+multiplex+imaging+optimization+and+reproducible+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis.</a> Communications Biology. 5 (1), 438(2022).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-institutional+TSA-amplified+multiplexed+immunofluorescence+reproducibility+evaluation+%28MITRE%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197(2021).</li>
<li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+%28TIME%29+for+effective+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li>
<li>Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%3A+A+new+era+for+digital+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology.</a> Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).</li>
<li>Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+spatial+profiling+with+CODEX%3A+bioinformatic+analysis+and+application+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease.</a> Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).</li>
<li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+topography+predicts+response+to+PD-1+blockade+in+cutaneous+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma.</a> Nature Communications. 12 (1), 6726(2021).</li>
<li>Jhaveri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+ultrahigh-plex+spatial+phenotyping+of+human+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues.</a> Cancer Research. 82, 3877(2022).</li>
<li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li>
<li>Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6 (8), a026583(2016).</li>
<li>Bruck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+immunoprofiling+of+the+intratumoral+and+peritumoral+tissue+of+renal+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients.</a> Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).</li>
<li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+spatial+immune+profiles+in+human+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers.</a> Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).</li>
<li>Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence+and+multispectral+imaging%3A+forming+the+basis+of+a+clinical+test+platform+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+immune+landscapes+using+an+automated+nine-color+multiplex+immunofluorescence+staining+panel+and+image+analysis+in+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4530(2021).</li>
<li>Elaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dimensional+imaging+mass+cytometry+panel+to+visualize+the+tumor+immune+microenvironment+contexture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture.</a> Frontiers in Immunology. 12, 666233(2021).</li>
<li>Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+comprehension+of+the+tumor+microenvironment+using+mass+spectrometry+imaging+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64015(2022).</li>
<li>Schurch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+cellular+neighborhoods+orchestrate+antitumoral+immunity+at+the+colorectal+cancer+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front.</a> Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).</li>
<li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+phenotyping+of+immunoregulatory+proteins+in+the+tumor+microenvironment+by+CODEX+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging.</a> Frontiers in Immunology. 12, 687673(2021).</li>
<li>Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+accurate+cell+type+identification+in+CODEX+multiplexed+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data.</a> Frontiers in Immunology. 12, 727626(2021).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+and+analyze+the+cellular+spatial+distribution+extracted+from+multiplex+immunofluorescence+data+to+understand+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340(2021).</li>
<li>Tzoras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumor-immune+microenvironment+in+breast+cancer+at+a+spatial+and+multiplex+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution.</a> Cancers. 14 (8), 1999(2022).</li>
<li>Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wistuba%2C+II.+Multiplex+immunofluorescence+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays.</a> Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).</li>
<li>Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+contexture+analysis+in+immuno-oncology%3A+applications+and+challenges+of+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183(2020).</li>
<li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031(2021).</li>
<li>DeRosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+a+new+standard+for+spatial+omics%3A+An+integrated+multiomics+approach%3A+every+single+cell%2C+two+different+analytes%2C+one+unbiased+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).</li>
<li>Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide-conjugated+DNA+barcodes+enable+signal+amplification+for+multiparametric+CODEX+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging.</a> Communications Biology. 5 (1), 627(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

TME odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju, progresji i odpowiedziach na leczenie. Ponadto gęstość specyficznych podzbiorów limfocytów naciekających nowotwór w TME może służyć jako biomarker prognostyczny dla niektórych typów raka. Co ciekawe, oprócz składu komórkowego TME, charakterystyka przestrzenna guza może stanowić zarys dla zrozumienia biologii guza i identyfikacji potencjalnych biomarkerów prognostycznych12,17.
Ponieważ liczne populacje komórek odpornościowych są zaangażowane w odpowiedzi prorakowe lub przeciwnowotworowe, lepsze zrozumienie tych komórek i ich relacji przestrzennych między sobą oraz z komórkami nowotworowymi pomoże w identyfikacji nowych strategii immunoterapeutycznych. Wcześniejsze badania stratyfikowały lokalizację i rozmieszczenie przestrzenne komórek TME na podstawie struktury tkanki w obszarach wewnątrznowotworowych i okołonowotworowych oraz inwazyjnych marginesów komórek nowotworowych18,19. W ciągu ostatnich 15 lat postęp technologiczny sprawił, że analiza fenotypowa pojedynczych komórek na podstawie ich przestrzennego rozproszenia stała się nowym, wpływowym narzędziem do badania TME i kategoryzacji potencjalnych biomarkerów do immunoterapii nowotworów. Histochemia Multiplex IF może jednocześnie oszacować wiele markerów biologicznych20.
Podobnie jak w przypadku strategii przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami, do badania TME wykorzystuje się cztery typy platform multipleksowych opartych na białkach: systemy wykrywania przeciwciał znakowanych chromegenem, fluorescencją, kodami kreskowymi DNA i izotopami metali. Ekonomiczne chromogeniczne platformy IHC umożliwiają wizualizację całego preparatu i ocenę patologiczną przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii jasnego pola. W multipleksowanych IF i IHC stosuje się przeciwciała sprzężone z fluoroforami. Platforma multipleksowa IF/IHC wykrywa przeciwciała o wysokiej swoistości i może określić ilościowo docelowe przeciwciała nawet na poziomie subkomórkowym 6,21. Ponadto, ze względu na charakter chromogenów i fluoroforów, zastosowanie jednego panelu przeciwciał może uchwycić ekspresję do 10 biomarkerów na jednym szkiełku. Na platformach opartych na izotopach metali przeciwciała znakowane metalem są używane do wykonywania obrazowania multipleksowego z rozdzielczością pojedynczą komórkową i przestrzenną oraz wysoką czułością dla poszczególnych odcinków tkanek22. Teoretycznie te metody oparte na przeciwciałach sprzężonych z metalami umożliwiają jednoczesne wykrywanie ponad 100 biomarkerów na jednym wycinku tkanki. Jednym z wyzwań związanych z techniką znakowania izotopowego jest interferencja izobaryczna, która uniemożliwia osiągnięcie 100% czystości wzbogacenia23. Co więcej, interferencja zwiększa się wraz ze wzrostem liczby markerów. Platformy wykrywania przeciwciał sprzężonych z DNA rozpoznają przeciwciała oznaczone unikalnymi kodami kreskowymi DNA. Na tych platformach można jednocześnie rejestrować ponad 40 biomarkerów z wysoką swoistością6.
Obrazowanie multipleksowe to dostępna na rynku platforma wykrywania przeciwciał znakowanych kodem kreskowym DNA do nakładania przeciwciał sprzężonych z DNA na pojedynczy szkiełko tkankowe w jednym kroku (ryc. 8). Na etapie przygotowania tkanki, w przeciwieństwie do platformy obrazowania multipleksowanej wiązką jonów, która wymaga użycia szkiełek pokrytych złotem uzyskanych od producentów, platforma obrazowania multipleksowanego wymaga jedynie zwykłych szkiełek nakrywkowych lub szkiełek pokrytych 0,1% poli-L-lizyną, aby pomóc tkance przylegać do niej i utrzymać tkankę w stanie nienaruszonym podczas procesu barwienia i obrazowania. Zaleca się stosowanie skrawków tkanek na szkiełkach nakrywkowych w ciągu 4 tygodni po sekcji, ponieważ długotrwałe przechowywanie niebarwionych preparatów powoduje zmniejszenie antygenowości. Barwioną próbkę szkiełka nakrywkowego można przechowywać w buforze do przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni bez utraty sygnału barwienia. Do przechowywania próbek szkiełek nakrywkowych nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt. System obrazowania multipleksowego został zmodernizowany tak, aby zamiast szkiełek nakrywkowych używał zwykłych szkiełek, co umożliwia barwienie większych tkanek i łatwą obsługę. W przypadku stosowania roztworu redukującego do koniugacji przeciwciał (krok 3.2.3), reakcja powinna być ograniczona do nie więcej niż 30 minut, aby zapobiec uszkodzeniu przeciwciał. blokujące w kroku 5.6.6 powinny być świeżo przygotowane, a blokujące nie mogą być ponownie używane.
W porównaniu z platformami wykrywania przeciwciał multipleksowych znakowanymi chromogenem, fluorescencją i izotopami metali, technologia obrazowania multipleksowego ma pewne zalety. Na przykład na rynku dostępnych jest ponad 60 wstępnie zaprojektowanych paneli przeciwciał do obrazowania multipleksowego, co pomaga zaoszczędzić czas i koszty związane z koniugacją i walidacją przeciwciał, a liczba wstępnie zaprojektowanych paneli przeciwciał rośnie. Przeciwciała te, które obejmują marker raka pan-cytokeratynę, marker czerniaka SOX10, marker naczyniowy CD31, marker zrębowy SMA i liczne markery komórek odpornościowych, są zwalidowane i gotowe do eksperymentu. W przypadku przeciwciał, które nie są wstępnie zaprojektowane, dostępny na rynku zestaw do koniugacji przeznaczony do użytku z obrazowaniem multipleksowym jest prosty i przyjazny dla użytkownika. Przeciwciała sprzężone z klientem są dobre przez 1 rok, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Ponadto do wykonania zdjęć nie jest wymagana rozgrzewka maszyny. W tej technologii obrazowania multipleksowego iteracyjne etapy mycia, hybrydyzacji i usuwania w akwizycji obrazu rzadko skutkują zmniejszeniem intensywności markera lub degradacją morfologii tkanek 5,24,25. Co więcej, obrazy kompozytowe są rejestrowane w formacie QPTIFF za pomocą prostego trójkolorowego mikroskopu fluorescencyjnego i mogą być przesyłane i analizowane za pomocą oprogramowania do analizy cyfrowej innych firm. Markery barwienia można wizualizować w rozdzielczości pojedynczej komórki, a fenotypy komórek można scharakteryzować poprzez kolokalizację markerów (ryc. 6 i ryc. 7). Kompleksowa analiza obrazu multipleksowego ujawnia ponadto przedziały tkankowe, kwantyfikację markerów jednokomórkowych oraz dane dotyczące najbliższego sąsiedztwa i bliskości (ryc. 8).
Wyzwaniem w multipleksowej analizie obrazu jest identyfikacja typu komórki. Zazwyczaj, gdy do obrazu stosuje się więcej klasyfikatorów pojedynczych obiektów, adnotacje do nich dodawane są rzadziej spotykane fenotypy. Dlatego zaleca się stosowanie znanych markerów, które nie ulegają koekspresji w tym samym klasyfikatorze i stosowanie tylko klasyfikatora związanego z fenotypem do adnotacji pojedynczych komórek. Różnice w adnotacji typu komórki spowodują zasadniczo różne wyniki przestrzenne, takie jak różnice w rozmieszczeniu przestrzennym komórek i analizie sąsiedztwa komórkowego26,27.
Wielopoziomowa analiza obrazu okazała się skuteczna w barwieniu i obrazowaniu wielu typów próbek, w tym tkanki FFPE, świeżo zamrożonej tkanki, zarchiwizowanych całych preparatów i mikromacierzy tkankowych. Multipleksowane obrazy piersi, mózgu, płuc, śledziony, nerek, węzłów chłonnych i skrawków tkanki skórnej można uzyskać za pomocą głębokich danych fenotypowania przestrzennego pojedynczych komórek 5,16,25,28.
Oczekuje się, że w przyszłości pojawi się więcej wstępnie zaprojektowanych przeciwciał do obrazowania multipleksowego. Ponadto bardzo potrzebne jest opracowanie specjalnego oprogramowania do multipleksowej analizy obrazu. Obecnie istnieje wiele dostępnych na rynku i otwartych programów do analizy obrazu Hi-Plex29, ale naukowcy nadal potrzebują pomocy w stworzeniu standardowego przepływu pracy dla tych analiz30,31. Chociaż obrazy kompozytowe przechwycone za pomocą tego protokołu są kompatybilne z oprogramowaniem innych firm, może to spowodować dodatkowe koszty dla użytkownika. Kolejną wadą technologii obrazowania multipleksowego jest redukcja sygnału w wykrywaniu białek jądrowych po iteracyjnym myciu, hybrydyzacji i zdzieraniu za pomocą dużych paneli przeciwciał. Na szczęście można to zminimalizować, pobierając fluorofory z kodami kreskowymi we wczesnych cyklach podczas projektowania płytek reporterskich. Niedawno platforma ta została zmodernizowana o nowy system szybkiego skanowania, który znacznie skrócił czas uzyskiwania obrazów kompozytowych32. Ponadto doniesiono, że nowa strategia wykorzystująca kody kreskowe sprzężone z tyramidem usprawnia obrazowanie oparte na kodowaniu kreskowym przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami. Technologia ta ma na celu wzmocnienie sygnałów barwienia, dla których trudno jest uzyskać przeciwciała sprzężone z kodem kreskowym33.

Mikrośrodowisko guza (TME) jest niezwykle niejednorodne, składa się z komórek nowotworowych, komórek zrębu nowotworowego, komórek odpornościowych, niekomórkowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz licznych licznych cząsteczek wytwarzanych i uwalnianych przez komórki nowotworowe, zrębowe i odpornościowe1,2. Coraz więcej dowodów wskazuje, że TME odgrywa kluczową rolę w przeprogramowywaniu różnicowania guza, wzrostu, inwazji, przerzutów i odpowiedzi na terapie3.
Zrozumienie, w jaki sposób różne typy komórek w TME oddziałują na siebie i komunikują się ze sobą za pomocą sieci sygnalizacyjnych, jest niezbędne do poprawy diagnostyki raka, optymalizacji immunoterapii i opracowania nowych metod leczenia4. Tradycyjne techniki mikroskopii tkankowej, w tym immunohistochemia (IHC) i immunofluorescencja (IF), są stosowane od dziesięcioleci do badania typów komórek, obfitości i komunikacji w próbkach guza. Niestety, techniki te zazwyczaj mogą ocenić tylko jeden lub dwa markery białkowe w sekcji tkanki i nie mogą ujawnić złożonych relacji przestrzennych i strukturalnych między tymi komórkami5,8,7.
W ciągu ostatnich dwóch dekad powstało kilka technologii obrazowania multipleksowego8. Technologie te zapewniają znacznie lepszy wgląd w skład, funkcję i lokalizację komórek odpornościowych w TME, prowadząc do szybkiego postępu w zakresie zdolności do identyfikacji i przestrzennego profilowania złożonych TME na poziomie pojedynczej komórki9,10. Relacje przestrzenne i strukturalne różnych komórek nowotworowych i odpornościowych w TME są obecnie w czołówce badań biologicznych i klinicznych z wykorzystaniem tych technologii obrazowania multipleksowego11,12.
Niedawno opracowana technologia obrazowania multipleksowego, wykorzystująca kodowanie kreskowe przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami, jest wpływową platformą badań biologicznych pojedynczych komórek, opartą na wykrywaniu przeciwciał skoniugowanych oligonukleotydami w próbkach FFPE (utrwalonych w formalinie), zatopionych w parafinie13,14. Obecnie ta technologia obrazowania multipleksowego pozwala na jednoczesne obrazowanie ponad 100 markerów w jednym przekroju tkanki15, co zwiększyło liczbę typów komórek, które można rozróżnić in situ. Umożliwia to poziom analizy przestrzennej guza i komórek odpornościowych, który nie jest możliwy przy użyciu tradycyjnych metod immunofenotypowania16.
Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół koniugacji oczyszczonych przeciwciał do oligonukleotydów i walidacji tej koniugacji za pomocą multipleksowanej platformy obrazowania i wielocyklowej procedury obrazowania z tkanką FFPE. Ponadto opisujemy podstawowe procedury przetwarzania obrazu i analizy danych stosowane w tej technologii.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor AR9</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900250ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor</td><td>Akoya Biosciences</td><td>7000001</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1X Rozcieńczalnik/Blok przeciwciał</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1001EA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do koniugacji przeciwciał</td><td>Akoya Biosciences</td><td>7000009</td><td>Zawiera roztwór blokujący filtr, roztwór redukujący przeciwciała 1, roztwór redukujący przeciwciała 2, roztwór sprzęgający, roztwór oczyszczający, roztwór do przechowywania przeciwciał</td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania</td><td>Akoya Biosciences</td><td>7000002</td><td></td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718-25ML</td><td></td></tr><tr>Alkohol<td>wysokotlenowy</td><td>Avantor/VWR</td><td>BDH1115-4LP</td><td></td></tr>, <tr><td>200 proof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G Blocker V2</td><td>Akoya Biosciences</td><td>240199</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-329-50</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Integral 10&nbsp;</td><td>Milipore&nbsp;</td><td></td><td></td>ZRXQ010WW</tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Niknon</td><td>Keyence Corp. of America</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Plama jądrowa</td><td>Akoya Biosciences</td><td>7000003</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Kombinacja kodów kreskowych/reporterów PhenoCycler</td><td>Akoya Biosciences</td><td>5450004 (BX025/RX025)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5450003 (BX022/RX022)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5450023 (BX002/RX002)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp; 5250002 (BX020/RX020)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>2520003 (BX023/RX023)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250005 (BX029/RX029)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250007 (BX035/RX035)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250012 (BX052/RX052)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550012 (BX030/RX030)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550015 (BX042/RX042)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550014 (BX036/RX036)</td><td></td></tr><tr><td>QuPath</td><td>Open-Source</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>Staining Set</td> <td>(Akoya Biosciences</td><td>7000008</td><td>zawiera bufor hydracyjny, bloker N, bloker J, bloker S, odczynnik utrwalający, bufor do przechowywania</td></tr></tbody></table>

multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Technologia obrazowania multipleksowanego wykorzystująca kodowanie kreskowe przeciwciał z oligonukleotydami, która sekwencyjnie wykrywa wiele epitopów w tym samym fragmencie tkanki, jest skuteczną metodologią oceny guza, która poprawia zrozumienie mikrośrodowiska guza. Wizualizację ekspresji białek w tkankach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie uzyskuje się, gdy określony fluorofor jest wyżarzany do kodu kreskowego związanego z przeciwciałem za pomocą komplementarnych oligonukleotydów, a następnie przeprowadza się obrazowanie próbki; Rzeczywiście, metoda ta pozwala na użycie konfigurowalnych paneli ponad 40 przeciwciał w jednej reakcji barwienia tkanek. Metoda ta jest kompatybilna ze świeżo zamrożonymi tkankami, tkankami utrwalonymi w formalinie, tkankami zatopionymi w parafinie, hodowanymi komórkami i komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, co oznacza, że naukowcy mogą wykorzystać tę technologię do oglądania różnych typów próbek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ta metoda rozpoczyna się od ręcznego protokołu barwienia i utrwalania, a wszystkie kody kreskowe przeciwciał są nakładane za pomocą koktajlu przeciwciał. Przyrząd do barwienia fluidyki jest w pełni zautomatyzowany i wykonuje iteracyjne cykle znakowania, obrazowania i usuwania spektralnie odrębnych fluoroforów, aż wszystkie biomarkery zostaną zobrazowane za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Obrazy są następnie zbierane i kompilowane we wszystkich cyklach obrazowania, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki dla wszystkich markerów. Jednoetapowe barwienie i delikatne usuwanie fluoroforów nie tylko pozwala na wysoce multipleksowaną analizę biomarkerów, ale także zachowuje próbkę do dodatkowej dalszej analizy, jeśli jest to pożądane (np. barwienie hematoksyliną i eozyną). Ponadto oprogramowanie do analizy obrazu umożliwia przetwarzanie obrazu - kompensację dryfu obrazu, odejmowanie tła, segmentację komórek i grupowanie - a także wizualizację i analizę obrazów i fenotypów komórek w celu generowania przestrzennych map sieci. Podsumowując, technologia ta wykorzystuje skomputeryzowany system mikroprzepływowy i mikroskop fluorescencyjny do iteracyjnej hybrydyzacji, obrazowania i usuwania znakowanych fluorescencyjnie sond DNA, które są komplementarne do związanych tkankowo, sprzężonych z oligonukleotydami przeciwciał.

Wykorzystaliśmy próbki migdałków utrwalone w FFPE do opracowania 26-markerowego panelu immunoonkologicznego w celu zilustrowania statusu immunologicznego tkanki FFPE przy użyciu systemu analizy obrazów z kodowaniem kreskowym. Łącznie 19 przeciwciał jest obecnie stosowanych w innych badaniach obrazowania multipleksowego w naszym laboratorium. Wszystkie markery zostały przetestowane na tkance FFPE z użyciem chromogenicznej IHC. Wszystkie przeciwciała zostały sprzężone z unikalnymi oligonukleotydami DNA. Podczas konfigurowania szkiełek przy użyciu internetowego menedżera instrumentów (Rycina 4) dla tej technologii analizy obrazów z kodowaniem kreskowym należy zauważyć, że pierwszy i ostatni cykl są zawsze „puste” (Rycina 2 i Rycina 4), co dostarcza sygnałów fluorescencji tła, które są odejmowane od specyficznych sygnałów przeciwciał. Po zebraniu obrazów w formacie QPTIFF za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego można je wizualizować przy użyciu kilku opatentowanych programów automatycznej analizy obrazu lub programów open-source. Obrazy kompozytowe mogą przedstawiać wszystkie markery lub wybrane markery dla lepszego wglądu w sygnały (Rycina 5). Ponadto każde przeciwciało może zostać poddane ocenie wizualnej pod kątem lokalizacji jądrowej, cytoplazmatycznej lub błonowej. Komórki immunologiczne, nowotworowe i zrębowe mogą być łatwo zidentyfikowane. Następnie analiza obrazu może dostarczyć informacji o intensywności sygnału, zakresie dynamicznym i rozmieszczeniu przestrzennym wszystkich markerów (Rycina 6). Technika ta pozwoliła nam przeanalizować wszystkie 26 markerów na poziomie subkomórkowym w jednym przekroju tkanki (Rycina 7). Poprzez analizę ko-lokalizacji markerów mogliśmy zidentyfikować fenotypy komórkowe, zlokalizować przestrzenną pozycję komórek, obliczyć odległość między komórkami i ustalić rozkład komórek. Kluczowym wpływem tej technologii jest przedstawienie solidnego 26-markerowego panelu skoncentrowanego na statusie immunologicznym mikrośrodowiska tkankowego.
<img alt="Żel SDS-PAGE przeciwciał; wizualizacja rozdziału białek; analiza wyników elektroforezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Obraz walidacji przeciwciała sprzężonego według specyfikacji z wykorzystaniem żelu białkowego Bis-Tris. Ścieżka 1 żelu przedstawia standard białkowy. Ścieżki 2 i 4 przedstawiają przeciwciała sprzężone z kodem kreskowym (strzałki). Ścieżki 3 i 5 przedstawiają prążki łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała niesprzężonego (groty strzałek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przygotowania do chromatografii; w dołkach znajdują się rozpuszczalniki oznaczone jako HB, B, PSFS, PBS, MeOH, S." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mapa konfiguracji płytki do barwienia dla dwóch próbek na szkiełkach nakrywkowych. Skróty: HB = bufor nawadniający; B = rozcieńczalnik przeciwciał/bloker; PSFS = roztwór utrwalający po barwieniu; PBS = bufor fosforanowy; MeOH = metanol; S = roztwór do przechowywania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ płytki 96-dołkowej, schemat rozkładu próbek, opisany dla analizy barwienia komórek, marker DAPI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Konfiguracja płytki reporterowej. Każdy sprzężony przeciwciało posiada kod kreskowy komplementarny do konkretnego reportera. Aby przygotować płytkę reporterową, należy wymienić wszystkie sprzężone przeciwciała oraz odpowiadające im reportery. Następnie każdemu przeciwciału przypisuje się numer cyklu. Przeprowadzenie dwóch cykli pustych (C1 i C18) służy do oceny poziomu autofluorescencji w trzech kanałach fluorescencyjnych oraz do odjęcia tła po obrazowaniu za pomocą oprogramowania sterującego akwizycją obrazów. Na tym etapie kreator oprogramowania sprawdzi instrument, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia są poprawne (Rysunek 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania do zarządzania eksperymentem; konfiguracja panelu fluorescencji; dane cyklu próbek do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pozyskiwanie obrazów przy użyciu oprogramowania sterującego dla konfiguracji eksperymentu. (A) Wybierz zakładkę Experiment w lewym dolnym rogu oprogramowania sterującego, aby przygotować i rozpocząć konfigurację. (B,C) Wybierz New Template, aby wprowadzić ustawienia eksperymentalne z nową nazwą projektu i eksperymentu. (D) Zmień studzienkę cyklu początkowego oraz liczbę cykli, aby odzwierciedlić lokalizację reportera w 96-dołkowej płytce reporterowej. (E) Przypisz odpowiednie kanały fluorescencyjne do czterech kanałów wyznaczonych dla przebiegu eksperymentalnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza obrazów mikroskopowych, interfejs narzędzia programowego, samouczek regulacji jasności, wizualizacja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Wizualizacja obrazów przy użyciu oprogramowania internetowego (QuPath). Okno podglądu pokazuje 26 markerów w barwionym przekroju FFPE tkanki migdałka. Jasność &amp; Kontrast okno wyświetla markery z zaznaczeniami. Na koniec w oknie podglądu wyświetla się próbka FFPE z wybranymi markerami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii panelu markerów odpornościowych wykazujące ekspresję białek w analizie tkanki nowotworowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wizualizacja obrazów przy użyciu oprogramowania internetowego. (A) Przekroje tkanki migdałka barwiono pod kątem 26 markerów, a obrazy przekrojów w formacie QPTIFF wizualizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania do przeglądania preparatów cyfrowych lub oprogramowania open-source (QuPath) w celu adnotacji i analizy. (B-F) Sześć markerów wyświetlono w tej samej adnotacji, aby lepiej zobrazować sygnały. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja tkanek, analiza markerów białkowych, obraz mikroskopowy do identyfikacji komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Widoki 26 poszczególnych markerów analizowanych za pomocą oprogramowania internetowego. Ekspresja markerów w tkance migdałka ukazana jest poprzez barwienie immunofluorescencyjne z wykorzystaniem panelu immunoonkologicznego (lewa góra). Pokazano poszczególne markery w dwóch niewielkich obszarach (czerwone prostokąty). Powiększona wstawka przedstawia komórki wykazujące pozytywną reakcję na te markery (białe strzałki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig07large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Koniugacja przeciwciał, barwienie tkanek, schemat reakcji iteracyjnych; fenotypowanie; mapa ciepła, analiza korelacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Podsumowanie procesu akwizycji obrazów multipleksowych. Przekroje tkanek FFPE zostały zabarwione z użyciem panelu 26 przeciwciał, a następnie poddane reakcji wielocyklicznej. Surowe obrazy zabarwionych przekrojów zostały przetworzone obliczeniowo, a następnie na podstawie obrazów kompozytowych przeprowadzono analizę gęstości komórek i analizę przestrzenną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Walidacja IHC w tkance migdałka. Przekroje tkanek FFPE zostały wybarwione przy użyciu pojedynczego przeciwciała. Ekspresja markera w tkance migdałka jest pokazana przy małym powiększeniu, a powiększony wkład pokazuje komórki wykazujące pozytywną reakcję na marker (czerwone prostokąty). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/Suppl%20Figure.psd" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Duża ilość informacji biologicznej uzyskanej z analizy obrazu z multipleksowym kodowaniem kreskowym pozwala naukowcom lepiej zrozumieć mikrośrodowisko guza i jego specjalną dystrybucję w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej metody jest to, że daje nam ona znacznie bardziej szczegółowe informacje z tej samej próbki tkanki z możliwością wykonania głębszego fenotypowania pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwiła konfigurowalne panele do badania mikrośrodowiska guza, aby potencjalnie odkryć biomarker predykcyjny w tkance nowotworowej do wykorzystania jako nowe leczenie celowe.Aby rozpocząć barwienie przeciwciałami sprzężonymi z oligonukleotydami, namocz szkiełka nakrywkowe w 0,1% roztworze poli-L-lizyny na 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby przygotować je do umieszczenia tkanki i przylegania. Po odsączeniu roztworu poli-L-lizyny myj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą przez 30 sekund. Po umyciu usuń szkiełka nakrywkowe z ultraczystej wody i umieść je na niestrzępiącym się ręczniku do wyschnięcia przez noc.Umieść odcinki tkanki o grubości 5 mikronów na środku szkiełka nakrywkowego naładowanego poli-L-lizyną i pozostaw do wyschnięcia na noc. Rozgrzej uchwyt na szkiełko nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające skrawki chusteczki w podgrzanym uchwycie.Po pieczeniu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut sprawdź, czy parafina rozpuściła się z tkanki. Szybko umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego zawierającego próbkę sekwencyjnie, w szeregu roztworów. Na koniec umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego w ultraczystej wodzie uzdatnionej przez DEPC na dwie rundy po pięć minut każda.Przygotuj komorę wilgotnościową, umieszczając nasączony wodą ręcznik papierowy na dnie pustego pudełka na końcówki do pipet. Napełnij szybkowar wodą, wystarczającą do pokrycia połowy wysokości 50-mililitrowej zlewki. Umieść 5 mililitrów metanolu na próbkę w zlewce o temperaturze 4 stopni Celsjusza.Rozcieńczyć wymaganą objętość buforu AR9 do 1X pirowęglanem dietylu lub ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC. Następnie napełnij szklaną zlewkę o pojemności 50 mililitrów około 40 mililitrami rozcieńczonego buforu AR9. Zanurzyć próbkę w uchwycie szkiełka nakrywkowego w zlewce i całkowicie przykryć zlewkę folią aluminiową.Umieść zlewkę pokrytą folią aluminiową w szybkowarze wypełnionym wodą i gotuj w temperaturze około 15 PSI przez 20 minut. Następnie wyjmij zlewkę i ostrożnie odwiń folię aluminiową. Pozostawić zlewkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.Wyjmij uchwyt szkiełka nakrywkowego z bufora 1X AR9. Inkubować go dwukrotnie w ultraczystej wodzie uzdatnionej DEPC przez dwie minuty. W międzyczasie pobierz bufor hydratacyjny, rozcieńczalnik przeciwciał i roztwory blokujące N, G, J i S z zestawu do barwienia multipleksowanego obrazowania.Umieść próbkę szkiełka nakrywkowego w 5 mililitrach buforu hydratacyjnego dwukrotnie, po dwie minuty każdy. Następnie umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w 5 mililitrach bloku rozcieńczalnika przeciwciał do obrazowania multipleksowego i inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przygotuj koktajl przeciwciał.Po inkubacji umieścić szkiełko nakrywkowe w przygotowanej wcześniej komorze wilgotnościowej. Pobrać pipetę 190 mikrolitrów koktajlu przeciwciał na próbkę szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie umyj próbkę dwukrotnie, każdy 5 mililitrami bloku rozcieńczalnika przeciwciał do obrazowania multipleksowego przez dwie minuty.Aby przymocować związane przeciwciała do tkanki, inkubować szkiełka nakrywkowe przez 10 minut w 16% formaldehydzie rozcieńczonym do 1,6% roztworem do przechowywania i przemyć je trzykrotnie PBS. Po inkubacji szkiełek nakrywkowych przez pięć minut w metanolu, wstępnie schłodzić do 4 stopni Celsjusza. Po umyciu należy ponownie inkubować szkiełka nakrywkowe przez 20 minut w 5 mililitrach odczynnika utrwalającego rozcieńczonego PBS i przemyć je trzykrotnie PBS przed przechowywaniem.Przygotuj wzorcową mieszankę reporterową zgodnie ze składem podanym w tekście. Wypełnić studzienkę na 96-dołkowej płytce 245 mikrolitrami roztworu zawierającego wzorcową mieszaninę reporterową i specyficzne fluorofory z kodami kreskowymi dla tego cyklu doświadczalnego. Rysunek przedstawia konfigurację płytki reporterowej zastosowaną tutaj dla panelu rakowego.Aby chronić fluorofory z kodami kreskowymi, przyklej foliową osłonę płytki na 96-dołkową płytkę reporterową i umieść płytkę w multipleksowanym przyrządzie do obrazowania. Skalibruj ostrość obrazowania za pomocą kanału DAPI, umieszczając szkiełko nakrywkowe próbki na stoliku mikroskopu i ręcznie pipetując 700 mikrolitrów roztworu barwienia jądrowego w stosunku 1:1500 na tkankę. Aby przygotować przyrząd do obrazowania multipleksowego, należy rozcieńczyć 10-krotnie bufor do obrazowania multipleksowanego do 1X za pomocą ultraczystej wody uzdatnionej DEPC i napełnić butelki z odczynnikami odpowiednimi roztworami lub rozpuszczalnikami.Ustaw wszystkie parametry mikroskopu i wybierz obszary zainteresowania na szkiełku okładkowym próbki, które mają zostać zobrazowane. Wprowadź projekt eksperymentalny do oprogramowania do zarządzania instrumentami. Kliknij przycisk Eksperyment w oprogramowaniu sterującym, a następnie w oknie Konfiguracja i zarządzanie eksperymentem kliknij przycisk Nowy szablon.Wpisz nazwę projektu w polu obok przycisku Projekt i wprowadź łączną liczbę cykli. Kliknij przycisk Przypisanie kanału, wpisz informacje dla każdego cyklu w kolumnach, takie jak prawidłowy cykl, numery studni, miejsca stosu Z, nazwa znacznika, klasa i czas ekspozycji dla każdego cyklu. Następnie rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment i zapisz eksperyment.Kliknij ikonę QuPath na komputerze i otwórz oprogramowanie. Przeciągnij plik qptiff do okna przeglądarki. Kliknij przycisk jasności i kontrastu, aby otworzyć okno Kontrast jasności.Zaznacz lub usuń zaznaczenie znacznika w wybranej kolumnie, aby wyświetlić lub ukryć sygnał znacznika. Kliknij przycisk powiększ, aby dopasować, aby powiększyć lub pomniejszyć obszar zainteresowania. Podczas przeglądania za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, obrazy złożone pokazywały wszystkie znaczniki lub wybrane znaczniki zgodnie z potrzebami.Ujawniono natężenie sygnału, zakres dynamiki i rozkład przestrzenny wszystkich markerów. Technika ta pozwoliła na analizę wszystkich 26 markerów na poziomie subkomórkowym w jednym wycinku tkanki. Podążając za procesem analizy obrazu multipleksowego, za pomocą podejść informatycznych można przetwarzać i analizować wielowymiarowe dane z pojedynczych komórek, aby wywnioskować wgląd biologiczny i kliniczny.Multipleksowa analiza obrazu z kodami kreskowymi to potężna metodologia, która umożliwia naukowcom profilowanie tkanki nowotworowej i odpowiadanie na pytania badawcze zgodnie z markerami w panelach.

multiplexed-barcoding-image-analysis-for-immunoprofiling-spatial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj multipleksową analizę obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania w próbkach tkanek nowotworowych. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie mikrośrodowiska guza i interakcji komórkowych.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych (Wideo) | JoVE Journal

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Przeglądaj więcej filmów