Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Duża ilość informacji biologicznej uzyskanej z analizy obrazu z multipleksowym kodowaniem kreskowym pozwala naukowcom lepiej zrozumieć mikrośrodowisko guza i jego specjalną dystrybucję w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej metody jest to, że daje nam ona znacznie bardziej szczegółowe informacje z tej samej próbki tkanki z możliwością wykonania głębszego fenotypowania pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwiła konfigurowalne panele do badania mikrośrodowiska guza, aby potencjalnie odkryć biomarker predykcyjny w tkance nowotworowej do wykorzystania jako nowe leczenie celowe.

Aby rozpocząć barwienie przeciwciałami sprzężonymi z oligonukleotydami, namocz szkiełka nakrywkowe w 0,1% roztworze poli-L-lizyny na 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby przygotować je do umieszczenia tkanki i przylegania. Po odsączeniu roztworu poli-L-lizyny myj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą przez 30 sekund. Po umyciu usuń szkiełka nakrywkowe z ultraczystej wody i umieść je na niestrzępiącym się ręczniku do wyschnięcia przez noc.

Umieść odcinki tkanki o grubości 5 mikronów na środku szkiełka nakrywkowego naładowanego poli-L-lizyną i pozostaw do wyschnięcia na noc. Rozgrzej uchwyt na szkiełko nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające skrawki chusteczki w podgrzanym uchwycie.

Po pieczeniu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut sprawdź, czy parafina rozpuściła się z tkanki. Szybko umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego zawierającego próbkę sekwencyjnie, w szeregu roztworów. Na koniec umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego w ultraczystej wodzie uzdatnionej przez DEPC na dwie rundy po pięć minut każda.

Przygotuj komorę wilgotnościową, umieszczając nasączony wodą ręcznik papierowy na dnie pustego pudełka na końcówki do pipet. Napełnij szybkowar wodą, wystarczającą do pokrycia połowy wysokości 50-mililitrowej zlewki. Umieść 5 mililitrów metanolu na próbkę w zlewce o temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć wymaganą objętość buforu AR9 do 1X pirowęglanem dietylu lub ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC. Następnie napełnij szklaną zlewkę o pojemności 50 mililitrów około 40 mililitrami rozcieńczonego buforu AR9. Zanurzyć próbkę w uchwycie szkiełka nakrywkowego w zlewce i całkowicie przykryć zlewkę folią aluminiową.

Umieść zlewkę pokrytą folią aluminiową w szybkowarze wypełnionym wodą i gotuj w temperaturze około 15 PSI przez 20 minut. Następnie wyjmij zlewkę i ostrożnie odwiń folię aluminiową. Pozostawić zlewkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.

Wyjmij uchwyt szkiełka nakrywkowego z bufora 1X AR9. Inkubować go dwukrotnie w ultraczystej wodzie uzdatnionej DEPC przez dwie minuty. W międzyczasie pobierz bufor hydratacyjny, rozcieńczalnik przeciwciał i roztwory blokujące N, G, J i S z zestawu do barwienia multipleksowanego obrazowania.

Umieść próbkę szkiełka nakrywkowego w 5 mililitrach buforu hydratacyjnego dwukrotnie, po dwie minuty każdy. Następnie umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w 5 mililitrach bloku rozcieńczalnika przeciwciał do obrazowania multipleksowego i inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przygotuj koktajl przeciwciał.

Po inkubacji umieścić szkiełko nakrywkowe w przygotowanej wcześniej komorze wilgotnościowej. Pobrać pipetę 190 mikrolitrów koktajlu przeciwciał na próbkę szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie umyj próbkę dwukrotnie, każdy 5 mililitrami bloku rozcieńczalnika przeciwciał do obrazowania multipleksowego przez dwie minuty.

Aby przymocować związane przeciwciała do tkanki, inkubować szkiełka nakrywkowe przez 10 minut w 16% formaldehydzie rozcieńczonym do 1,6% roztworem do przechowywania i przemyć je trzykrotnie PBS. Po inkubacji szkiełek nakrywkowych przez pięć minut w metanolu, wstępnie schłodzić do 4 stopni Celsjusza. Po umyciu należy ponownie inkubować szkiełka nakrywkowe przez 20 minut w 5 mililitrach odczynnika utrwalającego rozcieńczonego PBS i przemyć je trzykrotnie PBS przed przechowywaniem.

Przygotuj wzorcową mieszankę reporterową zgodnie ze składem podanym w tekście. Wypełnić studzienkę na 96-dołkowej płytce 245 mikrolitrami roztworu zawierającego wzorcową mieszaninę reporterową i specyficzne fluorofory z kodami kreskowymi dla tego cyklu doświadczalnego. Rysunek przedstawia konfigurację płytki reporterowej zastosowaną tutaj dla panelu rakowego.

Aby chronić fluorofory z kodami kreskowymi, przyklej foliową osłonę płytki na 96-dołkową płytkę reporterową i umieść płytkę w multipleksowanym przyrządzie do obrazowania. Skalibruj ostrość obrazowania za pomocą kanału DAPI, umieszczając szkiełko nakrywkowe próbki na stoliku mikroskopu i ręcznie pipetując 700 mikrolitrów roztworu barwienia jądrowego w stosunku 1:1500 na tkankę. Aby przygotować przyrząd do obrazowania multipleksowego, należy rozcieńczyć 10-krotnie bufor do obrazowania multipleksowanego do 1X za pomocą ultraczystej wody uzdatnionej DEPC i napełnić butelki z odczynnikami odpowiednimi roztworami lub rozpuszczalnikami.

Ustaw wszystkie parametry mikroskopu i wybierz obszary zainteresowania na szkiełku okładkowym próbki, które mają zostać zobrazowane. Wprowadź projekt eksperymentalny do oprogramowania do zarządzania instrumentami. Kliknij przycisk Eksperyment w oprogramowaniu sterującym, a następnie w oknie Konfiguracja i zarządzanie eksperymentem kliknij przycisk Nowy szablon.

Wpisz nazwę projektu w polu obok przycisku Projekt i wprowadź łączną liczbę cykli. Kliknij przycisk Przypisanie kanału, wpisz informacje dla każdego cyklu w kolumnach, takie jak prawidłowy cykl, numery studni, miejsca stosu Z, nazwa znacznika, klasa i czas ekspozycji dla każdego cyklu. Następnie rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment i zapisz eksperyment.

Kliknij ikonę QuPath na komputerze i otwórz oprogramowanie. Przeciągnij plik qptiff do okna przeglądarki. Kliknij przycisk jasności i kontrastu, aby otworzyć okno Kontrast jasności.

Zaznacz lub usuń zaznaczenie znacznika w wybranej kolumnie, aby wyświetlić lub ukryć sygnał znacznika. Kliknij przycisk powiększ, aby dopasować, aby powiększyć lub pomniejszyć obszar zainteresowania. Podczas przeglądania za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, obrazy złożone pokazywały wszystkie znaczniki lub wybrane znaczniki zgodnie z potrzebami.

Ujawniono natężenie sygnału, zakres dynamiki i rozkład przestrzenny wszystkich markerów. Technika ta pozwoliła na analizę wszystkich 26 markerów na poziomie subkomórkowym w jednym wycinku tkanki. Podążając za procesem analizy obrazu multipleksowego, za pomocą podejść informatycznych można przetwarzać i analizować wielowymiarowe dane z pojedynczych komórek, aby wywnioskować wgląd biologiczny i kliniczny.

Multipleksowa analiza obrazu z kodami kreskowymi to potężna metodologia, która umożliwia naukowcom profilowanie tkanki nowotworowej i odpowiadanie na pytania badawcze zgodnie z markerami w panelach.